Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

이 작품은 건강의 미국 국립 연구소에 의해 지원됩니다 (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. 웰치 재단 (E-1721)의 지원을 인정합니다.

1. 리보솜 단지의 준비
<ol><li>20 mM 트라이-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc) 2, 30 mMNH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-mercaptoethanol), 및 0.05 % Tween20으로 구성된 TAM10 버퍼의 1,000 mL을 확인하십시오.</li>
	<li>표1에 열거된 5가지 혼합물을 준비한다. 참고 : 리보솜은 MRE600 균주11에서했다. EF-Tu: 연동성 열 불안정. EF-Ts: 연신계 열 안정. GTP: 구노신 삼인산염. PEP: 포스포(에놀...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

우리의 이중 통치자 분석에서, 자기 구슬은 두 가지 중요한 역할을한다. 첫째, 원심력이 부력 질량에 비례하기 때문에 힘 변환기 역할을합니다. 둘째, 비드는 현재 가장 정확한 자기 센서인 원자 자력계에 의해 감지되는 신호 캐리어입니다. 기계적 조작과 자기 검출을 결합한 FIRMS 기술은 DNA 통치자의 기초가 되는 중요한 해리력을 기반으로 많은 분자 상호 작용을 해결할 수 있습니다. 이중 눈자 분...

생체 분자 변위는 관련 생물학적 기능의 메커니즘을 연구하는 근본적인 매개 변수입니다. 한 가지 특별한 예는 리보솜 전좌1,2,리보솜이 메신저 RNA(mRNA)에 대해 정확히 3개의 뉴클레오티드(nt)에 의해 정상적으로 이동하는 동안, 그리고 3개를 제외한 1, 2, 또는 다른 수의 nt가 프레임 변속. 따라서, 분자 눈금자 시스템 단일-nt 해상도는 상이한 단계 크기를 구별하는 데 필요하다. 더 큰 과제는 입구와 출구 양쪽 모두에서 리보솜 움직임을 조사하는 것입니다. 즉, 이중 눈금자 시스템으로만 mRNA가 리보솜을 통해 원활하게 스레드되는지, 또는 양측이 서로 다른 단계 크기를 가지는 중간 단계가 있는지 여부를 밝힐 수 있을 것입니다. 리보솜.
리보솜의 출구 측에 있는 다른 단계를 해결하는 첫번째 도전을 해결하기 위하여 몇몇 방법 (mRNA의 3' 끝)를 해결하기 위하여 개발되었습니다. 이중 루시퍼라제 분석기는 생성된 상이한 단백질의 비율을 측정하여상이한 판독 프레임을 3,4로해결한다. 그것은 단지 mRNA의 3' 끝에 적용 하 고 따라서 전좌의 전체 그림을 제공 하기 위해 부족. 질량 분석법은 대응하는 코드 재배열의 결과로 상이한 펩티드단편을 분석할 수 있다 5. 그러나 mRNA에 리보솜이 얼마나 많은 nt 이동하는지 정확히 파악할 수 없습니다. 발가락 프린팅 분석법은 리보솜 6을 향해 mRNA를 전사하기 위해 3'-말단에서 프라이밍된 역전사를사용하는 또 다른 일반적인 방법이다. 그러나 리보솜에 들어가는 mRNA의 5' 말단에는 적용되지 않는다. 단일 분자 접근법 및 형광 방법 7을포함하는 다른 기술은 단일 nt 분해능을 달성하기 어렵다.
우리는 리보솜-mRNA 복합체에 있는 밝혀진 mRNA의 입구 그리고 출구 위치를 둘 다 유일하게 결정할 수 있는 이중 DNA 통치자 분석약을 개발했습니다.  통치자 DNA는 mRNA의 어느 말단에 관계없이 리보솜에 의해 발견된 mRNA와 염기쌍 (bp)의 특정 수의 이중을 형성하는 DNA 올리고머입니다. bp 숫자는 전좌 도중 mRNA에 리보솜 위치를 정확하게 드러냅니다. 이중의 bp 수는 힘 유도 된 잔류 자화 분광기 (FIRMS) 8에서 얻은 임계 해리력에의해 결정됩니다. 2-3 pN 힘 불확도를 가진, 임계 힘은 단일 nt 분해능을 제공하기에 충분합니다. DNA 눈자에 링커 분자를 구현함으로써, 리보솜에 의해 mRNA의 스테리컬 방해 측을 조사할 수 있다. 따라서 다른 리보좀 변위를 정확하게 해결할 수 있습니다. 우리는 전좌9동안 항생제에 의해 갇혀 있는 mRNA의 독특한 고리 형태형성을 성공적으로 밝혀냈으며, 미끄러운 mRNA 서열10에공존하는 상이한 판독 프레임을 해결했다. 이 기사에서는 리보솜 복합체의 준비, 유리 슬라이드의 표면 기능화, 리보솜 복합체의 고정화 및 자기 표지된 DNA 눈금자와의 혼성화를 포함하는 이중 통치자 분석법의 세부 사항을 설명합니다. 분자, 자기 검출 및 기업에 의한 힘 스펙트럼 분석.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
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dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

