Name: use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16
Uploaded: 2019-07-15T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16 at JoVE.com

Los autores están agradecidos al Dr. Joshua Beckham de la Universidad de Texas en Austin por el apoyo técnico con acoplamiento molecular. Este estudio fue apoyado en parte por la financiación del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST107-2320-B-037-002 a C.-J.L. y L.-T.L.; MOST106-2320-B-038-021 y MOST107-2320-B-038-034-MY3 a L.-T.L.).

NOTA: Todos los cultivos celulares y las infecciones por virus deben llevarse a cabo en campanas de bioseguridad certificadas que sean adecuadas para el nivel de bioseguridad de las muestras que se manipulan. Las dos moléculas pequeñas de ácido quebulágico (CHLA) y punicalagin (PUG), quese observaron para bloquear eficientemente la infección CVA16 9, se utilizan como ejemplos de agentes inhibidores candidatos. Para los principios básicos en técnicas virológicas, propagaci?...

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	<li>Legay, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A-16+pneumonitis+in+adult.">Fatal coxsackievirus A-16 pneumonitis in adult.</a> Emerging Infectious Diseases. 13, 1084-1086 (2007).</li><li>Wang, C. Y., Li Lu, ., Wu, F., H, M., Lee, C. Y., Huang, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+coxsackievirus+A16+infection.">Fatal coxsackievirus A16 infection.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 23, 275-276 (2004).</li><li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+coxsackievirus+A16+capsids+with+native+antigenicity:+implications+for+particle+expansion,+receptor+binding,+and+immunogenicity.">Structures of coxsackievirus A16 capsids with native antigenicity: implications for particle expansion, receptor binding, and immunogenicity.</a> Journal of Virology. 89, 10500-10511 (2015).</li><li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+is+a+functional+receptor+for+enterovirus+71.">Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 794-797 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptor+B2+is+a+cellular+receptor+for+enterovirus+71.">Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71.</a> Nature Medicine. 15, 798-801 (2009).</li><li>Yamayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+SCARB2-dependent+infection+by+coxsackievirus+A7,+A14,+and+A16+and+enterovirus+71.">Human SCARB2-dependent infection by coxsackievirus A7, A14, and A16 and enterovirus 71.</a> Journal of Virology. 86, 5686-5696 (2012).</li><li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolyzable+tannins+(chebulagic+acid+and+punicalagin)+target+viral+glycoprotein-glycosaminoglycan+interactions+to+inhibit+herpes+simplex+virus+1+entry+and+cell-to-cell+spread.">Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread.</a> Journal of Virology. 85, 4386-4398 (2011).</li><li>Lin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antiviral+activity+of+chebulagic+acid+and+punicalagin+against+viruses+that+use+glycosaminoglycans+for+entry.">Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry.</a> BMC Microbiology. 13, 187 (2013).</li><li>Lin, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecules+targeting+coxsackievirus+A16+capsid+inactivate+viral+particles+and+prevent+viral+binding.">Small molecules targeting coxsackievirus A16 capsid inactivate viral particles and prevent viral binding.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7, 162 (2018).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Viral+Entry+Assays+for+the+Identification+and+Evaluation+of+Antiviral+Compounds.">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> Journal of Visualized Experiments. , e53124 (2015).</li><li>Lang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DOCK+6:+combining+techniques+to+model+RNA-small+molecule+complexes.">DOCK 6: combining techniques to model RNA-small molecule complexes.</a> RNA. 15, 1219-1230 (2009).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coxsackievirus+A16+utilizes+cell+surface+heparan+sulfate+glycosaminoglycans+as+its+attachment+receptor.">Coxsackievirus A16 utilizes cell surface heparan sulfate glycosaminoglycans as its attachment receptor.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 6, 65 (2017).</li><li>Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SWISS-MODEL:+homology+modelling+of+protein+structures+and+complexes.">SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes.</a> Nucleic Acids Research. 46, W296-W303 (2018).</li></ol>

En este informe, describimos los protocolos que son útiles para la identificación de candidatos antivirales que se dirigen a la entrada viral, en particular contra el CVA16 no envuelto. Los ensayos están diseñados de manera sectización de los primeros eventos durante la entrada viral, lo que es útil para aclarar el mecanismo o mecanismos de acción y los posibles objetivos de la actividad antiviral de los agentes de prueba. El "ensayo de tiempo de adición de fármacos" permite determinar ampliamente el objetivo po...

