Name: use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00
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Gli autori sono grati al Dr. Joshua Beckham presso l'Università del Texas ad Austin per il supporto tecnico con attracco molecolare. Questo studio è stato in parte sostenuto da finanziamenti del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 a C.-J.L. e L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 e MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).

NOT:</</c0> Tutte le colture cellulari e le infezioni da virus devono essere condotte in cappe di biosicurezza certificate appropriate per il livello di biosicurezza dei campioni trattati. I due tannini-classe di piccole molecole di acido chebulagico (CHLA) e punicalagin (PUG), che sono stati osservati per bloccare in modo efficiente l'infezione CVA169, sono utilizzati come esempi di agenti inibitori candidati. Per i principi di base nelle tecniche di virologia, propagazione del virus, de...

<ol>
	<li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult.">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li><li>Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A16+infection.">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity:+implications+for+particle+expansion,+receptor+binding,+and+immunogenicity.">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li><li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71.">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71.">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7,+A14,+and+A16+and+enterovirus+71.">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li><li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolyzable+tannins+(chebulagic+acid+and+punicalagin)+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread.">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li><li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry.">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187 (2013).</li><li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding.">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7, 162 (2018).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds.">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).</li><li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK+6:+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes.">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor.">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 6, 65 (2017).</li><li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes.">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li></ol>

In questo rapporto, abbiamo descritto i protocolli che sono utili per l'identificazione di candidati antivirali che prendono di mira l'ingresso virale, in particolare contro il CVA16 non inviluppo. I test sono progettati in modo da sezionare i primi eventi durante l'ingresso virale, il che è utile per chiarire i meccanismi di azione e i potenziali obiettivi dell'attività antivirale degli agenti di prova. Il "saggio del tempo di aggiunta del farmaco" consente di determinare ampiamente il potenziale bersaglio dei compost...

La malattia della mano, dell'afta epizootica e della bocca (HFMD) è una malattia più comunemente causata dal coxsackievirus A16 (CVA16) e dall'enterovirus 71 (EV71) nei bambini piccoli. Recentemente in tutta la regione Asia-Pacifico, c'è stato un significativo aumento dell'HFMD indotto da CVA16. Mentre i sintomi possono essere lievi, possono verificarsi gravi complicazioni che colpiscono il cervello e il cuore, con potenziale fatalità1,2. Attualmente non sono disponibili terapie antivirali o vaccinazioni autorizzate per CVA16, per cui è urgente sviluppare strategie antivirali per frenare i futuri focolai e le relative complicanze.
CVA16 è un virus non inviluppo che ha un capside icosaedrio assemblato da pentamers che contengono ciascuno 4 proteine strutturali vale a dire VP1, VP2, VP3 e VP4. Intorno ad ogni asse di cinque volte nel pentamer è una regione 'canyon' che mostra come una depressione ed è nota per il suo ruolo nel legame recettore3. In fondo a questo canyon si trova una tasca idrofobica nella regione VP1 che contiene un ligando grasso naturale chiamato sphingosine (SPH). I recettori cellulari, come il ligando umano P selectin glicoprotein a 1 (PSGL-1) e il membro di classe B (SCARB2) del recettore scaventro, sono stati suggeriti per svolgere un ruolo nell'associazione virale spostando questo ligando che si traduce in cambiamenti conformazionali al successiva espulsione del genoma virale nella cellula ospite4,5,6. L'identificazione di possibili inibitori che bloccano gli eventi successivi nel processo di ingresso virale potrebbe fornire potenziali strategie terapeutiche contro l'infezione da CVA16.
Le fasi del ciclo di vita del virus possono essere sezionate attraverso approcci sperimentali come obiettivi per aiutare a identificare agenti antivirali specifici della modalità. Un'analisi del tempo di aggiunta di droga esamina l'effetto del trattamento farmacologico in momenti diversi durante l'infezione virale, tra cui l'ingresso preliminare (aggiunto prima dell'infezione da virus), l'ingresso (aggiunto in concomitanza all'infezione da virus) e il post-ingresso (aggiunto a seguito della infezione da virus)7. L'impatto può essere valutato utilizzando un saggio standard della placca quantificando il numero di placche virali formate in ciascuna delle condizioni di trattamento. L'andetto di legame virale basato sulla citometria del flusso determina se il farmaco impedisce l'attaccamento virale alle cellule ospiti. Ciò si ottiene spostando la temperatura da 37 gradi centigradi, alla quale si verifica la maggior parte delle infezioni da virus umani, a 4 gradi centigradi, dove i virioni sono in grado di legarsi alla superficie della cellula ospite ma non sono in grado di entrare nelle cellule7. Le particelle di virus legate alla membrana cellulare vengono quindi quantificate attraverso l'immunostaining contro gli antigeni virali e valutate in base alla citometria di flusso. L'analisi dell'inattivazione virale, d'altra parte, aiuta a valutare le potenziali interazioni fisiche del farmaco con particelle di virus libere, schermaturando o neutralizzando i virioni, o causando aggregazioni o cambiamenti conformazionali che li rendono inattivi per successive interazioni con la superficie della cellula ospite durante l'infezione8,9. In questo esperimento, l'inoculo virale è permesso di incubare prima con il farmaco prima di essere diluito per titolare il farmaco prima di infettare il monostrato della cellula ospite ed eseguire un saggio di placca standard8. Infine, l'aggancio molecolare è un potente strumento per prevedere potenziali siti di interazione farmacologica sulla superficie del virione, tra cui le glicoproteine virali dei virus avvolti e le proteine capside virali da virus non avvolti, utilizzando il computazionale Algoritmi. Questo aiuta a individuare meccanicamente meccanicamente i bersagli della modalità di azione del farmaco e fornire informazioni utili che possono essere ulteriormente convalidate dai saggi a valle.
Recentemente abbiamo impiegato i metodi sopra descritti per identificare i composti antivirali che bloccavano in modo efficiente l'infezione da CVA169 noninvilita. Qui di seguito, i protocolli dettagliati che sono stati utilizzati sono descritti e discussi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">AL-158127-500G</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Anti-VP1 antibody</td>
			<td style="width:205px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:171px;">MAB979</td>
			<td style="width:232px;">Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Coulter Cytometer</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corina</td>
			<td style="width:205px;">Molecular Networks GmbH</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C3886-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">11995-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">In vitro toxicology assay kit, XTT-based</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">TOX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">M0512-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PyMol</td>
			<td style="width:205px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:205px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16

