Name: dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution
Uploaded: 2019-07-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM111452, Y.W., S.X.) tarafından desteklenmektedir. Y. W. Welch Vakfı (E-1721) desteğini onaylar.

1. ribozom kompleksleri hazırlanması
<ol><li>TAM10 tampon, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM mg (OAc)2, 30 mm NH4CL, 70 mm KCL, 5 mm EDTA, 7 mm BME (2-mercaptoethanol) ve% 0,05 Tween20 oluşur. 1.000</li>
	<li>Tablo 1' de listelenen beş karışımlar hazırlayın. Not: ribozom MRE600 gerinim11oldu. EF-tu: uzama faktörü termo kararsız. EF-TS: uzama faktörü termo istikrarlı. GTP: guanozin trifosfat. PEP: phospho (enol) pyruvate.</li>
	<li>Ribozom kom...

<ol>
	<li>Noller, H. F., Lancaster, L., Mohan, S., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+structural+dynamics+in+translocation:+yet+another+functional+role+for+ribosomal+RNA.">Ribosome structural dynamics in translocation: yet another functional role for ribosomal RNA.</a> Quarterly Review of Biophysics. 50, 12 (2017).</li><li>Zhou, J., Lancaster, L., Donohue, J. P., Noller, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+ribosome+hands+the+A-site+tRNA+to+the+P+site+during+EF-G-catalyzed+translocation.">How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation.</a> Science. 345, 1188-1191 (2014).</li><li>Grentzmann, G., Ingram, J. A., Kelly, P. J., Gesteland, R. F., Atkins, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual-luciferase+reporter+system+for+studying+recoding+signals.">A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals.</a> RNA. 4, 479-486 (1998).</li><li>Fang, Y., Treffers, E. E., Li, Y., Tas, A., Sun, Z., van der Meer, Y., de Ru, A. H., van Veelen, P. A., Atkins, J. F., Snijder, E. J., Firth, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+-2+frameshifting+by+mammalian+ribosomes+to+synthesize+an+additional+arterivirus+protein.">Efficient -2 frameshifting by mammalian ribosomes to synthesize an additional arterivirus protein.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 2920-2928 (2012).</li><li>Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+excursions+during+mRNA+translocation+mediate+broad+branching+of+frameshift+pathways.">Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways.</a> Cell. 160, 870-881 (2015).</li><li>Shirokikh, N. E., Alkalaeva, E. Z., Vassilenko, K. S., Afonina, Z. A., Alekhina, O. M., Kisselev, L. L., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Research. 38, 15 (2010).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+pathways+of+-1+translational+frameshifting.">Dynamic pathways of -1 translational frameshifting.</a> Nature. 512, 328-332 (2014).</li><li>De Silva, L., Yao, L., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+and+sequence-specific+noncovalent+binding+forces+of+DNA.">Well-defined and sequence-specific noncovalent binding forces of DNA.</a> Journal of Physical Chemistry B. 117, 7554-7558 (2013).</li><li>Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+DNA+rulers+reveal+an+"mRNA+looping"+intermediate+state+during+ribosome+translocation.">Dual DNA rulers reveal an "mRNA looping" intermediate state during ribosome translocation.</a> RNA Biology. 15, 1392-1398 (2018).</li><li>Tsai, T. W., Yang, H., Yin, H., Xu, S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+"-1"+and+"-2"+ribosomal+frameshiftings+revealed+by+force+spectroscopy.">High-efficiency "-1" and "-2" ribosomal frameshiftings revealed by force spectroscopy.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1629-1635 (2017).</li><li>Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+study+of+ribosome+hierarchic+dynamics+at+the+peptidyl+transferase+center.">Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center.</a> Biophysical Journal. 99, 3002-3009 (2010).