Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
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Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (R01GM111452, Y.W., S.X.). Y. W. reconoce el apoyo de la Fundación Welch (E-1721).

1. Preparación de los complejos ribosomas
<ol><li>Hacer 1.000 mL de tam10 buffer, que consiste en 20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 5 mM EDTA, 7 mM BME (2-mercaptoetanol), y 0.05% Tween20.</li>
	<li>Preparar las cinco mezclas enumeradas en la Tabla1. NOTA: El ribosoma era de la cepa MRE60011. EF-Tu: factor de alargamiento termo inestable. EF-Ts: factor de alargamiento termo estable. GTP: trifosfato de guanosina. PEP: fosf...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

En nuestro ensayo de doble regla, las cuentas magnéticas desempeñan dos papeles esenciales. En primer lugar, sirven como transductores de fuerza porque la fuerza centrífuga es proporcional a su masa boyante. En segundo lugar, las perlas son portadoras de señal detectadas por un magnetómetro atómico, que actualmente es el sensor magnético más preciso. Combinando la manipulación mecánica y la detección magnética, la técnica FIRMS es capaz de resolver un gran número de interacciones moleculares basadas en sus ...

El desplazamiento biomolecular es un parámetro fundamental en el estudio del mecanismo de las funciones biológicas relacionadas. Un ejemplo particular es la translocación ribosoma1,2, durante la cual el ribosoma se mueve exactamente por tres nucleótidos (nt) en el ARN mensajero (arNM) normalmente, y por uno, dos u otros números de nt excepto tres en el caso de cambio de marco. Por lo tanto, se requiere una resolución de un solo nt del sistema de reglas moleculares para distinguir los diferentes tamaños de paso. Un desafío mayor es sondear el movimiento ribosoma tanto en el lado de entrada como en el de salida. En otras palabras, sólo con un sistema de doble regla podremos revelar si el ARNm se enhebra suavemente a través del ribosoma, o hay pasos intermedios en los que los dos lados tienen diferentes tamaños de paso que conducen a una conformación de ARNm torcido o en bucle dentro de la Ribosoma.
Se han desarrollado varios métodos para abordar el primer reto de resolver diferentes pasos en el lado de salida del ribosoma (el extremo de 3' del ARNm). El ensayo de doble luciferasa resuelve los diferentes marcos de lectura midiendo las proporciones de las diferentes proteínas resultantes3,4. Sólo es aplicable para el extremo de 3' del ARNm y, por lo tanto, insuficiente para proporcionar una imagen completa de la translocación. La espectrometría de masas puede analizar los diferentes fragmentos de péptidos como consecuencia de los correspondientes reordenamientos de código5. Pero no puede identificar cuántos movimientos ribosomas en el ARNm. El ensayo de impresión de dedos de los dedos es otro método común que utiliza una transcriptasa inversa cebada en el extremo distal de 3'para transcribir el ARNm hacia el ribosoma6. Sin embargo, no es aplicable para el extremo de 5' de ARNm que está entrando en el ribosoma. Otras técnicas, incluyendo enfoques de molécula única y métodos de fluorescencia7, son difíciles de lograr una resolución de un solo nt.
Hemos desarrollado el ensayo de la regla de ADN dual que puede determinar de manera única las posiciones de entrada y salida del ARNm descubierto en los complejos ribosoma-mRNA.  Los DN a la regla son oligómeros de ADN que forman dúplex de ciertos números de pares de bases (bp) con el ARNm descubierto por el ribosoma, independientemente de qué extremo del ARNm. Los números bp revelan con precisión la posición ribosoma en el ARNm durante la translocación. Los números bp de los dúplex están determinados por sus fuerzas de disociación crítica obtenidas a partir de la espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS)8. Con una incertidumbre de fuerza de 2-3 pN, las fuerzas críticas son suficientes para ofrecer una resolución de un solo nt. Mediante la implementación de una molécula de vinculador en las reglas de ADN, el lado esterrámico obstaculizado del ARNm por el ribosoma puede ser sondeado. Por lo tanto, se pueden resolver con precisión los diferentes desplazamientos ribosomales. Hemos revelado con éxito una conformación única en bucle de ARNm atrapado por antibióticos durante la translocación9,y resuelto diferentes marcos de lectura que coexistían en una secuencia de ARNm resbaladizo10. Este artículo describe los detalles del ensayo de doble regla, que incluyen la preparación de los complejos ribosomas, la funcionalización superficial de los portaobjetos de vidrio, la inmovilización de los complejos ribosomas y su hibridación con la regla de ADN etiquetada magnéticamente moléculas, detección magnética y análisis del espectro de fuerza por PARTE de FIRMS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