리보솜 전좌는 단백질 합성에 있는 중앙 단계인 정확하게 3개의 뉴클레오티드 (nt)에 의해 mRNA에 리보솜 운동을 나타납니다. 메커니즘을 조사하기 위해 두 가지 필수 기술 요구 사항이 있습니다. 첫 번째는 리보솜이 3 nt 를 제외한 다른 것으로 이동하는 동안 프레임 변속에서 정상적인 전좌를 해결할 수있는 단일 nt 해상도입니다. 두 번째는 전좌의 전체 그림을 해명하기 위해 mRNA의 입구와 출구 측면을 모두 조사 할 수있는 기능입니다. 우리는 힘 유도된 잔재 자화 분광학에 의해 장악된 DNA-mRNA 이중의 중요한 해리력에 근거를 둔 이중 DNA 통치자 분석법을 보고합니다 (FIRMS).  2-4 pN 힘 분해능을 사용하면 이중 눈자압 분석이 서로 다른 전좌 단계를 구별하기에 충분합니다. 프로빙 DRNA에 긴 링커를 구현함으로써, 그들은 리보솜의 반대편에 있는 mRNA에 도달할 수 있고, 그래서 mRNA 위치는 양측을 위해 결정될 수 있다. 따라서, 이중 눈금자 분석은 리보솜 전좌 및 일반적으로 핵산 운동을 조사하는 데 유일하게 적합하다. 우리는 루프 mRNA 형태와 프레임 변속에서 정상 전좌를 해결 한 대표적인 결과를 보여줍니다.

도 1은 주요 구성요소의 검출 체계 및 사진을 나타낸다. 자기 검출은 스캐닝 방식(도1A)(도 1A)을 이용하여 원자자력계에 의해 달성된다(도 1A)13. 샘플은 선형 모터에 장착된 로드에 배치됩니다. 모터는 샘플을 자기 실드 내부의 원자 센서로 운반한 다음 하역을 위해 원래 사이트로 다시 이동합니다. 원자 자력계는 샘플 스캔...

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Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

이중 DNA 눈자 분석은 형성된 DNA-mRNA 이중의 해리력에 의존하는 리보솜 전좌 동안 mRNA 위치를 결정하기 위하여 개발됩니다. 단일 뉴클레오티드 분해능과 mRNA의 양 단에 도달하는 기능을 통해 리보솜 전좌에 대한 기계적 통찰력을 제공하고 다른 핵산 변위를 조사할 수 있습니다.