I test antivirali che esaminano meccanicamente l'ingresso virale sono pertinenti a discernere a quale passo gli agenti valutati sono più efficaci e consentono l'identificazione degli inibitori di ingresso virale candidati. Qui presentiamo gli approcci sperimentali per l'identificazione di piccole molecole in grado di bloccare l'infezione da parte del coxsackievirus non avvolto A16 (CVA16) attraverso il targeting delle particelle di virus o passaggi specifici nell'inserimento virale precoce. I saggi includono l'analisi del tempo di aggiunta della droga, il saggio di legame virale basato sulla citometria del flusso e l'analisi dell'inattivazione virale. Presentiamo anche un protocollo di attracco molecolare che utilizza proteine di capside virus per prevedere i potenziali residui presi di mira dai composti antivirali. Questi saggi dovrebbero aiutare nell'identificazione degli agenti antivirali candidati che agiscono sull'ingresso virale. Le direzioni future possono esplorare questi possibili inibitori per un ulteriore sviluppo di farmaci.

Il saggio di aggiunta del tempo della droga è indicato nella Figura 1 e mostra l'influenza del trattamento utilizzando le piccole molecole CHLA e PUG sull'infezione CVA16 sia all'ingresso pre-virale (pretrattamento), durante l'ingresso virale (co-aggiunta), o l'ingresso post-virale ( post-infezione). Entrambe le molecole piccole hanno prodotto solo un impatto marginale contro l'infettività del CVA16 sia nel pretrattamento delle cellule ospiti prima dell'inf...

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Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Uso di saggi di ingresso virale e analisi di docking molecolare per l'identificazione di candidati antivirali contro il coxsackievirus A16

L'obiettivo del protocollo è quello di illustrare i diversi saggi relativi all'ingresso virale che possono essere utilizzati per identificare gli inibitori di ingresso virale candidati.