</li><li>Garcia, N. C., Yu, D., Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+atomic+magnetometer+at+body+temperature+for+magnetic+particle+imaging+and+nuclear+magnetic+resonance.">Optical atomic magnetometer at body temperature for magnetic particle imaging and nuclear magnetic resonance.</a> Optics Letters. 35, 661-663 (2010).</li><li>Yao, L., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range,+high-resolution+magnetic+imaging+of+nanoparticles.">Long-range, high-resolution magnetic imaging of nanoparticles.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5679-5682 (2009).</li><li>Kurkcuoglu, O., Doruker, P., Sen, T. Z., Kloczkowski, A., Jernigan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+structure+controls+and+directs+mRNA+entry,+translocation+and+exit+dynamics.">The ribosome structure controls and directs mRNA entry, translocation and exit dynamics.</a> Physical Biology. 5, 046005 (2008).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+uses+two+active+mechanisms+to+unwind+messenger+RNA+during+translation.">The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation.</a> Nature. 475, 118-121 (2011).</li><li>Jacks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+ribosomal+frameshifting+in+HIV-1+gag-pol+expression.">Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression.</a> Nature. 331, 280-283 (1988).</li><li>Schuwirth, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+bacterial+ribosome+at+3.5+&#197;+resolution.">Structures of the bacterial ribosome at 3.5 &#197; resolution.</a> Science. 310, 827-834 (2005).</li><li>Jia, H., Wang, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+force+spectroscopy+reveals+ribosomal+motion+at+sub-nucleotide+steps.">Super-resolution force spectroscopy reveals ribosomal motion at sub-nucleotide steps.</a> Chemical Communications. 54, 5883-5886 (2018).</li></ol>

Bizim çift cetvel tahlil, manyetik boncuklar iki temel roller oynar. İlk olarak, onlar güç dönüştürücülerinin olarak hizmet vermektedir, çünkü merkezkaç kuvveti onların batmaz kütle ile orantılı. İkincisi, boncuklar, şu anda en doğru manyetik sensör olan atomik Manyetometre ile algılanan sinyal taşıyıcılarıdır. Mekanik manipülasyon ve manyetik algılamayı birleştiren fırmalar tekniği, DNA cetvellerinin temeli olan kritik dağılma kuvvetlerine göre çok sayıda moleküler etkileşimi ç...

Biomoleküler deplasman, ilgili biyolojik fonksiyonların mekanizmasını inceleyerek temel bir parametredir. Belirli bir örnek, ribozom 'in haberci RNA(mRNA) üzerinde tam olarak üç nükleotides (NT) ile hareket ettiği, normal olarak ve bir, iki ya da diğer NT numaralarıyla üç hariç, bir,2, ribozom geçiş konumdur. frameshifting. Bu nedenle, farklı adım boyutlarını ayırt etmek için bir moleküler cetvel sistemi tek NT çözünürlüğü gereklidir. Daha büyük bir zorluk hem giriş hem de çıkış taraflarında ribozom hareketini araştırmanız. Başka bir deyişle, sadece bir çift cetvel sistemi ile biz mRNA düzgün ribosome üzerinden dişli olup olmadığını ortaya çıkarmak mümkün olacak, ya da iki tarafın farklı adım boyutları içinde bir bükülen veya ilmekledi mRNA konformasyon yol olan ara adımlar vardır ribozom.
Ribozom (mRNA 3 ' sonu) çıkış tarafında farklı adımlar çözme ilk zorluk gidermek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Çift Lusiferaz tahlil farklı okuma çerçeveleri ortaya çıkan farklı proteinlerin oranlarını ölçmek tarafından giderir3,4. Sadece mRNA 3 ' End için geçerlidir ve böylece translocation tam bir resim sağlamak için yetersiz. Kütle spektrometresi, ilgili kod yeniden düzenlemelerinin sonucu olarak farklı peptit parçalarını analiz edebilir5. Ama mRNA üzerinde ribozom hamle kaç NT için tespit edemez. Toe-baskı tahlil ribozom doğru mRNA dönüştürme 3 '-distal ucunda astar ters transkriptaz kullanan başka bir ortak yöntemdir6. Ancak, ribosome giren mRNA 5 ' End için geçerli değildir. Tek molekül yaklaşımlar ve floresan yöntemleri7de dahil olmak üzere diğer teknikler, tek NT çözünürlüğü elde etmek zordur.