단일 뉴클레오티드 해상도로 리보솜 전좌의 메커니즘을 연구하는 이중 DNA 통치자

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

이중 DNA 눈금자 분석은 리보솜 전좌에 대한 기계적 통찰력을 제공하고 다른 핵산 변위를 조사할 수 있습니다. 우리의 이중 DNA 눈금자 분석법은 현재 단일 뉴클레오티드 분해능을 가진 리보솜 복합체에서 mRNA의 입구와 출구 면을 객관적으로 조사할 수 있는 유일한 방법입니다. 유사한 방법은 또한 화학요법 약의 DNA 결합 강도 및 선택성을 측정하기 위하여 적용됩니다.이 방법의 시각적 데모는 우리의 기술의 장점을 직관적으로 보여주고 다른 연구자들이 더 많은 응용 프로그램으로 발전할 수 있도록 도울 수 있는 좋은 기회입니다. 먼저 중앙에 큐브를 드릴링하여 스티렌 스트립으로 플라스틱 샘플을 3밀리미터 x 2밀리미터 로 3밀리미터로 드릴링합니다. 그런 다음 에폭시를 사용하여 약 5밀리미터 길이의 비오틴 코팅 유리 조각을 바닥 표면에 접착제로 붙입니다.밀리리터 스트렙타비딘 수성 용액당 0.25 밀리그램의 20 마이크로리터를 시료에 잘 넣고 실온에서 40분 동안 배양합니다. 그런 다음 TAM10 버퍼로 샘플을 두 번 헹요. 항생제 없이 리보솜 복합체를 고정하려면 먼저 시료로부터 버퍼를 잘 제거하고 0.1 마이크로몰러 MF-Pre 또는 MF-Post 리보솜 복합체20을 샘플에 잘 첨가한다.1시간 동안 섭씨 37도에서 배양한 다음 TAM10 버퍼로 한 번 헹구습니다. 리보솜 복합체는 이제 mRNA의 5프라임 엔드 비오틴을 통해 표면에 있는 스트렙타비딘과 결합한다. 항생제를 이용한 실험을 위해 MF-Pre 복합체의 9마이크로리터를 4밀리머 네오마이신 1편, 섭씨 37도10분으로 배양한다.그런 다음 튜브 0.6 마이크로리터 60 마이크로몰라 EFG, 0.8 마이크로리터 100 마이크로몰라 GTP, 0.8 마이크로리터 100 밀리머 PEP, 밀리리터 피루바테 키나아제 당 1.3 밀리그램, 6.43 마이크로리터 TAM10 완충제, 1마이크로리터 TAM10 완충제 및 1마이크로리터 에 결합한다. 섭씨 37도에서 20분간 배양하세요. 그런 다음 두 혼합물을 결합하고 섭씨 37도에서 추가로 5 분간 배양합니다.유사한 다른 항생제 실험을 수행, 의 농도와 0.2 밀리머 비오 마이신, 0.4 밀리머 hygromycin B, 그리고 0.25 밀리몰러 fusidic 산. 프레임 시프팅 스터디의 경우 미끄러운 모티프인 U6A와 관련된 MFNF-Pre 복합체의 인큐베이션을 반복하십시오. fusidic 산 플러스 네오 마이신의 항생제를 포함.혼성화 프로세스의 완료를 보장하기 위해 충분한 시간이 필요합니다. 또한 실제 1개의 몰 나트륨 염화나트륨과 TAM10 버퍼를 사용하여 호모스테디 시스템을 유지하는 것이 좋습니다. 인큐베이션 후 샘플에서 버퍼를 잘 제거합니다.1개의 마이크로몰러 생물화한 DNA 가닥의 20마이크로리터를 추가하고, 밤새 실온에서 배양합니다. 아침에, TAM10 버퍼와 함께 한 번 형성 된 DNA / mRNA 복층을 헹구는다. 샘플에서 버퍼를 잘 제거합니다.그런 다음 밀리리터 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 구슬당 0.5 밀리그램의 20 마이크로리터를 시료에 잘 넣고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그 후, 조심스럽게 홀더에 샘플을 삽입하고 5 분 동안 84 시간 g에서 표면에서 자유 자기 입자를 제거하기 위해 원심 분리기에 배치합니다. 레이저를 켭니다.그런 다음 전원 버튼을 누릅니다. 감도를 500 밀리볼트로 조정하고 약 2시간 동안 기다렸다가 원자자력계를 따뜻하게 하고 안정화합니다. 원자 자력계를 설정하려면 계측기 제어 소프트웨어를 실행하고 모터 이동 모드를 노이즈 및 기본 위치로 설정합니다.전면 패널의 잠금을 누릅니다. 감도를 다시 200 밀리볼트로 조정합니다. 레이저의 전류와 전압을 조정하고 최적의 신호 해상도를 위해 적절한 공진 피크 및 신호 대 잡음 레벨을 찾습니다.전면 패널에서 스윕을 누릅니다. 진폭 대 폭 비율이 0.5 를 초과하고 위상 값이 너비가 170 hertz 미만인 5도 보다 작은지 확인합니다. 다른 SR530 잠금 증폭기의 출력을 레이저의 피드백에 연결하여 주파수를 잠급합니다.