La enfermedad de manos, pies y boca (HFMD) es una enfermedad más comúnmente causada por el coxsackievirus A16 (CVA16) y el enterovirus 71 (EV71) en niños pequeños. Recientemente en toda la región de Asia y el Pacífico, ha habido un repunte significativo en la HFMD inducida por CVA16. Si bien los síntomas pueden ser leves, pueden ocurrir complicaciones graves que afectan el cerebro y el corazón, con una posible letal1,2. En la actualidad, no hay terapias antivirales autorizadas ni vacunas disponibles para CVA16, por lo que es urgente desarrollar estrategias antivirales para frenar futuros brotes y las complicaciones asociadas.
CVA16 es un virus no envuelto que tiene una cápside icosahedral ensamblado a partir de pentámeros que contienen 4 proteínas estructurales, a saber, VP1, VP2, VP3 y VP4. Rodear cada eje de cinco veces en el pentamer es una región 'canyon' que se muestra como una depresión y se destaca por su papel en la unión de receptores3. En la parte inferior de este cañón se encuentra un bolsillo hidrófobo en la región de VP1 que contiene un ligando graso natural llamado esfingosina (SPH). Se ha sugerido que los receptores celulares, como el ligando de glicoproteína p -1 (PSGL-1) y el receptor carroñero de la clase B miembro 2 (SCARB2), desempeñen un papel en la unión viral desplazando este ligando que resulta en cambios conformacionales en la posterior expulsión del genoma viral en la célula huésped4,5,6. La identificación de posibles inhibidores que bloquean los sucesivos eventos en el proceso de entrada viral podría proporcionar posibles estrategias terapéuticas contra la infección por CVA16.
Los pasos en el ciclo de vida del virus se pueden diseccionar a través de enfoques experimentales como objetivos para ayudar a identificar agentes antivirales específicos del modo. Un análisis de tiempo de adición de fármacos examina el efecto del tratamiento farmacológico en diferentes momentos durante la infección viral, incluyendo la preentrada (agregada antes de la infección por el virus), la entrada (agregada simultánea a la infección por el virus) y la infección por virus)7. El impacto se puede evaluar utilizando un ensayo de placa estándar cuantificando el número de placas virales formadas en cada una de las condiciones del tratamiento. El ensayo de unión viral basado en citometría de flujo determina si el medicamento evita la unión viral a las células huésped. Esto se logra cambiando la temperatura de 37 oC, a la que se producen la mayoría de las infecciones por virus humanos, a 4 oC, donde los viriones son capaces de unirse a la superficie de la célula huésped pero no pueden entrar en las células7. Las partículas del virus unido a la membrana celular se cuantifican a través de la inmunomancha contra los antígenos virales y se evalúan mediante citometría de flujo. El ensayo de inactivación viral, por otro lado, ayuda a evaluar posibles interacciones físicas del fármaco con partículas de virus libres, ya sea protegiendo o neutralizando los viriones, o causando agregaciones o cambios de conformación que los hacen inactivos para interacciones posteriores con la superficie de la célula huésped durante la infección8,9. En este experimento, el inóculo viral se permite incubar primero con el fármaco antes de ser diluido para valorar la droga antes de infectar a la monocapa de la célula huésped y realizar un ensayo de placa estándar8. Por último, el acoplamiento molecular es una poderosa herramienta para predecir posibles sitios de interacción farmacológica en la superficie del virión, incluidas las glicoproteínas virales de los virus envueltos y las proteínas cápside virales de virus no envueltos, mediante el uso de virus computacionales Algoritmos. Esto ayuda a identificar mecanísticamente los objetivos del modo de acción de la droga y proporcionar información útil que puede ser validada aún más por ensayos posteriores.
Recientemente empleamos los métodos descritos anteriormente para identificar compuestos antivirales que bloquearon eficientemente la infección por el CVA169no envuelto. En este documento, se describen y discuten los protocolos detallados que se utilizaron.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:824px;" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">AL-158127-500G</td>
			<td style="width:232px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa 488-conjugated anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:205px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:171px;">A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15290-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Anti-VP1 antibody</td>
			<td style="width:205px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:171px;">MAB979</td>
			<td style="width:232px;">Anti-Enterovirus 71 Antibody, cross-reacts with Coxsackie A16, clone 422-8D-4C-4D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beckman Coulter Cytometer</td>
			<td style="width:205px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:171px;">FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Corina</td>
			<td style="width:205px;">Molecular Networks GmbH</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">C3886-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">11995-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graphpad Prism</td>
			<td style="width:205px;">GraphPad</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">In vitro toxicology assay kit, XTT-based</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">TOX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:205px;">Sigma</td>
			<td style="width:171px;">M0512-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:205px;">GIBCO</td>
			<td style="width:171px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PyMol</td>
			<td style="width:205px;">Schr&#246;dinger</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">UCSF Chimera</td>
			<td style="width:205px;">University of California, San Francisco</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus a16