Biz benzersiz ribosome-mRNA kompleksler içinde açılan mRNA giriş ve çıkış konumlarını hem de belirleyebilirsiniz çift DNA cetvel assay geliştirdik.  Cetvel DNAS, mRNA 'nın hangi ucunda olursa olsun, ribosome tarafından ortaya çıkarılan mRNA ile belirli sayıda basepairs (BP) ' nin dubleksler formunu içeren DNA oligomerdir. BP numaraları daha sonra translocation sırasında mRNA üzerindeki ribozom konumunu kesin olarak ortaya çıkarır. Dubliklerin BP numaraları, kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (firmalar)8' den elde edilen kritik ayrışma güçleri tarafından belirlenir. 2-3 pN kuvvet belirsizlik ile, kritik güçler tek NT çözünürlük sunmak için yeterlidir. DNA cetvelleri üzerinde bir bağlayıcı molekül uygulayarak, ribozom tarafından mRNA sterollerdir engellenmiş yan probed olabilir. Farklı ribozomal kesimleri böylece doğru çözülebilir. Biz başarıyla translokasyon9sırasında antibiyotikler tarafından sıkışmış mRNA benzersiz bir ilmekledi uyum ortaya koymuştur ve bir kaygan mRNA sırası10üzerinde birlikte farklı okuma çerçeveleri çözüldü. Bu makalede, ribozom kompleksleri hazırlanması, cam slaytlar yüzey functionalization, ribozom kompleksleri immobilizasyonu ve manyetik etiketli DNA cetvel ile hibridizasyon dahil çift cetvel tahlil, ayrıntılarını açıklar moleküller, Manyetik algılama ve kuvvet spektrum analizi FIRMALARı tarafından.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1412px;" width="1411">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Styrene Strip</td>
			<td style="width:239px;">City of Industry</td>
			<td style="width:161px;">MS-861</td>
			<td style="width:795px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:217px;">Glass slides</td>
			<td style="width:239px;">Evaporated Coatings</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>60.0 &#215; 4.0 &#215; 0.3 mm3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Acetic acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
			<td style="width:239px;">UCT specialties</td>
			<td style="width:161px;">21400088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mPEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">154-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Biotin-PEG-SVA</td>
			<td style="width:239px;">Laysan Bio</td>
			<td style="width:161px;">152-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Epoxy glue</td>
			<td style="width:239px;">Devcon</td>
			<td style="width:161px;">31345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Fusidic Acid</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">F0756-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Neomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1458009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Viomycin Sulfate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">1715000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Hygromycin</td>
			<td style="width:239px;">invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10687-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tris-HCl</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">T5941-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Magnesium acetate</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M5661-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Ammonium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">A9434-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P9333-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">EDTA</td>
			<td style="width:239px;">GIBCO</td>
			<td style="width:161px;">774750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M6250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Tween20</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1379-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">GTP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">G8877-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">PEP</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P7127-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Pyruvate Kinase</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">P1506-5KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Sucrose&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:161px;">S7903-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td style="width:239px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:161px;">11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">mRNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">133899727</td>
