Name: use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00
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저자는 분자 도킹기술 지원을 위해 오스틴에 있는 텍사스 대학에 조슈아 베컴 박사에게 감사하고 있습니다. 이 연구는 부분적으로 대만 의 과학 기술부 (MOST107-2320-B-037-037-002에서 C.-J.L. 및 L.-T.L.에 대한 자금 지원으로 지원되었습니다. MOST106-2320-B-038-021 및 MOST107-2320-B-038-034-MY3- L.-T.L.)

참고: 모든 세포 배양 및 바이러스 감염은 취급되는 견본의 생물 안전 수준에 적합한 인증된 생물 안전 성 후드에서 수행되어야 합니다. CVA16 감염을 효율적으로 차단하기 위해 관찰된 소분자 체불라그산(CHLA) 및 푸니타진(PUG)의2개의 탄닌 클래스는 후보 억제제의 예로 사용된다. 바이러스학 기술의 기본 원리, 바이러스 전파, 바이러스 적규기의 결정, 및 플라크 형성 ...

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	<li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult.">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li><li>Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolyzable+tannins+(chebulagic+acid+and+punicalagin)+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread.">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li><li>Lin, L. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds.">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).</li><li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK+6:+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes.">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor.">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 6, 65 (2017).</li><li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes.">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li></ol>

이 보고서에서, 우리는 특히 비 포위 된 CVA16에 대하여 바이러스 입력을 표적으로 하는 항 바이러스 후보의 식별에 유용한 프로토콜을 기술했습니다. 이 실험은 바이러스 진입 중에 초기 이벤트를 해부하는 방법으로 설계되었으며, 이는 시험에이전트의 항바이러스 활성의 작용 메커니즘과 잠재적 표적(들)을 명확히 하는 데 도움이 된다. '약물 첨가 시간'은 시험 화합물의 잠재적 표적, 예를 들어 ?...

손, 발 및 구강 질환(HFMD)은 어린 아이들의 콕사키바이러스 A16(CVA16) 및 엔테로바이러스 71(EV71)에 의해 가장 흔하게 발생하는 질환이다. 최근 아시아 태평양 지역에서 CVA16 유도 HFMD에 상당한 상승세가 있었습니다. 현상이 온화할 수 있는 동안, 가혹한 합병증은 잠재적인치명적인 1,2와함께 두뇌와 심혼에 영향을 미치는 생길 수 있습니다. 현재 CVA16에 사용할 수있는 허가 된 항 바이러스 요법이나 예방 접종은 없으므로 향후 발병 및 관련 합병증을 억제하기위한 항 바이러스 전략을 개발할 필요성이 절실히 필요합니다.
CVA16은 각각 VP1, VP2, VP3 및 VP4와 같은 4개의 구조 단백질을 포함하는 펜타머에서 조립된 이코사헤드랄 캡시드가 있는 비봉투 바이러스입니다. 펜타머에서 각 5 배 축을 둘러싸는 것은 우울증으로 표시하고 수용체 결합 3에서의역할로 지적되는 '협곡'영역입니다. 이 협곡의 하단에는 스핑고신(SPH)이라는 천연 지방 리간드가 들어 있는 VP1 부위에 소수성 포켓이 있습니다. 인간 P 셀렉틴 당단백질 리간드 1(PSGL-1) 및 스캐빈저 수용체 클래스 B 부재 2(SCARB2)와 같은 세포 수용체는 캡시드및 캡시드에 대한 형태 적 변화를 초래하는 이 리간드를 대체함으로써 바이러스 결합에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 호스트 세포로 바이러스 게놈의후속 배출 4,5,6. 바이러스 진입 과정에서 연속적인 사건을 차단하는 가능한 억제제를 식별하면 CVA16 감염에 대한 잠재적 인 치료 전략을 제공 할 수 있습니다.
바이러스 수명 주기의 단계는 모드 특정 항 바이러스 제를 식별하는 데 도움이되는 표적으로 실험적 접근을 통해 해부 될 수 있습니다. 약물 첨가 시간 분석은 사전 진입(바이러스 감염 이전에 추가), 항목(바이러스 감염에 동시 추가), 및 사후 진입(다음에 추가됨)을 포함하여 바이러스 감염 중 다른 시간에 약물 치료 효과를 검사합니다. 바이러스 감염)7. 충격은 각각의 처리 조건에서 형성된 바이러스 성 플라크의 수를 정량화함으로써 표준 플라크 분석을 사용하여 평가될 수 있다. 유세포분석기반 바이러스 결합 분석법은 약물이 숙주 세포에 대한 바이러스 부착을 방지하는지 여부를 결정한다. 이는 대부분의 인간 바이러스 감염이 발생하는 37°C에서 4°C로 온도를 이동시킴으로써 달성되며, 여기서 비리온은 숙주 세포 표면에 결합할수 있지만 세포 7에 들어갈 수 없다. 세포막 결합된 바이러스 입자는 그 때 바이러스 성 항원에 대하여 면역 염색을 통해 정량화되고 유세포 측정에 의해 평가됩니다. 한편 바이러스 성 불활성화 분석은 비활성 을 렌더링 하는 응집 또는 구성 변화를 일으키는 무료 바이러스 입자와 약물의 잠재적인 물리적 상호 작용을 평가 하는 데 도움이, 차폐 또는 중화, 또는 그들을 비활성 렌더링 하는 조직 변화 감염 동안 호스트 세포 표면과후속 상호 작용 8,9. 본 실험에서, 바이러스 성 접종은 숙주 세포 단층을 감염시키고 표준 플라크 분석8을수행하기 전에 약물을 적정하기 위해 희석되기 전에 약물을 먼저 배양할 수 있다. 마지막으로, 분자 도킹은 비봉투 바이러스의 바이러스 성 당단백질과 비봉투 바이러스의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하여 비리온 표면의 잠재적인 약물 상호 작용 부위를 예측하는 강력한 도구입니다. 알고리즘. 이것은 기계론적으로 약물의 행동 모드의 표적을 찾아내고 다운스트림 검아에 의해 추가로 검증될 수 있는 유용한 정보를 제공하는 것을 돕습니다.
우리는 최근에 비 봉투 CVA16 9에 의해 감염을 효율적으로 차단하는 항바이러스 화합물을 식별하기 위해 전술 한 방법을 채택했다. 본 명세서에서, 사용된 상세한 프로토콜들이 기술되고 논의된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">AL-158127-500G</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Anti-VP1 antibody</td>
			<td style="width:205px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:171px;">MAB979</td>
			<td style="width:232px;">Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Coulter Cytometer</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corina</td>
			<td style="width:205px;">Molecular Networks GmbH</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C3886-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">11995-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">In vitro toxicology assay kit, XTT-based</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">TOX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">M0512-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PyMol</td>
			<td style="width:205px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:205px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16