Los ensayos antivirales que examinan mecanísticamente la entrada viral son pertinentes para discernir en qué paso los agentes evaluados son más eficaces y permiten la identificación de los inhibidores de entrada viralcandidatos. Aquí, presentamos los enfoques experimentales para la identificación de moléculas pequeñas capaces de bloquear la infección por el coxsackievirus No envuelto A16 (CVA16) a través de la orientación a las partículas del virus o pasos específicos en la entrada viral temprana. Los ensayos incluyen el análisis de tiempo de adición de fármacos, el ensayo de unión viral basado en citometría de flujo y el ensayo de inactivación viral. También presentamos un protocolo de acoplamiento molecular que utiliza proteínas cápside de virus para predecir posibles residuos dirigidos por los compuestos antivirales. Estos ensayos deben ayudar en la identificación de agentes antivirales candidatos que actúan sobre la entrada viral. Las instrucciones futuras pueden explorar estos posibles inhibidores para el desarrollo de fármacos adicionales.

El ensayo de tiempo de adición de fármacos está indicado en la Figura 1 y muestra la influencia del tratamiento utilizando las moléculas pequeñas CHLA y PUG en la infección CVA16, ya sea la entrada previral (pretratamiento), durante la entrada viral (adición co-similar) o la entrada postviral ( post-infección). Ambas moléculas pequeñas sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad CVA16, ya sea en el pretratamiento de las células hué...

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Use of Viral Entry Assays and Molecular Docking Analysis for the Identification of Antiviral Candidates against Coxsackievirus A16

Uso de ensayos de entrada viral y análisis de acoplamiento molecular para la identificación de candidatos antivirales contra el coxsackievirus A16

El objetivo del protocolo es ilustrar los diferentes ensayos relacionados con la entrada viral que se pueden utilizar para identificar los inhibidores de entrada viralcandidatos.

Antiviral assays that mechanistically examine viral entry are pertinent to discern at which step the evaluated agents are most effective, and allow for ...