			<td>5&#8242;-Bio- CAA CUG UUA AUU AAA UUA AAU UAA AAA GGA AAU AAAA AUG UUU AAU UUU UUA GGG CGC AAU CUA CUG CUG AAC UC-3&#8242;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468630</td>
			<td>3&#697;- TAA TTT AAT TTA ATT TTT CGA AAU AT50/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">164845370</td>
			<td>3&#697;-AAT TTA ATT TTT CCT TTA AAA AT50/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">157468628</td>
			<td>3&#697;-AAA ATC CCG CGT TAG AAC UGG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">163472705</td>
			<td>3&#697;-CCG CGT TAG ATG ACG AGA ACG GG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678130</td>
			<td>3&#697;-AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678131</td>
			<td>3&#697;-T AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678132</td>
			<td>3&#697;-TT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#697;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">DNA Oligo</td>
			<td style="width:239px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:161px;">138678133</td>
			<td>3&#697;-GTT AGA TGA CGA CTT CTC GGG/TEGBio/-5&#8217;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5427R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Micro Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:239px;">Hitachi</td>
			<td style="width:161px;">CS150FNX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Lock-in Amplifier</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">SR830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Laser</td>
			<td style="width:239px;">Newport</td>
			<td style="width:161px;">TLB-6918-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Function generator</td>
			<td style="width:239px;">Stanford Research Systems</td>
			<td style="width:161px;">DS345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Photo detectors</td>
			<td style="width:239px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:161px;">DET36A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual dna rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution

Ribozom translokasyon tam olarak üç nükleotid (NT) tarafından mRNA üzerinde ribozomal hareket anlamına gelir, hangi protein sentezi merkezi adımdır. Mekanizmasını araştırmak için iki temel teknik şart vardır. İlki, ribozom 'ın 3 NT 'den başka tarafından hareket ettiği frameshifting 'den normal translokasyon çözümünü çözebilecek tek NT çözünürlüğüyle olur. İkincisi, translocation tüm resmi aydınlatmak için mRNA giriş ve çıkış kenarlarını prob yeteneğine sahiptir. Biz DNA-mRNA duplexes kritik ayrışma güçleri dayanmaktadır çift DNA cetvel tahlil rapor, kuvvet kaynaklı kalıntı magnetizasyon spektroskopisi (firmalar) ile elde.  2-4 PN kuvvet çözünürlüğü ile çift cetvel tahlil farklı translokasyon adımlarını ayırt etmek için yeterlidir. Uzun bir bağlayıcı yoklama DNAs üzerinde uygulayarak, mRNA pozisyonu her iki taraf için belirlenecek şekilde ribosome karşı tarafında mRNA ulaşabilir. Bu nedenle, Çift cetvel tahlil benzersiz ribozom translocation araştırmak için uygundur, ve genel olarak nüklik asit hareketi. Biz bir ilmekledi mRNA konformasyonu ve frameshifting normal translokasyon çözüldü belirtilen temsili sonuçlar gösterir.

Şekil 1 , önemli bileşenlerin algılama düzenini ve fotoğraflarını gösterir. Manyetik algılama, tarama düzenini kullanarak atomik Manyetometre ile elde edilir (Şekil 1A)13. Numune, doğrusal bir motora monte edilmiş bir çubuk üzerine yerleştirilir. Motor, numuneyi Manyetik kalkan içindeki atomik sensörüne aktarır, sonra da boşaltılması için orijinal siteye geri döner. Atomik magnetometre, numune ta...

Watch this Scientific Journal Video about Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution at JoVE.com

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Çift DNA cetvel tahlil ribozom translocation sırasında mRNA konumunu belirlemek için geliştirilmiştir, hangi oluşmuş DNA-mRNA dubliklerin ayrışma güçleri dayanır. Tek nükle çözünürlüğü ve mRNA 'nın her iki ucunda ulaşmanın yeteneği ile, ribozom translokasyon ve prob diğer nüklik asit yerleşimleri için mekanik öngörüler sağlayabilir.