La translocación ribosoma se refiere al movimiento ribosomal en el ARNm por exactamente tres nucleótidos (nt), que es el paso central en la síntesis de proteínas. Para investigar su mecanismo, existen dos requisitos técnicos esenciales. En primer lugar es la resolución de un solo nt que puede resolver la translocación normal del cambio de cuadro, durante el cual el ribosoma se mueve por otros 3 nt. El segundo es la capacidad de sondear los lados de entrada y salida del ARNm con el fin de dilucidar toda la imagen de la translocación. Informamos del ensayo de la regla de ADN dual que se basa en las fuerzas de disociación críticas de los dúplex de ARN-ADN, obtenidos por espectroscopia de magnetización remanente inducida por la fuerza (FIRMS).  Con una resolución de fuerza de 2-4 pN, el ensayo de regla dual es suficiente para distinguir diferentes pasos de translocación. Mediante la implementación de un vinculador largo en los DN de sondeo, pueden alcanzar el ARNm en el lado opuesto del ribosoma, de modo que la posición del ARNm se puede determinar para ambos lados. Por lo tanto, el ensayo de doble regla es especialmente adecuado para investigar la translocación ribosoma, y el movimiento del ácido nucleico en general. Mostramos resultados representativos que indicaban una conformación de ARNm en bucle y resolvieron la translocación normal del cambio de trama.

La Figura 1 muestra el esquema de detección y las fotografías de los componentes principales. La detección magnética se logra mediante un magnetómetro atómico utilizando el esquema de escaneo (Figura1A)13. La muestra se coloca en una varilla montada en un motor lineal. El motor transporta la muestra al sensor atómico dentro de un escudo magnético, y luego de vuelta al sitio original para su descarga. El magnetóme...

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Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

El ensayo de la regla de ADN dual se desarrolla para determinar la posición del ARNm durante la translocación ribosoma, que se basa en las fuerzas de disociación de los dúplex de ARN-ADN formados. Con la resolución de un solo nucleótido y la capacidad de llegar a ambos extremos del ARNm, puede proporcionar información mecanicista para la translocación ribosoma y sondear otros desplazamientos de ácido nucleico.

Los gobernantes de ADN dual estudiarán el mecanismo de la translocación ribosoma con resolución de un solo nucleótido

