Name: use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00
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Os autores são gratos ao Dr. Joshua Beckham na Universidade de Texas em Austin para o apoio técnico com encaixe molecular. Este estudo foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (MOST107-2320-B-037-002 para C.-JL e L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 e MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).

Nota: Todas as infecções da cultura e do vírus de pilha devem ser conduzidas em capas certificadas da Biossegurança que são apropriadas para o nível da biossegurança das amostras que estão sendo tratadas. As duas classes de Tanina de pequenas moléculas de Ácido Chebulágico (CHLA) e punicalagina (PUG), que foram observadas para bloquear eficientemente a infecção por CVA169, são usadas como exemplos de agentes inibitórios candidatos. Para princípios básicos em técn...

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	<li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult.">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li><li>Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A16+infection.">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity:+implications+for+particle+expansion,+receptor+binding,+and+immunogenicity.">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li><li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71.">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71.">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7,+A14,+and+A16+and+enterovirus+71.">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li><li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolyzable+tannins+(chebulagic+acid+and+punicalagin)+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread.">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li><li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry.">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187 (2013).</li><li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding.">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7, 162 (2018).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Virology. , (2008).</li><li>Velu, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BPR-3P0128+inhibits+RNA-dependent+RNA+polymerase+elongation+and+VPg+uridylylation+activities+of+Enterovirus+71.">BPR-3P0128 inhibits RNA-dependent RNA polymerase elongation and VPg uridylylation activities of Enterovirus 71.</a> Antiviral Research. 112, 18-25 (2014).</li><li>Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds.">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).</li><li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK+6:+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes.">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor.">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 6, 65 (2017).</li><li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes.">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li></ol>

Neste relato, foram descritos os protocolos que são úteis para a identificação de candidatos antivirais que visam a entrada viral, em particular contra os não CVA16. Os ensaios são projetados de forma a dissecar os acontecimentos precoces durante a entrada viral, o que é útil para esclarecer o mecanismo (s) de ação e potencial alvo (s) da atividade antiviral dos agentes de teste. O "teste de tempo de adição de drogas" permite determinar amplamente o potencial alvo dos compostos de teste, por exemplo, as célu...