Çift DNA cetvelleri tek Nükledotid çözünürlüğe sahip Ribosome translocation mekanizmasını Incelemek için

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Çift DNA cetveli testi ribozom translokasyonu için mekanistik kavrayışlar sağlayabilir ve diğer nükleik asit yer değiştirmelerini inceleyebilir. Çift DNA cetveli testimiz şu anda ribozom komplekslerinde mRNA'nın giriş ve çıkış kenarlarını tek nükleotit çözünürlüğü ile objektif olarak inceleyebilen tek yöntemdir. Benzer yöntemler de DNA bağlama gücü ve keforik ilaçların seçiciliğini ölçmek için uygulanır.Yöntemin görsel gösterimi, tekniğimizin avantajlarını sezgisel olarak göstermemiz ve diğer araştırmacıların daha fazla uygulamaya dönüştürmelerine yardımcı olmak için iyi bir şanstır. Başlamak için, iki milimetre üç milimetre üç milimetre boyutları ile merkezinde bir küp sondaj tarafından bir stiren şerit ile iyi bir plastik örnek olun. Daha sonra, epoksi kullanarak, alt yüzeye yaklaşık beş milimetre uzunluğunda biyotin kaplı cam bir parça tutkal.Numune kuyusuna mililitre streptavidin sulu çözelti başına 0,25 miligram lık 20 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra tam10 arabellek ile iki kez iyi yıkın. Antibiyotik olmadan ribozom kompleksleri immobilize etmek için, ilk iyi örnek tampon kaldırmak ve örnek kuyuya 0,1 mikromografi MF-Pre veya MF-Post ribozom kompleksi 20 mikrolitre ekleyin.Bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatın ve tam10 tamponuyla bir kez durulayın. Ribozom kompleksi şimdi mRNA beş-prime end biotin ile yüzeyde streptavidin ile bağlanır. Antibiyotik kullanarak deney için, dört milimolar neomisin bir mikrolitre ile MF-Pre kompleksinin dokuz mikrolitre kuluçka, 10 dakika boyunca 37 derece santigrat.Sonra bir tüp 0.6 mikrolitre 60 mikrolitre, 0.8 mikrolitre 100 mikromolar GTP, 0.8 mikrolitre 100 milimolar PEP, 0.3 mililitre mililitre pirüferkiaz başına 1.3 mililitre, 6.43 mikrolitre TAM10 tampon ve beş milimolar fudik asit bir mikrolitre. 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yat. Sonra iki karışımı birleştirmek ve ek bir beş dakika için 37 santigrat derece kuluçka.Benzer diğer antibiyotik deneyleri yürütmek, konsantrasyonları ile 0.2 milimolar viomisin, 0.4 milimoler higromisin B, ve 0.25 milimolar fusidik asit. Çerçeve kaydırma çalışması için, kaygan motifi içeren MFNF-Pre kompleksleri için kuluçka tekrarlayın, U6A. Fusidik asit artı neomisin antibiyotikler dahil.Hibritleştirme sürecinin tamamlanmasını sağlamak için yeterli zaman gereklidir. Ayrıca homosteady bir sistem korumak için gerçek bir mol sodyum klorür ile TAM10 tampon kullanılması tavsiye edilir. Kuluçkadan sonra, arabelleği örnekten iyi çıkarın.Bir mikromolar biyotinylated DNA iplikçik 20 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka. Sabahları, oluşan DNA/mRNA dubleksini TAM10 tamponuyla bir kez durula. Arabelleği örnekten iyi çıkarın.Daha sonra numuneye mililitre başına 0,5 miligram lık 20 mikrolitre streptavidin kaplı manyetik boncuk ekleyin ve iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, numuneyi dikkatlice bir tutucuya yerleştirin ve serbest manyetik parçacıkları yüzeyden beş dakika boyunca 84 kez g olarak çıkarmak için bir santrifüje yerleştirin. Lazeri aç.Sonra güç düğmesine basın. Hassasiyeti 500 milivolta ayarlayın ve atomik manyetometreyi ısıtmak ve stabilize etmek için yaklaşık iki saat bekleyin. Atomik manyetometreyi ayarlamak için, enstrüman kontrol yazılımını çalıştırın ve Motor hareket modunu Gürültü ve varsayılan konumu sıfıra ayarlayın.Ön panelde Kilit tuşuna basın. Hassasiyeti 200 milivolta ayarlayın. Lazerin akımını ve voltajını ayarlayın ve en iyi sinyal çözünürlüğü için uygun rezonans tepe noktasını ve sinyal-gürültü seviyesini bulun.