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

El ensayo de doble regla de ADN puede proporcionar información mecanicista para la translocación ribosoma y sondear otros desplazamientos de ácido nucleico. Nuestro ensayo de doble regla de ADN es actualmente el único método que puede sondear objetivamente los lados de entrada y salida del ARNm en los complejos ribosomas con resolución de un solo nucleótido. También se aplican métodos similares para medir la fuerza de unión al ADN y la selectividad de los fármacos quimioterápicas.La demostración visual del método es una buena oportunidad para mostrar intuitivamente las ventajas de nuestra técnica y ayudar a otros investigadores a desarrollarlo aún más en más aplicaciones. Para empezar, hacer una muestra de plástico bien con una tira de estireno perforando un cubo en el centro con dimensiones de cuatro milímetros por tres milímetros por dos milímetros. Luego, usando epoxi, pegue un pedazo de vidrio recubierto de biotina, de aproximadamente cinco milímetros de largo, a la superficie inferior.Añadir 20 microlitros de 0,25 miligramos por mililitro de solución acuosa de estreptavidina en el pozo de la muestra, e incubar a temperatura ambiente durante 40 minutos. A continuación, enjuague bien la muestra dos veces con el tampón TAM10. Para inmovilizar los complejos ribosomas sin antibióticos, primero retire el tampón del pozo de muestra y agregue 20 microlitros de 0.1 micromolar MF-Pre o MF-Post complejo ribosoma en el pozo de la muestra.Incubar a 37 grados centígrados durante una hora, y luego enjuagar una vez con tampón TAM10. El complejo ribosoma ahora se une con la estreptavidina en la superficie a través de la biotina de cinco primos en el ARNm. Para el experimento con antibióticos, incuba nueve microlitros del complejo MF-Pre con un microlitro de cuatro neomicina milimétrica, 37 grados Celsius durante 10 minutos.A continuación, combinar en un tubo 0,6 microlitros de 60 micromolar EFG, 0,8 microlitros de 100 micromolar GTP, 0,8 microlitros de 100 militrolarES PEP, 0,3 microlitros de 1,3 miligramos por mililitro piruvato quinasa, 6,43 microlitros TAM10, tampón y un microlitor de cinco ácidos fusídicos mililares. Incubar a 37 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, combine las dos mezclas e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos adicionales.Llevar a cabo los otros experimentos con antibióticos de forma similar, con concentraciones de 0,2 emicina mililar, 0,4 ehigromicina mililitrosa B y 0,25 ácidos fusídicos mililares. Para el estudio de cambio de marco, repita la incubación para los complejos NMF-Pre que implican el motivo resbaladizo, U6A. Incluya antibióticos de ácido fusídico más neomicina.Se ha necesario tiempo suficiente para garantizar la finalización del proceso de hibridación. También se recomienda utilizar el tampón TAM10 con un cloruro de sodio lunar real para mantener un sistema homosteady. Después de la incubación, retire el tampón del pozo de muestra.Añadir 20 microlitros de una cadena de ADN de sondeo biotinilada micromolar e incubar a temperatura ambiente durante la noche. Por la mañana, enjuague el dúplex de ADN/ARM formado una vez con tampón TAM10. Retire el búfer del pozo de muestra.A continuación, agregue 20 microlitros de 0,5 miligramos por mililitro recubierto de estreptavidina en el pozo de muestra, e incubar a temperatura ambiente durante dos horas. Después de eso, inserte cuidadosamente la muestra bien en un soporte, y colóquela en una centrífuga para eliminar las partículas magnéticas libres de la superficie a 84 veces g durante cinco minutos. Enciende el láser.A continuación, pulse el botón de encendido. Ajuste la sensibilidad a 500 milivoltios y espere unas dos horas para calentar y estabilizar el magnetómetro atómico. Para configurar el magnetómetro atómico, ejecute el software de control de instrumentos y configure el modo de movimiento del motor en Ruido y la posición predeterminada a cero.Pulse Bloquear en el panel frontal. Ajuste la sensibilidad a 200 milivoltios. Ajuste la corriente y el voltaje del láser, y encuentre el pico de resonancia adecuado y el nivel de señal a ruido para la mejor resolución de señal.Pulse Barrido en el panel frontal. Asegúrese de que la relación amplitud-ancho es superior a 0,5 y que el valor de fase es menor que cinco grados con una anchura inferior a 170 hercios. Conecte la salida de otro amplificador de bloqueo SR530 a la retroalimentación del láser para bloquear su frecuencia.Conecte el generador de funciones ATF20B para introducir