Name: use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00
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著者らは、テキサス大学オースティン校のジョシュア・ベッカム博士に、分子ドッキングによる技術サポートに感謝しています。この研究は、台湾科学技術省(MOST107-2320-B-037-002からC.J.L.およびL.T.L.への資金提供によって部分的に支援されました。MOST106-2320-B-021およびMOST107-2320-B-038-034-MY3からL.T.L.へ)。

注:すべての細胞培養およびウイルス感染は、取り扱うサンプルのバイオセーフティレベルに適した認定バイオセーフティフードで行う必要があります。CVA16感染9を効率的に遮断することが観察された小分子ケブラギン酸(CHLA)とプニカラギン(PUG)の2つのタンニンクラスは、候補阻害剤の例として用いられる。ウイルス学技術における基本原理、ウイルス伝播、ウ?...

<ol>
	<li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult.">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li><li>Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A16+infection.">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity:+implications+for+particle+expansion,+receptor+binding,+and+immunogenicity.">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li><li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71.">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71.">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7,+A14,+and+A16+and+enterovirus+71.">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li><li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolyzable+tannins+(chebulagic+acid+and+punicalagin)+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread.">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li><li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry.">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187 (2013).</li><li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding.">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7, 162 (2018).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds.">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).</li><li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK+6:+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes.">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor.">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 6, 65 (2017).</li><li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes.">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li></ol>

本報告では、特に非エンベロープCVA16に対して、ウイルスエントリを標的とする抗ウイルス候補の同定に有用なプロトコルについて説明した。アッセイは、ウイルスの侵入中に初期の事象を解剖する方法で設計されており、試験剤の抗ウイルス活性の作用と潜在的な標的のメカニズムを明らかにするのに役立ちます。「薬物添加アッセイ」は、例えば、未感染の宿主細胞(前処理分析)、ウイル...

手、足、口の病気(HFMD)は、幼児におけるコクサッキーウイルスA16(CVA16)およびエンテロウイルス71(EV71)によって最も一般的に引き起こされる疾患である。最近、アジア太平洋地域では、CVA16誘発HFMDが著しい上昇を見せております。症状は軽度であり、脳と心臓に影響を与える重篤な合併症が起こり、潜在的な死亡事故は1、2である。現在のところ、CVA16に対して認可された抗ウイルス療法やワクチン接種は存在しないため、将来の流行とそれに関連する合併症を抑制するための抗ウイルス戦略を開発する必要があります。
CVA16は、それぞれVP1、VP2、VP3、およびVP4という4つの構造タンパク質を含むペンタマーから組み立てられたイコサヘドラルドカプシドを持つ非エンベロープウイルスです。ペンタマーの各5倍軸を囲むは、うつ病として示す「キャニオン」領域であり、受容体結合3におけるその役割で知られている。この渓谷の底部には、スフィンゴシン(SPH)という名前の天然脂肪リガンドを含むVP1領域に疎水性ポケットがあります。ヒトPセレクチン糖タンパク質リガンド1(PSGL-1)およびスカベンジャー受容体クラスB部材2(SCARB2)などの細胞受容体は、このリガンドを置換することによりウイルス結合の役割を果たさなことが示唆されており、その結果、カプシドおよびコプレジドに対する立体構造変化をもたらす。宿主細胞4、5、6へのウイルスゲノムのその後の排出。ウイルス入力プロセスにおける連続的な事象をブロックする可能性のある阻害剤を同定することは、CVA16感染に対する潜在的な治療戦略を提供する可能性がある。
ウイルスライフサイクルのステップは、モード特異的抗ウイルス剤の同定に役立つ標的として実験的アプローチを通じて解剖することができる。薬物添加分析では、ウイルス感染の前に(ウイルス感染前に追加)、エントリー(ウイルス感染に同時に追加)、およびポストエントリー(以下に追加される)を含む、ウイルス感染中の異なる時期における薬物治療効果を調べる。ウイルス感染)7.その影響は、各治療条件で形成されたウイルスプラークの数を定量することにより、標準的なプラークアッセイを用いて評価することができる。フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイは、薬物が宿主細胞へのウイルスの付着を防ぐかどうかを決定する。これは、ヒトウイルス感染の大部分が発生する37°Cから、ウイルスが宿主細胞表面に結合できるが細胞7に入ることができない4°Cに温度をシフトすることによって達成される。細胞膜結合ウイルス粒子は、ウイルス抗原に対する免疫染色を通じて定量化され、フローサイトメトリーによって評価される。一方、ウイルス不活性化アッセイは、遊離ウイルス粒子との薬物の潜在的な物理的相互作用を評価するのに役立ちます, バイリオンを保護または中和, またはそれらのために非アクティブにする集約や立体構造変化を引き起こす感染8、9の間に宿主細胞表面とのその後の相互作用。この実験では、ウイルス接種は、宿主細胞単層に感染し、標準的なプラークアッセイ8を行う前に薬物をチレートする前に、薬物で最初にインキュベートすることを許可する。最後に、分子ドッキングは、計算を使用して、エンベロープされたウイルスからのウイルス糖タンパク質や非エンベロープウイルスからのウイルスカプシドタンパク質を含む、ビリオン表面上の潜在的な薬物相互作用部位を予測するための強力なツールです。アルゴリズム。これは、薬物の作用モードの標的を機械的に特定し、下流アッセイによってさらに検証できる有用な情報を提供するのに役立ちます。
我々は最近、非エンベロープCVA169による感染を効率的にブロックした抗ウイルス化合物を同定するために、上記の方法を採用した。本明細書において、使用された詳細なプロトコルについて説明し、議論する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">AL-158127-500G</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Anti-VP1 antibody</td>
			<td style="width:205px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:171px;">MAB979</td>
			<td style="width:232px;">Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Coulter Cytometer</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corina</td>
			<td style="width:205px;">Molecular Networks GmbH</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C3886-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">11995-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">In vitro toxicology assay kit, XTT-based</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">TOX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">M0512-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PyMol</td>
			<td style="width:205px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:205px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16

