Name: use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00
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作者感谢德克萨斯大学奥斯汀分校的约书亚·贝克汉姆博士为分子对接提供技术支持。这项研究部分得到台湾科技部(MOST107-2320-B-037-002至C.-J.L.和L.T.L.)的资助;MOST106-2320-B-038-021 和 MOST107-2320-B-038-034-MY3 到 L.T.L.)。

注:所有细胞培养和病毒感染必须在与所处理样品的生物安全水平相适应的经认证的生物安全罩中进行。两种单宁类小分子化学酸(CHLA)和双核蛋白(PUG),被观察有效阻止CVA16感染9,被用作候选抑制剂的例子。关于病毒学技术、病毒传播、病毒牙斑测定以及斑块形成单元(PFU)或感染多重性(MOI)的概念等基本原则,读者参考参考文献10。
1. ?...

<ol>
	<li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult.">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li><li>Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A16+infection.">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity:+implications+for+particle+expansion,+receptor+binding,+and+immunogenicity.">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li><li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71.">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71.">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7,+A14,+and+A16+and+enterovirus+71.">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li><li>Lin, L. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry.">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187 (2013).</li><li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding.">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7, 162 (2018).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds.">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).</li><li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK+6:+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes.">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor.">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 6, 65 (2017).</li><li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes.">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li></ol>

在本报告中,我们描述了有助于识别针对病毒进入的抗病毒候选项,特别是针对非包络的CVA16的抗病毒候选方案。检测方法旨在剖析病毒进入过程中的早期事件,有助于阐明检测剂抗病毒活性的作用机制和潜在靶点。"药物添加时间测定"允许广泛确定测试化合物的潜在目标,例如未感染的宿主细胞(预处理分析)、病毒颗粒或其与宿主细胞表面的相互作用(共增分析)),或病毒复制阶段(感染后分析)中受病毒感...

手足口病 (HFMD) 是一种最常见的疾病,由病毒病毒 A16 (CVA16) 和肠道病毒 71 (EV71) 在幼儿中引起。最近,在整个亚太地区,CVA16引起的手足口病显著上升。虽然症状可能是轻微的,严重的并发症可能发生,影响大脑和心脏,与潜在的死亡1,2。目前,CVA16没有获得许可的抗病毒疗法或疫苗接种,因此迫切需要制定抗病毒战略,以遏制未来的疫情和相关并发症。
CVA16 是一种非包络病毒,其病毒由五角星组装而成,每个病毒都含有 4 种结构蛋白,即 VP1、VP2、VP3 和 VP4。五角星中每个五折轴的包围是一个"Canyon"区域,它表现出抑郁症,并以其在受体结合3中的作用而闻名。在这个峡谷的底部是一个疏水口袋在VP1区域,其中包含一个天然脂肪配体名为狮身人面像(SPH)。细胞受体,如人P选择糖蛋白配体1(PSGL-1)和清除受体B类成员2(SCARB2),已被建议在病毒结合中发挥作用,取代这种配体,导致与帽状的变化随后将病毒基因组喷射到宿主细胞4,5,6。识别阻止病毒进入过程中连续事件的可能抑制剂可以提供针对CVA16感染的潜在治疗策略。
病毒生命周期中的步骤可以通过实验方法作为帮助识别特定模式的抗病毒药物的目标进行剖析。药物添加时间分析检查病毒感染期间不同时间的药物治疗效果,包括进入前(在病毒感染之前添加)、进入(与病毒感染并发添加)和进入后(在病毒感染)7.可以通过定量在每个治疗条件下形成的病毒斑块数量,使用标准斑块测定来评估其影响。基于流细胞学的病毒结合测定确定药物是否阻止病毒附着细胞的附着。这是通过将温度从37°C(大多数人类病毒感染发生的地方)转移到4°C来实现的,其中病毒能够结合到宿主细胞表面,但不能进入细胞7。然后,通过免疫染色对病毒抗原进行定量,并通过流动细胞学进行评估,从而对细胞膜结合的病毒颗粒进行量化。另一方面,病毒失活检测有助于评估药物与游离病毒颗粒的潜在物理相互作用,屏蔽或中和病毒,或导致聚集或构象变化,使它们失去活性在感染8,9期间与宿主细胞表面的后续相互作用。在这个实验中,病毒接种允许先用药物孵育,然后再被稀释,在感染宿主细胞单层并进行标准斑块测定之前,将药物分三子。最后,分子对接是一个强大的工具,用于预测病毒表面潜在的药物相互作用位点,包括来自包络病毒的病毒糖蛋白和非包络病毒的病毒帽蛋白,通过使用计算算法。这有助于机械地确定药物作用模式的目标,并提供有用的信息,可以通过下游检测进一步验证。
我们最近使用上述方法识别抗病毒化合物,有效阻止非包络的CVA169感染。本文将介绍并讨论所使用的详细协议。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">AL-158127-500G</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Anti-VP1 antibody</td>
			<td style="width:205px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:171px;">MAB979</td>
			<td style="width:232px;">Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Coulter Cytometer</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corina</td>
			<td style="width:205px;">Molecular Networks GmbH</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C3886-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">11995-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">In vitro toxicology assay kit, XTT-based</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">TOX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">M0512-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PyMol</td>
			<td style="width:205px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:205px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16

