Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Эта работа поддерживается Национальными институтами здравоохранения США (R01GM111452, YW, S.X.). Y. W. признает поддержку фонда Уэлча (E-1721).

1. Подготовка рибосомных комплексов
<ol><li>Сделать 1000 мл буфера TAM10, который состоит из 20 мм трис-HCl (pH 7.5), 10 мМ Мг (OAc)2, 30 мМ NH4Cl, 70 мм KCl, 5 мМ EDTA, 7 мМ BME (2-mercaptoethanol), и 0,05% Tween20.</li>
	<li>Подготовка пяти смесей, перечисленных в таблице 1. ПРИМЕЧАНИЕ: Рибосома была от штамма MRE600<sup class=...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

В нашем двойном правителе, магнитные бусы играют две основные роли. Во-первых, они служат в качестве форс-мажоров, поскольку центробежная сила пропорциональна их плавучей массе. Во-вторых, бусы являются сигнальными носителями, обнаруженными атомным магнитометром, который в настоящее в?...

Биомолекулярное смещение является фундаментальным параметром при изучении механизма связанных с ними биологических функций. Одним из конкретных примеров является рибосома транслокации1,2, во время которого рибосома движется ровно на три нуклеотидов (nt) на посланника РНК (мРНК) обычно, и на один, два, или другие числа nt, за исключением трех в случае frameshifting. Таким образом, молекулярная система линейки одно-nt разрешение требуется, чтобы различать различные размеры шага. Более сложной задачей является зондирование рибосомного движения как на входной, так и с выездной сторон. Другими словами, только с двойной системой линейки мы сможем выявить, является ли мРНК плавно резьбой через рибосому, или есть промежуточные шаги, в которых обе стороны имеют различные размеры шагов, ведущих к изродоверженной или зацикленный мРНК конформации внутри Рибосома.
Было разработано несколько методов для решения первой задачи решения различных шагов на выходе из рибосомы (3' конец мРНК). Двойной анализ luciferase разрешает различные рамки чтения путем измерения соотношений в результате различных белков3,4. Она применима только для 3'конца мРНК и, следовательно, недостаточно, чтобы обеспечить полную картину транслокации. Масс-спектрометрия может анализировать различные фрагменты пептидав результате соответствующих перестановок кода 5. Но он не может точно определить, сколько NT рибосома движется на мРНК. Асса "Печатание на носе" является еще одним распространенным методом, который использует обратную транскрипцию, загрунтоваемую на 3'-дистальном конце, чтобы расшифровать мРНК к рибосоме6. Тем не менее, это не применимо для 5'конца мРНК, который входит в рибосому. Другие методы, в том числе одиночные подходы молекулы и методы флуоресценции7,трудно достичь одно-nt резолюции.
Мы разработали двойной анализ линейки ДНК, который может однозначно определять как входные, так и выходные позиции нераскрытой мРНК в комплексах рибосомы-мРНК.  Правитель ДНК-олигомеры ДНК, которые образуют дуплексы определенного количества базовых пар (bp) с мРНК обнаружили рибосомы, независимо от того, какой конец мРНК. Bp номера затем точно выявить рибосомы позиции на мРНК во время транслокации. Номера bp дуплексов определяются их критическими силами диссоциации, полученными от принудительной спектроскопии намагниченной намагниченности (FIRMS)8. При неопределенности сил 2-3 pN, критические силы достаточны для того чтобы предложить разрешение одиночной. Путем снабжать молекулу связующего на правителях дна, стерически препятствовала стороне mRNA ribosome можно прощупать. Таким образом, различные рибосомные перемещения могут быть точно разрешены. Мы успешно показали уникальную зацикленный конформации мРНК в ловушке антибиотиков во время транслокации9, и решены различные рамки чтения, которые сосуществовали на скользкой последовательности мРНК10. В этой статье описаны детали двойного анализа правителя, которые включают в себя подготовку рибосомных комплексов, функционализацию поверхности стеклянных горок, иммобилизацию рибосомных комплексов и их гибридизацию с магнитно помеченным линейкой ДНК молекулы, магнитное обнаружение и анализ силового спектра FIRMS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

Рибосома транслокации относится к рибосомным движением на мРНК ровно тремя нуклеотидами (nt), который является центральным шагом в синтезе белка. Для изучения его механизма существуют два основных технических требования. Во-первых, это одно-nt резолюции, которые могут решить нормальные транслокации от frameshifting, во время которого рибосома движется по мимо 3 nt. Во-вторых, возможность зондирования как входной, так и выездной стороны мРНК, с тем чтобы выяснить всю картину транслокации. Мы сообщаем о двойном анализе линейки ДНК, который основан на критических силах диссоциации дуплексов ДНК-мРНК, полученных с помощью принудительной спектроскопии намагниченности (FIRMS).  С разрешением силы 2-4 pN, двойной ассеид правителя достаточно, чтобы различать различные шаги транслокации. Реализуя длинный связующий на зондирующих ДНА, они могут достичь мРНК на противоположной стороне рибосомы, так что позиция мРНК может быть определена для обеих сторон. Таким образом, двойной правитель асссе однозначно подходит для исследования рибосомы транслокации, и нуклеиновой кислоты движения в целом. Мы показываем репрезентативные результаты, которые указали циклический конформации мРНК и решить нормальную транслокацию от frameshifting.