una onda cuadrada de 500 milivoltios pico a pico, 100 milivoltios como la señal de referencia para convertir la corriente a señal magnética. A continuación, desenchufe el generador de funciones. Configure el modo de movimiento del motor en bidireccional y la posición predeterminada a 260 milímetros.Compruebe el estado del controlador de temperatura, para asegurarse de que la temperatura está a aproximadamente 37 grados centígrados, del sensor atómico. Compruebe la estabilidad de todo el sistema dos veces ejecutando directamente el programa sin cargar muestras para medir las señales del soporte de muestra vacío. Para magnetizar las muestras, utilice suavemente pinzas para sacar la muestra del soporte y colóquela en la etapa de magnetización durante dos minutos.A continuación, vuelva a colocar la muestra en el portacuchillas y centrifugar a 335,4 g durante 20 minutos. Retire las partículas magnéticas no específicamente unidas. A continuación, cargue la muestra en el motor con pinzas.Haga clic en Bloquear en el panel frontal para ejecutar el programa. Mientras tanto, utilice pinzas para cargar otra muestra en el soporte y colóquela en la centrífuga. Haga que el lado de vidrio recubierto se enfrente al centro de la centrífuga e inicie la centrifugación a 335,4 veces g durante cuatro minutos.Cuando el motor vuelva a cero, después de aproximadamente cinco minutos, haga clic en Guardar en el panel frontal. Utilice cuidadosamente pinzas para transferir una muestra del motor al soporte de la centrífuga. Aplique una fuerza más fuerte aumentando la velocidad centrífuga en 100 rpm o un tamaño de paso similar.Cambie la muestra por la centrífuga. Procesar alternativamente para aumentar gradualmente la fuerza cada vez. Se obtiene un espectro de fuerza completo después de 10 a 12 puntos de datos.Cuando terminen todos los experimentos planificados, apague el equipo y continúe en el orden opuesto mientras se encendió. Retire las muestras del soporte y sumerjalas en etanol para su limpieza y uso futuro. Limpie el soporte de muestra con acetona en caso de contaminación magnética del cordón.En este protocolo, el complejo ribosoma fue inmovilizado en la superficie, a través del extremo de cinco primos del ARNm, y hizo que el lado de cinco y tres primos fuera fácilmente accesible para las reglas de ADN de sondeo. Cuando el vinculador para el lado de cinco primos tenía más de 50 timinas, se detectó una señal magnética fuerte, lo que indica una formación exitosa de dúplex de ADN/ARNm. Al variar el número de nucleótidos en el ADN, se logró la correlación de la fuerza de disociación con la longitud dúplex para los lados de tres y cinco primos, respectivamente.Los resultados de la translocación normal de MF-Pre a MF-Post, en ausencia de antibióticos, muestran que el ribosoma se movió por tres nucleótidos hacia el extremo triple en ambos lados. MF-Pre transportó un fMet-tRNA y un ARN-TRNA de vencilaco en los sitios P y A, respectivamente, mientras que MF-Post transportó fMet-tRNA y fenilalanina-tRNA en los sitios E y P, respectivamente, con un sitio A vacante. Sin embargo, cuando ambos ácido fusídico y antibióticos adiomicina estaban presentes, el ribosoma movido por sólo un nucleótido en el lado de cinco primos, pero dos nucleótidos en el lado de tres primos.Después de lavar los antibióticos, se produjo la translocación normal, como lo demuestran tres movimientos de nucleótidos de los lados de cinco y tres primos. Al magnetizar la muestra, la superficie recubierta debe acercarse y dejar el imán verticalmente. Y la eliminación de las partículas magnéticas no ligadas específicamente es muy importante para la precisión y la calidad de los datos.Nuestra técnica proporciona una alta resolución y una forma generalmente aplicable de investigar el desplazamiento molecular del ácido nucleico que se encuentra ampliamente en la biología molecular.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Investigación

Bioquímica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para el aislamiento de ARN de células endoteliales in vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Estudio de transferencia de energía de fluorescencia de molécula única de síntesis de proteínas ribosómicas

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color para estudiar la interacción proteína-proteína y la dinámica de proteínas en células vivas

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Espectroscopia de CD para estudiar las interacciones ADN-proteína

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...