抗病毒测定,机械检查病毒进入是相关的,以辨别哪个步骤评估的剂是最有效的,并允许识别候选病毒进入抑制剂。在这里,我们介绍通过靶向病毒颗粒或早期病毒进入中的具体步骤来识别能够阻止非包络的coxsackie病毒A16(CVA16)感染的小分子的实验方法。分析包括药物添加时间分析、基于流细胞学的病毒结合测定和病毒失活测定。我们还提出了一种分子对接协议,利用病毒帽蛋白来预测抗病毒化合物靶向的潜在残留物。这些检测应有助于识别对病毒进入作用的候选抗病毒药物。未来的方向可以探索这些可能的抑制剂,以进一步的药物开发。

药物添加时间测定如图1所示,显示了使用小分子CHLA和PUG治疗对CVA16感染的影响,无论是病毒输入前(预治疗),病毒进入(共添加),还是病毒后进入(感染后)。无论是病毒感染前对宿主细胞的前期处理(图1A),还是在感染后治疗(图1C),这两种小分子对CVA16的感染性只产生轻微影响。相比之下,CHLA 和 PUG 在共增治疗中有效...

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Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

利用病毒进入检测和分子对接分析鉴定抗病毒候选药物,对抗Coxsackie病毒A16

该协议的目的是说明与病毒进入相关的不同检测,可用于识别候选病毒进入抑制剂。

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

该协议可以通过机制驱动的方法帮助发现潜在的抗病毒小分子。补充检测的时间决定了小分子在感染的哪个步骤表现出其抗病毒活性。分子对接预测小分子和病毒蛋白之间的相互作用。为了评估药物在病毒感染之前对宿主细胞的影响，在12孔板中以每井电镀密度的2倍10至第五细胞为种子RD细胞。在5%的二氧化碳培养箱中孵育细胞在37摄氏度下过夜。第二天早上，用三氧化碳的试验化合物，在一毫升基底介质中以无毒浓度处理 RD 单层的每一个井，为期一到四个小时。在治疗孵化结束时，用1毫升PBS清洗细胞，然后在每井300微升基基中加入50个斑块形成单位的病毒，每井1小时，每15分钟摇动一次。在感染孵育结束时，用PBS清洗细胞，用含有0.8%甲基纤维素的一毫升新鲜基底介质覆盖细胞。在细胞培养培养箱中72小时后，用两毫升PBS清洗每井，用每井37%甲醛的0.5毫升固定细胞15分钟。在固定结束时，用PBS清洗孔，用每孔0.5毫升的0.5%水晶紫罗兰溶液染色细胞。两分钟后，用温和的水流清洗水井，让盘子风干。然后将板放在白灯盒上，用于计数，并根据公式计算感染的考克斯病毒细胞的百分比。有关分子对接分析，请从 PubChem 下载测试化合物的 3D 分子。如果分子没有上传 3D 结构，请下载 2D 结构或使用 SMILE 字符串序列通过适当的分子程序将结构转换为 3D 分子。接下来，从RCSB蛋白质数据库下载病毒生物组装单元。使用适当的生物计算程序，从蛋白质数据库文件中删除溶剂，使用 Dunbrack 2010 Rotamer 库的数据替换不完整的侧链，并像先前报告的结构中添加氢气和电荷。要将测试化合物停靠到准备好的病毒单元上，请将测试化合物文件上传到加州大学旧金山奇美拉分校作为配体，并选择整个准备好的病毒蛋白作为受体进行盲对接。对于额外的对接，请通过进一步减小搜索量，将对接站点限制在病毒蛋白上，以关注从盲对接结果中得出的感兴趣区域。然后将对接文件上传到适当的分子图形系统中，以分析绑定模式的位置。选择配体以查找从化合物到病毒蛋白的极性接触，确定具有任何原子选项的极性接触。在这个具有代表性的实验中测试的两个小分子，无论是病毒感染前的宿主细胞的预处理，还是感染后治疗，都只对考克斯克病毒 A16 感染产生轻微的影响。相比之下，分子在结合治疗中有效消退了80%以上的感染，这表明，当两种化合物在感染过程中与宿主细胞表面的病毒颗粒同时出现时，它们最有效。基于流细胞学的结合分析证实，两种单宁通过防止病毒颗粒与宿主细胞结合，防止了囊录病毒 A16 感染性进入。单宁的分子对接表明，它们都预测在考克斯克病毒五角细胞的峡谷区域结合，就在口袋入口的正上方，持有口袋因子，对调节考克斯病毒结合和进入宿主细胞起着重要作用。在这些表面投影中，可以观察到口袋入口周围小分子的极性接触中预测的独特残留物，其中芦笋-85、莱辛-257和芦笋-417是两个单宁之间的共同值。对于分子对接，在对结合帧进行排名时，需要考虑病毒蛋白的拓扑结构。其他实验可能包括测试化合物在重组病毒上的抗病毒活性，对氨基酸进行突变，以验证其对药物疗效的重要性。

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