機械的にウイルスの入り口を調べる抗ウイルスアッセイは、評価された薬剤が最も効果的であるステップを識別するのに関連し、候補ウイルスエントリー阻害剤の同定を可能にする。ここでは、ウイルス粒子または初期のウイルス侵入における特定のステップを標的にすることにより、非エンベロープコクサッキーウイルスA16(CVA16)による感染を遮断することができる低分子の同定のための実験的アプローチを提示する。アッセイには、薬物添加分析の時間、フローサイトメトリーベースのウイルス結合アッセイ、およびウイルス不活性化アッセイが含まれる。また、ウイルスカプシドタンパク質を利用して、抗ウイルス化合物の標的となる潜在的な残留物を予測する分子ドッキングプロトコルを提示する。これらのアッセイは、ウイルスの侵入に作用する候補抗ウイルス剤の同定に役立つはずだ。将来の方向性は、さらなる薬剤開発のためのこれらの可能な阻害剤を探索することができます。

時間増量アッセイは図1に示され、CVA16感染に対する低分子CHLAおよびPUGを用いた治療からの影響を示す前ウイルス入力(前処理)、ウイルス入力中(共添加)、またはウイルス後のエントリー(感染後)。いずれの低分子も、ウイルス感染前の宿主細胞の前処理(図1A)または感染後治療(図1C)において、CVA16感染?...

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Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