A doença da mão, do pé, e da boca (hfmd) é uma doença causada o mais geralmente pelo coxsackievirus A16 (CVA16) e pelo enterovírus 71 (EV71) em crianças novas. Recentemente, em toda a região da Ásia-Pacífico, houve um aumento significativo na HFMD induzida por CVA16. Embora os sintomas possam ser leves, podem ocorrer complicações graves que afetam o cérebro e o coração, com potencial fatalidade1,2. Atualmente, não há terapias antivirais licenciadas ou vacinações disponíveis para CVA16, e, portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver estratégias antivirais para conter surtos futuros e as complicações associadas.
CVA16 é um vírus não-envelopado que tenha um capsídeo icosahedral montado dos pentâmeros que cada um contem 4 proteínas estruturais a saber VP1, VP2, VP3, e VP4. Circundando cada eixo cinco vezes no pentâmero é uma região ' Canyon ' que mostra como uma depressão e é notável por seu papel na ligação do receptor3. Na parte inferior deste Canyon encontra-se um bolso hidrofóbico na região VP1 que contém um ligante gordo natural chamado esfingosina (SPH). Receptores celulares, como a glicoproteína de P selectina humana ligante 1 (PSGL-1) e o membro da classe B do receptor de scavenger 2 (SCARB2), têm sido sugeridos para desempenhar um papel na ligação viral, deslocando este ligante que resulta em alterações conformacionais para o capsídeo e o subsequente ejeção do genoma viral na célula hospedeira4,5,6. A identificação de possíveis inibidores que bloqueiam os eventos sucessivos no processo de entrada viral pode fornecer estratégias terapêuticas potenciais contra a infecção por CVA16.
As etapas do ciclo de vida do vírus podem ser dissecadas por meio de abordagens experimentais como alvos para ajudar a identificar agentes antivirais específicos do modo. Uma análise da tempo--droga-adição examina o efeito do tratamento da droga em épocas diferentes durante a infecção viral, incluindo o pre-entry (adicionado antes da infecção do vírus), entrada (adicionado simultâneo à infecção do vírus), e borne-entrada (adicionado depois do Infeção pelo vírus)7. O impacto pode ser avaliado usando um ensaio de placa padrão, quantitando o número de chapas virais formadas em cada uma das condições de tratamento. O ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo determina se a droga impede o apego viral às células hospedeiras. Isto é conseguido deslocando a temperatura de 37 ° c, em que a maioria de infecções humanas do vírus ocorre, a 4 ° c, onde os virions podem se ligar à superfície da pilha do anfitrião mas são incapazes de incorporar as pilhas7. As partículas de vírus ligadas à membrana celular são então quantificadas por imunocoloração contra antígenos virais e avaliadas por citometria de fluxo. O ensaio de inativação viral, por outro lado, ajuda a avaliar potenciais interações físicas da droga com partículas de vírus livres, protegendo ou neutralizando os virions, ou causando agregações ou alterações conformacionais que os tornam inativos para interações subsequentes com a superfície celular do hospedeiro durante a infecção8,9. Neste experimento, o inuso viral é permitido incubar primeiro com a droga antes de ser diluído para titular para fora a droga antes de infectar a monocamada da pilha de anfitrião e de executar um ensaio padrão da chapa8. Finalmente, o encaixe molecular é uma ferramenta poderosa para prever locais potenciais da interação da droga na superfície do virion, incluindo as glicoproteínas virais dos vírus Envelopado e das proteínas virais do capsídeo dos vírus não-envelopado, usando o computacional Algoritmos. Isso ajuda a identificar os alvos mecanisticamente do modo de ação da droga e fornecer informações úteis que podem ser mais validadas por ensaios a jusante.
Recentemente, empregou-se os métodos descritos acima para identificar compostos antivirais que bloquearam eficientemente a infecção pelos não-envoltos CVA169. Nisto, os protocolos detalhados que foram usados são descritos e discutidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">AL-158127-500G</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Anti-VP1 antibody</td>
			<td style="width:205px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:171px;">MAB979</td>
			<td style="width:232px;">Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Coulter Cytometer</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corina</td>
			<td style="width:205px;">Molecular Networks GmbH</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C3886-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">11995-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">In vitro toxicology assay kit, XTT-based</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">TOX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">M0512-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PyMol</td>
			<td style="width:205px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:205px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16

Ensaios antivirais que examinam mecanisticamente a entrada viral são pertinentes para discernir em que etapa os agentes avaliados são mais efetivos e permitem a identificação de inibidores da entrada viral do candidato. Aqui, apresentamos as abordagens experimentais para a identificação de pequenas moléculas capazes de bloquear a infecção pelo coxsackievirus não envelopado A16 (CVA16) através da segmentação das partículas de vírus ou etapas específicas na entrada viral precoce. Os ensaios incluem a análise do tempo de adição de drogas, o ensaio de ligação viral à base de citometria de fluxo e o ensaio de inativação viral. Nós igualmente apresentamos um protocolo de encaixe molecular que utiliza proteínas do capsídeo do vírus para prever os resíduos potenciais alvejados pelos compostos antivirais. Estes ensaios devem ajudar na identificação de agentes antivirais candidatos que atuam na entrada viral. As direções futuras podem explorar esses possíveis inibidores para o desenvolvimento de drogas.

O teste de adição de tempo de fármaco é indicado na Figura 1 e mostra a influência do tratamento usando as pequenas moléculas CHLA e Pug na infecção CVA16 ou entrada pré-viral (pré-tratamento), durante a entrada viral (coadição), ou entrada pós-viral ( pós-infeção). Ambas as pequenas moléculas produziram apenas impacto marginal contra a infectividade do CVA16, seja no pré-tratamento das células hospedeiras antes da infecção viral (<strong...

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Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Uso de ensaios de entrada viral e análise de ancoragem molecular para a identificação de candidatos antivirais contra coxsackievirus a16

O objetivo do protocolo é ilustrar os diferentes ensaios relativos à entrada viral que podem ser utilizados para identificar os inibidores da entrada viral do candidato.