기계론적으로 바이러스 진입을 검사하는 항바이러스 분석제는 평가된 에이전트가 가장 효과적인 단계를 분별하는 것과 관련이 있으며, 후보 바이러스 진입 억제제의 식별을 허용한다. 여기서, 우리는 초기 바이러스 진입에서 바이러스 입자 또는 특정 단계를 표적으로 하여 비봉투콕사키바이러스 A16(CVA16)에 의한 감염을 차단할 수 있는 소분자의 식별을 위한 실험접근법을 제시한다. 분석법은 약물 첨가 시간 분석, 유세포분석계 바이러스 결합 분석, 및 바이러스 불활성화 분석기를 포함한다. 우리는 또한 항 바이러스 화합물에 의해 표적으로 한 잠재적인 잔류물을 예측하기 위하여 바이러스 capsid 단백질을 이용하는 분자 도킹 프로토콜을 제시합니다. 이 해법은 바이러스 성 진입에 작용하는 후보 항 바이러스 에이전트의 확인에 도움이 될 것입니다. 미래의 방향은 추가 약물 개발을 위한 이러한 가능한 억제제들을 탐구할 수 있다.

약물 첨가 시술은 도 1에 도시되어 CVA16 감염에 대한 소분자 CHLA 및 PUG를 이용한 치료로부터의 영향을 예-바이러스 입력(pre-addition) 또는 바이러스 후 진입(co-addition) 또는 후바이러스 항목( 감염 후). 두 소분자 모두 바이러스 감염 전의 숙주 세포의 전처리 여부에 관계없이 CVA16 감염에 대한 한계 영향을 발생시켰다(도1A)또는 감염...

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Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Coxsackievirus A16에 대하여 항바이러스 후보의 확인을 위한 바이러스 성 입력 분석 및 분자 도킹 분석의 사용

프로토콜의 목적은 후보 바이러스 진입 억제제를 식별하는 데 사용될 수 있는 바이러스 입력과 관련된 상이한 분석방법을 설명하는 것이다.