Ön panelde Sweep tuşuna basın. Genlik-genişlik oranının 0,5'in üzerinde olduğundan ve faz değerinin genişliği 170 hertz'den az olan beş dereceden daha küçük olduğundan emin olun. Frekansını kilitlemek için lazerin geri bildirimine başka bir SR530 kilitleme amplifikatörünün çıkışını takın.Fiş fonksiyon jeneratör ATF20B zirveye 500 milivolt zirve bir kare dalga girişi, 100 milihertz manyetik sinyal akım dönüştürmek için referans sinyali olarak. Ardından işlev jeneratöründen fişi çekin. Motor hareket modunu 260 milimetreye iki yönlü ve varsayılan konuma ayarlayın.Sıcaklık yaklaşık 37 santigrat derece, atomik sensör olduğundan emin olmak için sıcaklık kontrol durumu kontrol edin. Boş numune tutucunun sinyallerini ölçmek için numuneleri yüklemeden programı doğrudan çalıştırarak tüm sistemin stabilitesini iki kez kontrol edin. Örnekleri manyetize etmek için, numuneyi tutucudan çıkarmak için cımbızları yavaşça kullanın ve iki dakika boyunca manyetizasyon aşamasına yerleştirin.Daha sonra numuneyi numune tutucuya geri koyun ve 20 dakika boyunca 335,4 kez g santrifüj edin. Özel olarak bağlı olmayan manyetik parçacıkları çıkarın. Bir sonraki yük numuneyi cımbızla motora yükleyin.Programı çalıştırmak için ön panelde Kilitle'yi tıklatın. Bu arada tutucuya başka bir örnek yüklemek ve santrifüj içine yerleştirmek için cımbız kullanın. Kaplamalı cam tarafı santrifüjün ortasına doğru yapın ve santrifüje dört dakika boyunca 335,4 kez g'den başlayın.Motor sıfıra geldiğinde, yaklaşık beş dakika sonra ön panelde Kaydet'i tıklatın. Motordan bir numuneyi santrifüj tutucuya aktarmak için cımbızları dikkatlice kullanın. Santrifüj hızını 100 rpm veya benzer bir adım boyutuyla artırarak daha güçlü bir kuvvet uygulayın.Örneği santrifüjle değiştirin. Yavaş yavaş her zaman kuvvet artırmak için dönüşümlü olarak süreci. 10-12 veri noktasından sonra tam bir kuvvet spektrumu elde edilir.Planlanan tüm denemeler tamamlandığında, ekipmanı kapatın ve açık olduğu gibi ters sırada devam edin. Numuneleri tutucudan çıkarın ve temizlik ve ileride kullanmak için etanoliçine batırın. Manyetik boncuk kontaminasyonu durumunda numune tutucuyu aseton ile temizleyin.Bu protokolde, ribozom kompleksi mRNA'nın beş asal ucu üzerinden yüzeyde hareketsiz hale getirilmiş ve probing DNA cetvelleri için hem beş asal hem de üç asal tarafı kolayca erişilebilir hale getirmiştir. Beş asal tarafın bağlantı layıcısı 50 timinden daha uzun olduğunda, DNA/mRNA duplekslerinin başarılı bir şekilde oluşumunu gösteren güçlü bir manyetik sinyal saptandı. DNA'daki nükleotid lerin sayısı değiştirilerek, üç asal ve beş asal kenarlar için ayrışma kuvvetinin dupleks uzunluğuile korelasyonu sağlanmıştır.MF-Pre'den MF-Post'a normal translokasyon sonuçları, antibiyotik yokluğunda, ribozomun her iki tarafta ki üç asal uca doğru üç nükleotit tarafından hareket ettiğini göstermektedir. MF-Pre, P ve A sitelerinde sırasıyla bir fMet-tRNA ve fenilalanin-tRNA taşırken, MF-Post sırasıyla E ve P sitelerinde fMet-tRNA ve fenilalanin-tRNA'yı boş bir A alanı ile taşımıştır. Ancak, hem fusidik asit hem de adiomisin antibiyotikleri mevcut olduğunda, ribozom beş asal tarafta sadece bir nükleotit, üç asal tarafta iki nükleotit tarafından hareket etti.Antibiyotikler ipdikten sonra, normal translokasyon meydana geldi, hem beş-prime ve üç-prime tarafüç nükleotit hareketleri ile kanıtlanan. Numuneyi manyetize ederken, kaplamalı yüzey yaklaşmalı ve mıknatısı dikey olarak terk etmelidir. Ve özel olarak bağlı olmayan manyetik parçacıkların çıkarılması veri doğruluğu ve kalitesi için çok önemlidir.Tekniğimiz, moleküler biyolojide yaygın olarak karşılaşılan nükleik asitin moleküler yer değiştirmesini araştırmak için yüksek çözünürlük ve genel olarak uygulanabilir bir yol sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...