На рисунке 1 показана схема обнаружения и фотографии основных компонентов. Магнитное обнаружение достигается с помощью атомного магнитометра с помощью схемы сканирования(рисунок 1A)13. Образец помещается на стержень, установленный ...

Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Двойной анализ линейки ДНК разработан для определения положения мРНК во время транслокации рибосомы, которая опирается на силы разобщенности сформированных дуплексов ДНК-мРНК. С разрешением одного нуклеотида и возможностью достижения обоих концов мРНК, он может обеспечить механистические идеи для транслокации рибосомы и зондирования других смещений нуклеиновой кислоты.

Двойные линейки ДНК для изучения механизма транслокации рибосом с однонуклеотидной резолюцией

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Двойной анализ правителя ДНК может обеспечить механистические идеи для рибосомы транслокации и зонд других нуклеиновой кислоты смещения. Наша двойная ДНК правителя анализа в настоящее время является единственным методом, который может объективно зондировать как вход и выход стороны мРНК в рибосомных комплексов с однонуклеотидным разрешением. Аналогичные методы применяются и для измерения силы связывания ДНК и селективности химиотерапевтических препаратов.Визуальная демонстрация метода является хорошим шансом для нас интуитивно показать преимущества нашей техники и помочь другим исследователям в дальнейшем развивать его в более приложений. Для начала сделайте пластиковый образец скважины со стиреной полосой, сверлив куб в центре с габаритами четыре миллиметра на три миллиметра на два миллиметра. Затем, используя эпоксидную смолу, приклейте к нижней поверхности кусок стекла с биотиновым покрытием длиной около пяти миллиметров.Добавьте в образец 20 микролитров по 0,25 миллиграмма на миллилитр стрептавидина и инкубировать при комнатной температуре в течение 40 минут. Затем промыть образец хорошо дважды с буфером TAM10. Чтобы обездвижить рибосомные комплексы без антибиотиков, сначала удалите буфер из образца хорошо, и добавить 20 микролитров 0,1 микромолярной MF-Pre или MF-Post рибосомный комплекс в образец хорошо.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, а затем промыть один раз с буфером TAM10. Рибосомный комплекс теперь связывается со стрептавидином на поверхности через пятипремеченый биотин конца на мРНК. Для эксперимента с использованием антибиотиков инкубируйте девять микролитров комплекса MF-Pre одним микролитером из четырех миллимолярный неомицин, 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут.Затем объединить в трубку 0,6 микролитров 60 микромолейных EFG, 0,8 микролитров 100 микромоляных GTP, 0,8 микролитров 100 миллимолярной ПЭП, 0,3 микролитров по 1,3 миллиграмма на миллилитр пирувате киназы, 6,43 микролитров буфера TAM10 и один микролитр из пяти миллимолярной фусидической кислоты. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Затем объединить две смеси, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение еще пяти минут.Провести другие эксперименты антибиотиков аналогичным образом, с концентрациями 0,2 миллимолярского виомицина, 0,4 миллимоляра гигромицина B и 0,25 миллимолярновой фусидической кислоты. Для изменения кадра повторите инкубацию для комплексов MFNF-Pre со скользким мотивом U6A. Включить антибиотики фусидиновой кислоты плюс неомицин.Для завершения процесса гибридизации требуется достаточно времени. Рекомендуется также использовать буфер TAM10 с фактическим один хлорид натрия моль для поддержания гомостационной системы. После инкубации хорошо удалите буфер из образца.Добавьте 20 микролитров одного микромолярского биотинилированного зондирующего нить ДНК и инкубировать при комнатной температуре за одну ночь. Утром смойте образовав ДНК/мРНК дуплекс один раз буфером TAM10. Удалите буфер из образца хорошо.Затем добавьте в образец 20 микролитров по 0,5 миллиграмма на миллилитр магнитных бусин с покрытием стрептавидина и инкубировать при комнатной температуре в течение двух часов. После этого тщательно вставьте образец хорошо в держатель, и поместите его в центрифугу, чтобы удалить свободные магнитные частицы с поверхности в 84 раза г в течение пяти минут. Включите лазер.Затем нажмите кнопку питания. Отрегулируйте чувствительность до 500 милливольт и подождите около двух часов, чтобы разогреть и стабилизировать атомный магнитометр. Чтобы настроить атомный магнитометр, запустите программное обеспечение для управления приборами и навеяните режим перемещения двигателя в шум и положение по умолчанию до нуля.