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Este protocolo pode ajudar na descoberta de potenciais moléculas antivirais através de uma abordagem orientada por mecanismos. O tempo de adição determina em que etapa da infecção a pequena molécula exibe sua atividade antiviral. Acoplamento molecular prevê a interação entre a pequena molécula e as proteínas virais.Para avaliar a influência de drogas em células hospedeiras antes da infecção viral, as células RD de sementes em placas de 12 poços em duas vezes 10 para as quintas células por densidade de revestimento de poços. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% durante a noite. Na manhã seguinte, trate cada poço da monocamada RD com um composto de teste de interesse, em triplicado, em concentrações não tóxicas em um mililitro de meio basal por uma ou quatro horas.Ao final da incubação do tratamento, lave as células com um mililitro de PBS antes de adicionar 50 unidades de formação de placas de vírus em 300 microliters de meio basal por poço por uma hora, com balanço a cada 15 minutos. No final da incubação da infecção, lave as células com PBS e sobreponha as células com um mililitro de meio basal fresco contendo 0,8%de metilcelulose. Após 72 horas na incubadora de cultura celular, lave cada poço com dois mililitros de PBS e fixe as células com 0,5 mililitros de 37% de formaldeído por poço por 15 minutos.Ao final da fixação, lave os poços com PBS e manche as células com 0,5 mililitros de solução violeta cristalina de 0,5% por poço. Depois de dois minutos, lave os poços com um fluxo suave de água e deixe a placa secar. Em seguida, coloque a placa em uma caixa de luz branca para contar e calcule a porcentagem de células infectadas por coxsackievirus de acordo com a fórmula.Para análise de acoplamento molecular, baixe moléculas 3D dos compostos de teste do PubChem. Se uma molécula não tiver uma estrutura 3D carregada, baixe a estrutura 2D ou use a sequência de cordas SMILE para transformar a estrutura em uma molécula 3D através de um programa molecular apropriado. Em seguida, baixe uma unidade de montagem biológica viral do RCSB Protein Data Bank.Usando um programa de biocompputação adequado, exclua os solventes do arquivo Do Banco de Dados de Proteínas, substitua as cadeias laterais incompletas usando dados da biblioteca rotamer Dunbrack 2010 e adicione hidrogênios e cargas à estrutura como relatado anteriormente. Para encaixar os compostos de teste na unidade de vírus preparada, carregue o arquivo composto de teste na Quimera da Universidade da Califórnia em São Francisco como o ligante e selecione toda a proteína viral preparada como receptor para realizar acoplamento cego. Para acoplamento adicional, confine o local de acoplamento à proteína viral a regiões de interesse derivadas dos resultados de acoplamento cego, reduzindo ainda mais o volume de pesquisa.Em seguida, carregue o arquivo de acoplamento em um sistema gráfico molecular apropriado para analisar as posições do modo de ligação. Selecione o ligante para encontrar contatos polares do composto para a proteína viral, identificando os contatos polares com a opção de qualquer átomo. Ambas as pequenas moléculas testadas neste experimento representativo, produziram apenas um impacto marginal contra a infectividade coxsackievirus A16, seja no pré-tratamento das células hospedeiras antes da infecção viral ou no tratamento pós-infecção.Em contraste, as moléculas revogaram eficientemente a infecção em mais de 80% no tratamento de co-adição, sugerindo que os dois compostos são os mais eficazes quando estão simultaneamente presentes com as partículas do vírus na superfície celular hospedeira durante a infecção. A análise de ligação baseada em citometria de fluxo confirma que os dois taninos impediram a entrada de infectividade do coxsackievirus A16, impedindo a ligação de partículas virais às células hospedeiras. O acoplamento molecular dos taninos indica que ambos são previstos para se ligar na região do cânion do pentamer coxsackievirus, logo acima da entrada de bolso que contém o fator bolso e desempenha um papel importante para mediar a ligação de coxsackievirus e a entrada na célula hospedeira.Nestas projeções superficiais, podem ser observados os resíduos únicos previstos a partir dos contatos polares das pequenas moléculas ao redor da entrada do bolso, com asparagine-85, lysina-257 e asparagine-417 em comum entre os dois taninos. Para o acoplamento molecular, a topologia da proteína viral precisa ser levada em conta ao classificar os quadros de ligação. Experimentos adicionais podem incluir testar a atividade antiviral do composto em vírus recombinantes, com mutações nos aminoácidos descobertos para validar sua importância para a eficácia da droga.

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