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Questo protocollo può aiutare nella scoperta di potenziali piccole molecole antivirali attraverso un approccio basato su meccanismo. Il test del momento dell'addizione determina in quale fase dell'infezione la piccola molecola mostra la sua attività antivirale. L'attracco molecolare prevede l'interazione tra la piccola molecola e le proteine virali.Per valutare l'influenza dei farmaci sulle cellule ospiti prima dell'infezione virale, seminare cellule RD in piastre di 12 po 'a due volte 10 alla quinta cellule per densità di placcatura del pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica del 5% durante la notte. La mattina seguente, trattare ogni pozzo del monostrato RD con un composto di prova di interesse, in triplice copia, a concentrazioni non tossiche in un millilitro di mezzo basale per una o quattro ore.Al termine dell'incubazione del trattamento, lavare le cellule con un millilitro di PBS prima di aggiungere 50 unità di virus che formano la placca in 300 microlitri di mezzo basale per pozzo per un'ora, con dondolo ogni 15 minuti. Al termine dell'incubazione dell'infezione, lavare le cellule con PBS e sovrapporre le cellule con un millilitro di mezzo basale fresco contenente lo 0,8% di metilcellulosa. Dopo 72 ore nell'incubatrice di coltura cellulare, lavare ogni bene con due millilitri di PBS e fissare le cellule con 0,5 millilitri di formaldeide al 37% per pozzo per 15 minuti.Al termine della fissazione, lavare i pozzi con PBS e macchiare le cellule con 0,5 millilitri di soluzione di viola cristallo allo 0,5% per pozzo. Dopo due minuti, lavare i pozzi con un leggero flusso d'acqua e lasciare asciugare all'aria la piastra. Quindi posizionare la piastra su una scatola di luce bianca per il conteggio e calcolare la percentuale di cellule infette da coxsackievirus in base alla formula.Per l'analisi di docking molecolare, scaricare molecole 3D dei composti di prova da PubChem. Se una molecola non ha una struttura 3D caricata, scaricare la struttura 2D o utilizzare la sequenza di stringhe SMILE per trasformare la struttura in una molecola 3D tramite un programma molecolare appropriato. Quindi, scarica un'unità di assemblaggio biologico virale da RCSB Protein Data Bank.Utilizzando un programma di bio-computing appropriato, eliminare i solventi dal file Protein Data Bank, sostituire le catene laterali incomplete utilizzando i dati della libreria di rotameri Dunbrack 2010 e aggiungere idrogeno e cariche alla struttura come riportato in precedenza. Per agganciare i composti di prova all'unità virus preparata, caricare il file del composto di prova nella Chimera dell'Università della California di San Francisco come ligando e selezionare l'intera proteina virale preparata come recettore per eseguire l'attracco cieco. Per un ulteriore attracco, limitare il sito di attracco alla proteina virale in regioni di interesse derivate dai risultati dell'attracco cieco riducendo ulteriormente il volume di ricerca.Quindi caricare il file di ancoraggio in un sistema di grafica molecolare appropriato per analizzare le posizioni della modalità di associazione. Selezionare il ligando per trovare i contatti polari dal composto alla proteina virale, identificando i contatti polari con l'opzione a qualsiasi atomo. Entrambe le piccole molecole testate in questo esperimento rappresentativo, hanno prodotto solo un impatto marginale contro l'infettività del coxsackievirus A16, sia nel pretrattamento delle cellule ospiti prima dell'infezione virale che nel trattamento post-infezione.Al contrario, le molecole hanno efficacemente abrogato l'infezione di oltre l'80% nel trattamento di co-addizione, suggerendo che i due composti sono i più efficaci quando sono presenti contemporaneamente con le particelle virali sulla superficie della cellula ospite durante l'infezione. L'analisi di legame basata sulla citometria del flusso conferma che i due tannini hanno impedito l'ingresso di infettività coxsackievirus A16 impedendo il legame delle particelle virali alle cellule ospiti. L'aggancio molecolare dei tannini indica che entrambi sono previsti per legarsi nella regione del canyon del pentamero coxsackievirus, appena sopra l'ingresso tascabile che tiene il fattore tascabile e svolge un ruolo importante per mediare il legame coxsackievirus e l'ingresso nella cellula ospite.In queste proiezioni superficiali si possono osservare i residui unici previsti dai contatti polari delle piccole molecole attorno all'ingresso tascabile, con asparagina-85, lisina-257 e asparagina-417 in comune tra i due tannini. Per l'attracco molecolare, la topologia della proteina virale deve essere presa in considerazione quando si classificano i fotogrammi di legame. Ulteriori esperimenti potrebbero includere il test dell'attività antivirale del composto su virus ricombinanti, con mutazioni sugli amminoacidi scoperti per convalidarne l'importanza per l'efficacia del farmaco.

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