함수 생성기 ATF20B를 연결하여 500 밀리볼트 피크의 정사각형 파를 피크로 입력하고, 100 밀리헤르츠를 전류를 자기 신호로 변환하기 위한 기준 신호로 입력합니다. 그런 다음 함수 생성기를 분리합니다. 모터 이동 모드를 양방향 및 기본 위치로 260mm로 설정합니다.온도 컨트롤러의 상태를 확인하여 원자 센서의 온도가 섭씨 약 37도에 있는지 확인하십시오. 빈 샘플 홀더의 신호를 측정하기 위해 샘플을 적재하지 않고 프로그램을 직접 실행하여 전체 시스템의 안정성을 두 번 확인합니다. 시료를 자화하려면 핀셋을 사용하여 샘플을 홀더에서 꺼내 2 분 동안 자화 단계에 놓습니다.그런 다음 샘플을 샘플 홀더에 다시 넣고 원심분리기를 335.4배 g에서 20분 동안 넣습니다. 특이하지 않은 자기 입자를 제거합니다. 그런 다음 핀셋으로 샘플을 모터에 로드합니다.전면 패널의 잠금을 클릭하여 프로그램을 실행합니다. 한편 핀셋을 사용하여 다른 샘플을 홀더에 로드하고 원심분리기에 넣습니다. 코팅 된 유리 면은 원심 분리기의 중심을 향하고, 4 분 동안 335.4 배 g에서 원심 분리를 시작합니다.모터가 0으로 돌아오면 약 5분 후에 전면 패널에 저장을 클릭합니다. 핀셋을 사용하여 모터에서 원심분리기 홀더로 샘플 1개를 전송합니다. 원심 속도를 100rpm 또는 이와 유사한 스텝 크기로 증가시켜 더 강한 힘을 적용하십시오.원심분리기의 샘플을 교환합니다. 매번 점차적으로 힘을 증가시키기 위해 번갈아 프로세스합니다. 10~12개의 데이터 포인트 후에 완전한 힘 스펙트럼을 얻을 수 있습니다.계획된 모든 실험이 완료되면 장비를 끄고 켜진 대로 반대 순서로 진행합니다. 홀더에서 샘플을 제거하고 청소 및 향후 사용을 위해 에탄올에 담가 두습니다. 마그네틱 비드 오염시 아세톤으로 샘플 홀더를 청소하십시오.이 프로토콜에서, 리보솜 복합체는 mRNA의 5-프라임 끝을 통해 표면에 고정되었고, 조사 DNA 통치자에 쉽게 접근할 수 있는 5프라임 및 3프라임 측을 모두 만들었다. 5-프라임 측에 대한 링커가 50 티민보다 길면 강력한 자기 신호가 감지되어 DNA /mRNA 이중으로 성공적으로 형성되었습니다. DNA상에 있는 뉴클레오티드의 수를 변화시킴으로써, 해복 길이에 대한 해리력의 상관관계는 각각 3-프라임 및 5-프라임 측면에 대해 달성되었다.MF-Pre에서 MF-Post로의 정상적인 전좌 결과는 항생제가 없는 상태에서 양측의 3개의 핵성으로 3개의 뉴클레오티드에 의해 이동된 리보솜을 보여줍니다. MF-Pre는 P와 A 사이트에서 각각 fMet-tRNA및 페닐알라닌-tRNA를 운반했으며, MF-Post는 각각 E 및 P 사이트에서 fMet-tRNA와 페닐라닌-tRNA를 가지고 빈 A 사이트를 가지고 다녔다. 그러나, fusidic 산과 아디오마이신 항생제가 모두 존재했을 때, 리보솜은 5-프라임 측에 단 하나의 뉴클레오티드에 의해 움직였지만 3개의 주요 측에 2개의 뉴클레오티드에 의해 움직였다.항생제를 씻은 후에, 일반적인 전좌는 5-프라임 과 3개의 프라임 측 모두에서 3개의 뉴클레오티드 운동에 의해 입증된 바와 같이, 일어났습니다. 시료를 자화할 때 코팅된 표면에 접근하여 자석을 수직으로 두어야 합니다. 그리고 비특이적으로 결합된 자기 입자를 제거하는 것은 데이터 정확도와 품질에 매우 중요합니다.우리의 기술은 분자 생물학에서 널리 발생하는 핵산의 분자 변위를 조사하는 고해상도 및 일반적으로 적용 가능한 방법을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

연구

생화학

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

DNA는 Cyanine 염료 수 소화 수 제한 효소로 얼룩진 경우 결정

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

생체 내피 세포에서 RNA 격리를 위한 리보솜 친화성 정제(TRAP) 번역

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

살아있는 세포에서 단백질 단백질 상호 작용 및 단백질 역학을 연구하기 위한 이중 색 형광 교차 상관 분광법

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...