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

이 프로토콜은 메커니즘 중심의 접근 방식을 통해 잠재적 인 항 바이러스 소 분자의 발견에 도움이 될 수 있습니다. 추가 분석의 시간은 소분자가 항바이러스 활성을 나타내는 감염의 어느 단계를 결정한다. 분자 도킹은 소분자와 바이러스 성 단백질 사이의 상호 작용을 예측합니다.바이러스 감염 전에 숙주 세포에 대한 약물의 영향을 평가하기 위해, 12웰 플레이트에서 12웰 플레이트에서 잘 도금 밀도당 다섯 번째 세포에 10번 종자 RD 세포. 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음 날 아침, RD 단층의 각 우물을 관심 있는 시험 화합물로 치료하여, 삼중항에, 1~4시간 동안 기저 배지의 1밀리리터에서 무독성 농도로 치료한다.치료 인큐베이션이 끝나면 15 분마다 흔들리면서 1 시간 동안 잘 기초 매체 의 300 마이크로 리터에 50 개의 플라크 형성 유닛을 추가하기 전에 PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻으면 됩니다. 감염 인큐베이션의 끝에서, PBS로 세포를 세척하고 0.8 %의 메틸 셀룰로오스를 포함하는 신선한 기저 배지의 1 밀리리터로 세포를 오버레이. 세포 배양 인큐베이터에서 72 시간 후, PBS의 두 밀리리터로 각각 잘 씻고 15 분 동안 잘 37 %의 37 %의 포름알데히드의 0.5 밀리리터로 세포를 고정하십시오.고정의 끝에서, PBS로 우물을 세척하고 우물 당 0.5 %의 0.5 밀리리터로 세포를 얼룩. 2분 후, 우물을 부드러운 물 줄기로 씻고 접시가 건조하게 하십시오. 그런 다음 계산을 위해 백색광 상자에 접시를 놓고 수식에 따라 coxsackievirus 감염된 세포의 백분율을 계산합니다.분자 도킹 분석을 위해 PubChem에서 테스트 화합물의 3D 분자를 다운로드하십시오. 분자가 업로드된 3D 구조가 없는 경우, 2D 구조를 다운로드하거나 SMILE 문자열 서열을 사용하여 적절한 분자 프로그램을 통해 구조를 3D 분자로 변환한다. 다음으로 RCSB 단백질 데이터 뱅크에서 바이러스 성 생물학적 조립 장치를 다운로드하십시오.적절한 바이오 컴퓨팅 프로그램을 사용하여 단백질 데이터 뱅크 파일에서 용매를 삭제하고, 던브랙 2010 로타머 라이브러리의 데이터를 사용하여 불완전한 측면 체인을 교체하고 이전에 보고된 대로 구조에 수소와 충전을 추가합니다. 시험 화합물을 준비된 바이러스 장치에 도킹하려면, 캘리포니아 샌프란시스코 키메라 대학에 시험 화합물 파일을 리간드로 업로드하고 블라인드 도킹을 수행하기 위해 수용체로서 준비된 전체 바이러스 단백질을 선택한다. 추가 도킹의 경우, 도킹 부위를 검색량을 더욱 감소시킴으로써 맹목적인 도킹 결과로부터 파생된 관심 영역으로 바이러스 성 단백질에 제한한다.그런 다음 도킹 파일을 적절한 분자 그래픽 시스템에 업로드하여 바인딩 모드 위치를 분석합니다. 리간드를 선택하여 화합물에서 바이러스 성 단백질까지 극성 접접촉을 찾아 원자 옵션과의 극성 접접촉을 식별합니다. 이 대표적인 실험에서 시험된 두 개의 작은 분자는, 바이러스 감염 전 또는 감염 후 처리에서 숙주 세포의 전처리에서 든 coxsackievirus A16 감염성에 대하여 한계 충격을 생성했습니다.대조적으로, 분자는 공동 추가 처리에서 80% 이상 에 의하여 감염을 효율적으로 제거했습니다, 2개의 화합물이 감염 도중 호스트 세포 표면에 바이러스 입자와 동시에 존재할 때 가장 효과적이다는 것을 건의합니다. 유동 세포측정 기반 결합 분석은 두 탄닌이 숙주 세포에 바이러스 입자 결합을 방지함으로써 coxsackievirus A16 감염성 진입을 방지함을 확인합니다. 탄닌의 분자 도킹은 둘 다 포켓 팩터를 잡고 coxsackievirus 바인딩 및 호스트 세포로의 입력을 중재하는 중요한 역할을 하는 포켓 입구 바로 위에 coxsackievirus pentamer의 협곡 지역에 결합할 것으로 예상된다는 것을 나타냅니다.이러한 표면 투영에서, 포켓 입구 주변의 소분자의 극성 접촉으로부터 예측된 독특한 잔류물은 아스파라진-85, 리신-257 및 아스파라진-417을 두 탄닌 사이에 공통적으로 관찰할 수 있다. 분자 도킹의 경우, 결합 프레임을 순위를 매일 때 바이러스 성 단백질의 토폴로지가 고려되어야합니다. 추가 실험은 재조합 바이러스에 화합물의 항 바이러스 활성을 테스트 포함 될 수 있습니다., 아미노산에 돌연변이 약물의 효능에 그들의 중요성을 확인 하기 위해 발견.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

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에 대한 드립 흐름 및 회전 디스크 원자로의 사용 포도상 구균 Biofilm 분석

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연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

표준 임상 Assays에 의해 탐지의 한도 이하 바이러스성로드와 HIV 감염된 개인의 확장 및 HIV - 1 RNA를 Quantifying

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

C 형 간염 바이러스에 대한 인간 락토페린의 세포 흡수 및 관련 바이러스 활동을 모니터링하는 면역 형광

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

의 탐지를위한 동결 건조 루프 - 매개 등온 증폭 시약의 개발<em&gt; Coxiella burnetii의</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...