Este protocolo puede ayudar en el descubrimiento de moléculas pequeñas antivirales potenciales a través de un enfoque basado en mecanismos. El ensayo de tiempo de adición determina en qué paso de la infección la molécula pequeña exhibe su actividad antiviral. El acoplamiento molecular predice la interacción entre la molécula pequeña y las proteínas virales.Para evaluar la influencia de los fármacos en las células huésped antes de la infección viral, las células de RD de semillas en placas de 12 pozos a dos veces 10 a las quintas células por densidad de revestimiento de pozo. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5% durante la noche. A la mañana siguiente, tratar cada pozo de la monocapa RD con un compuesto de prueba de interés, en triplicado, a concentraciones no tóxicas en un mililitro de medio basal durante una o cuatro horas.Al final de la incubación del tratamiento, lavar las células con un mililitro de PBS antes de añadir 50 unidades de virus formadoras de placas en 300 microlitros de medio basal por pozo durante una hora, con balanceo cada 15 minutos. Al final de la incubación de la infección, lavar las células con PBS y superponer las células con un mililitro de medio basal fresco que contiene 0.8%metilcelulosa. Después de 72 horas en la incubadora de cultivo celular, lavar cada pozo con dos mililitros de PBS y fijar las células con 0,5 mililitros de 37%formaldehído por pozo durante 15 minutos.Al final de la fijación, lavar los pozos con PBS y manchar las células con 0,5 mililitros de 0,5% de solución violeta cristalina por pozo. Después de dos minutos, lave los pozos con una corriente suave de agua y deje que la placa se seque al aire. A continuación, coloque la placa sobre una caja de luz blanca para contar y calcule el porcentaje de células infectadas por coxsackievirus de acuerdo con la fórmula.Para el análisis de acoplamiento molecular, descargue moléculas 3D de los compuestos de prueba de PubChem. Si una molécula no tiene una estructura 3D cargada, descargue la estructura 2D o utilice la secuencia de cadenas SMILE para transformar la estructura en una molécula 3D a través de un programa molecular adecuado. A continuación, descargue una unidad de ensamblaje biológico viral de RCSB Protein Data Bank.Utilizando un programa de biocódica adecuado, elimine los disolventes del archivo Protein Data Bank, reemplace las cadenas laterales incompletas utilizando datos de la biblioteca de rotadores Dunbrack 2010 y agregue hidrógenos y cargas a la estructura como se informó anteriormente. Para acoplar los compuestos de prueba en la unidad de virus preparada, cargue el archivo compuesto de prueba en la Quimera de la Universidad de California en San Francisco como ligando y seleccione toda la proteína viral preparada como receptor para realizar el acoplamiento ciego. Para un acoplamiento adicional, limite el sitio de acoplamiento a la proteína viral a regiones de interés derivadas de los resultados de acoplamiento ciego reduciendo aún más el volumen de búsqueda.A continuación, cargue el archivo de acoplamiento en un sistema de gráficos moleculares adecuado para analizar las posiciones del modo de enlace. Seleccione el ligando para encontrar contactos polares desde el compuesto a la proteína viral, identificando los contactos polares con la opción de a cualquier átomo. Ambas moléculas pequeñas probadas en este experimento representativo, sólo produjeron un impacto marginal contra la infectividad del coxsackievirus A16, ya sea en el pretratamiento de las células huésped antes de la infección viral o en el tratamiento posterior a la infección.Por el contrario, las moléculas derogaron eficientemente la infección en más del 80% en el tratamiento de co-adición, lo que sugiere que los dos compuestos son los más eficaces cuando están presentes simultáneamente con las partículas del virus en la superficie de la célula huésped durante la infección. El análisis de unión basado en la citometría de flujo confirma que los dos taninos previnieron la entrada de infectividad del coxsackievirus A16 al impedir la unión de partículas virales a las células huésped. El acoplamiento molecular de los taninos indica que ambos se prevé que se adhi inicien en la región del cañón del pentámero del coxsackievirus, justo por encima de la entrada de bolsillo que contiene el factor de bolsillo y desempeña un papel importante para mediar en la unión al coxsackievirus y la entrada en la célula huésped.En estas proyecciones superficiales, se pueden observar los residuos únicos predichos a partir de los contactos polares de las pequeñas moléculas alrededor de la entrada de bolsillo, con asparagina-85, lisina-257, y asparagina-417 en común entre los dos taninos. Para el acoplamiento molecular, la topología de la proteína viral debe tenerse en cuenta al clasificar los marcos de unión. Experimentos adicionales podrían incluir la prueba de la actividad antiviral del compuesto en virus recombinantes, con mutaciones en los aminoácidos descubiertos para validar su importancia a la eficacia del fármaco.

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