Нажмите блокировки на передней панели. Отрегулируйте чувствительность до 200 милливольт. Отрегулируйте ток и напряжение лазера, и найти правильный пик резонанса и уровень сигнала к шуму для лучшего разрешения сигнала.Нажмите Sweep на передней панели. Убедитесь, что соотношение амплитуды к ширине выше 0,5, а фазовое значение меньше пяти градусов с шириной менее 170 герц. Подключите выход другого усилителя блокировки SR530 к обратной связи лазера, чтобы заблокировать его частоту.Подключите функцию генератора ATF20B для ввода квадратной волны 500 милливольт пик к пику, 100 миллигерц в качестве эталонного сигнала для преобразования тока в магнитный сигнал. Затем отключите генератор функций. Настройка режима перемещения двигателя в двухготовном и по умолчанию до 260 миллиметров.Проверьте состояние контроллера температуры, чтобы убедиться, что температура составляет около 37 градусов по Цельсию, атомного датчика. Проверьте стабильность всей системы дважды, непосредственно запуская программу без загрузки образцов для измерения сигналов пустого держателя образца. Чтобы намагничить образцы, осторожно используйте пинцет, чтобы взять образец из держателя, и поместите на стадии намагничить в течение двух минут.Затем положить образец обратно в держатель образца, и центрифуга в 335,4 раза г в течение 20 минут. Удалите неспецифически связанные магнитные частицы. Затем загрузите образец на двигатель пинцетом.Нажмите Блокировка на передней панели для запуска программы. Между тем используйте пинцет, чтобы загрузить другой образец в держатель, и поместить его в центрифугу. Сделайте стеклянную сторону с покрытием лицом к центруге и начните центрифугу в 335,4 раза г в течение четырех минут.Когда двигатель вернется к нулю, примерно через пять минут нажмите Сохранить на передней панели. Тщательно используйте пинцет для передачи одного образца от двигателя к держателю центрифуги. Нанесите более сильную силу, увеличив центробеченную скорость на 100 об/мин или аналогичный размер шага.Обменяем образец на центрифугу. Процесс поочередно постепенно увеличить силу каждый раз. Полный спектр силы получен после 10-12 точек данных.Когда все запланированные эксперименты будут закончены, выключите оборудование, продолжая в обратном порядке, как это было включено. Удалите образцы из держателя, и погрузить их в этанол для очистки и использования в будущем. Очистите держатель образца ацетоном в случае загрязнения магнитного шарика.В этом протоколе, рибосомный комплекс был обездвижен на поверхности, через пять премьер конце мРНК, и сделал как пять премьер и три премьер стороны легко доступны для зондирования ДНК правителей. Когда связующее звено для пяти-премьер стороны было больше, чем 50 тимин, сильный магнитный сигнал был обнаружен, что свидетельствует об успешном образовании ДНК / мРНК дуплексов. Изменяя количество нуклеотидов в ДНК, корреляция силы диссоциации с дуплексной длиной была достигнута для трех-премьеровых и пяти-премьер сторон, соответственно.Результаты нормальной транслокации из MF-Pre в MF-Post, в отсутствие антибиотиков, показывают, что рибосома переехала тремя нуклеотидами к трех-премьер-конец с обеих сторон. MF-Pre перевозил бродячий fMet-tRNA и фенилаланин-тРНК на участках P и A, соответственно, в то время как MF-Post перевозила fMet-tRNA и фенилаланин-тРНК на участках E и P, соответственно, с вакантным участком А. Однако, когда оба фузидиновой кислоты и адиомицин антибиотики присутствовали, рибосома переехал только один нуклеотид на пять премьер стороны, но два нуклеотидов на три премьер стороны.После смывания антибиотиков произошла нормальная транслокация, о чем свидетельствуют три нуклеотидных движения как с пяти-премьер, так и с трех премьер-сторон. При намагничении образца поверхность с покрытием должна подойти и покинуть магнит вертикально. Удаление неспецифически связанных магнитных частиц очень важно для точности и качества данных.Наша методика обеспечивает высокое разрешение и в целом применимый способ исследования молекулярного смещения нуклеиновой кислоты, которая широко встречается в молекулярной биологии.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Одиночных молекул Super-Resolution Imaging фосфатидилинозит 4,5-бисфосфат в плазматической мембране с новыми флуоресцентных зондов

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Определение, если ДНК окрашивали цианиновые краска может быть переваривается с энзимами ограничения

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Исследование переноса энергии флуоресценции одной молекулы синтеза белка рибосомы

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

CD-спектроскопия для изучения взаимодействий ДНК и белка

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...