コキサッキーウイルスA16に対する抗ウイルス候補の同定のためのウイルスエントリーアッセイと分子ドッキング解析の使用

プロトコルの目的は、候補ウイルスエントリ阻害剤を同定するために使用することができるウイルスエントリに関連する異なるアッセイを説明することです。

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

このプロトコルは、メカニズム主導のアプローチを通じて潜在的な抗ウイルス小分子の発見を助けることができる。加算アッセイの時点では、その低分子が抗ウイルス活性を示す感染のステップを決定する。分子ドッキングは、小分子とウイルスタンパク質の相互作用を予測します。ウイルス感染前の宿主細胞に対する薬物の影響を評価するために、RD細胞を12ウェルプレートに2倍10~5番目の細胞で播種した。一晩で5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。翌朝、RD単層の各ウェルを目的とする試験化合物で、三重化で、1ミリリットルの基底培地中の非毒性濃度で1〜4時間治療する。治療インキュベーションの最後に、PBSの1ミリリットルで細胞を洗浄してから、1時間あたり300マイクロリットルの基底培地に50個のプラーク形成単位のウイルスを加え、15分ごとに揺れ動かします。感染インキュベーションの終わりに、PBSで細胞を洗浄し、0.8%メチルセルロースを含む新鮮な基礎培地の1ミリリットルで細胞をオーバーレイします。細胞培養インキュベーターで72時間後、PBSを2ミリリットルでそれぞれよく洗い、15分間37%ホルムアルデヒドの0.5ミリリットルで細胞を固定します。固定の終わりに、PBSでウェルを洗浄し、ウェルあたり0.5%クリスタルバイオレット溶液の0.5ミリリットルで細胞を汚します。2分後、井戸を穏やかな水で洗い、プレートを空気乾燥させます。次に、プレートを数えるために白いライトボックスに置き、式に従ってコクサッキーウイルス感染細胞の割合を計算します。分子ドッキング解析では、PubChemから試験化合物の3D分子をダウンロードしてください。分子にアップロードされた3D構造がない場合は、2D構造をダウンロードするか、またはSMILE文字列シーケンスを使用して、適切な分子プログラムを介して構造を3D分子に変換します。次に、RCSBタンパク質データバンクからウイルス生物学的組み立てユニットをダウンロードします。適切なバイオコンピューティングプログラムを使用して、タンパク質データバンクファイルから溶媒を削除し、Dunbrack 2010ロタマーライブラリからのデータを使用して不完全な側鎖を交換し、前述のように水素と電荷を構造に追加します。テスト化合物を準備されたウイルスユニットにドッキングするには、テスト化合物ファイルをリガンドとしてカリフォルニア大学サンフランシスコキメラ校にアップロードし、ブラインドドッキングを行う受容体として調製されたウイルスタンパク質全体を選択します。追加のドッキングの場合、さらに検索量を減らすことによって、ブラインドドッキング結果から得られる対象領域にドッキング部位をウイルスタンパク質に閉じ込めます。次に、ドッキングファイルを適切な分子グラフィックスシステムにアップロードして、結合モードの位置を分析します。リガンドを選択して化合物からウイルスタンパク質への極性接触を見つけ、任意の原子に対する極性接触を識別します。この代表的な実験で試験された小分子の両方は、ウイルス感染前の宿主細胞の前処理でも感染後の治療においても、コクサッキーウイルスA16感染に対する限界的な影響のみを生み出した。対照的に、分子は共加処理において80%を超えて効率的に感染を除去し、感染時に宿主細胞表面にウイルス粒子と同時に存在する場合に2つの化合物が最も効果的であることを示唆している。フローサイトメトリーに基づく結合分析は、2つのタンニンが宿主細胞へのウイルス粒子結合を防止することによってコクサッキーウイルスA16感染性エントリーを予防したことを確認する。タンニンの分子ドッキングは、両方ともコクサッキーウイルスペンタマーの峡谷領域で結合すると予測されていることを示し、ポケットファクターを保持し、コクサッキーウイルスの結合および宿主細胞への侵入を仲介する上に重要な役割を果たす。これらの表面投影では、2つのタンニンの間で共通のアスパラギン-85、リジン-257、およびアスパラギン-417で、ポケット入り口の周りの小分子の極性接点から予測されるユニークな残基が観察される。分子ドッキングの場合、結合フレームをランク付けする際にウイルスタンパク質のトポロジーを考慮する必要があります。追加の実験には、組み換えウイルスに対する化合物の抗ウイルス活性のテストが含まれ、薬物の有効性に対する重要性を検証するために発見されたアミノ酸の突然変異が含まれる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

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標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

タングウイルスに対する新規抗ウイルス剤の同定のためのアッセイ

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プラークアッセイを通じてウイルス濃度の測定：伝統と新しいオーバーレイシステムの使用

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Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

C型肝炎ウイルスに対するヒトラクトフェリンの細胞取り込みおよびそれに関連する抗ウイルス活性を監視するために、免疫蛍光

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Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

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The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

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の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

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表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...