Name: murine appendectomy model of chronic colitis associated colorectal cancer by precise localization of caecal patch
Uploaded: 2019-08-24T14:00:00
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Este trabajo cuenta con el apoyo parcial de los Fondos de Investigación Fundamental de la Universidad Central (G2018KY0302), el Fondo de Desarrollo de Investigación Fundamental Universitaria (KT00062), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81870380), y el Premio de Investigación Clínica de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Xi'an Jiaotong en China (NO. XJTU1AF-CRF-2015-029). Los autores agradecen al Dr. Chengxin Shi por sus sugerencias técnicas durante la fase de exploración temprana del modelo de apendicectomía murina, así como al patólogo Dr. Xi Liu por la evaluación de los resultados de tinción de H&E de colitis y tumores colorrectales. Y.L. realizó la demostración de cirugía, hizo análisis de datos y escribió el borrador del manuscrito; J.L., G.L., Z.P., y Y.M. participaron en la preparación quirúrgica, colecciones de tejidos y producción de video; M.Z. realizó la citometría de flujo y ELISA; Q.W. y H.X. proporcionaron el apoyo técnico para generar un modelo murino clínicamente relevante; R.X.Z. diseñó el estudio, supervisó la investigación y escribió y denitó el manuscrito; J.S. revisó el manuscrito.

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Xi'an Jiaotong (No. XJTULAC2019-1023).
1. Apendicectomía de ratones
<ol><li>House 8–10-week-old C57BL/6 ratones macho en un ambiente certificado libre de patógenos específicos (SPF) durante 1 semana antes de la cirugía.</li>
	<li>Prepare los siguientes instrumentos quirúrgicos estériles: un par de microtijeras, un par de microfórptos, dos tamaños (4-0 y ...

Se obtuvo un modelo de apendicectomía murino de cáncer colorrectal asociado a la colitis mediante pasos quirúrgicos con una alta tasa de supervivencia en ratones. En la mayoría de los casos, dado que el caecum se colocó debajo de la pared abdominal (TablaSuplementaria 1, Tabla Suplementaria 2y Figura2), era difícil prejuzgar su ubicación sin laparotomía. En este protocolo quirúrgico, se introdujo un paso fácil de tocar el bache, y también se proporcionó una evalu...

La apendicectomía clínica es un procedimiento quirúrgico estándar que implica la extirpación del apéndice principalmente debido a la inflamación (por ejemplo, apendicitis)1,2,3. Sin embargo, la función biológica del apéndice humano vermiforme sigue siendo controvertida4,5,6. El apéndice ha sido considerado como un remanente vestigial que se proyecta desde el cecum en el intestino grueso. Hasta hace poco, estudios evolutivos, inmunológicos, morfológicos y microbiológicos han sugerido que el apéndice puede poseer funciones distintas. Estas funciones incluyen la producción de inmunoglobinas (por ejemplo, IgA e IgG), una variedad de células B y células T críticas para respuestas inmunitarias adaptativas dentro de los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), y la reposición del intestino grueso con microbiotas comensales 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12.
Los estudios epidemiológicos clínicos de pacientes con apendicectomía previa o apendicitis aguda también han revelado sus posibles funciones en la patogénesis de enfermedades humanas, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), el cáncer colorrectal y el (p. ej., enfermedad de Parkinson y enfermedad cardiovascular)13,14,15,16,17,18. Por ejemplo, un gran estudio de cohorte de población asiática con 75.979 pacientes con apendicectomía mostró recientemente una asociación significativa entre la apendicectomía y el desarrollo posterior del cáncer colorrectal, uno de los tumores malignos más comunes con una alta incidencia y mortalidad14,19. En consecuencia, establecer un modelo adecuado de apendicectomía animal que se asemeje a un ser humano será útil para investigar las funciones biológicas y los mecanismos moleculares del apéndice en la patogénesis de la enfermedad.
Muchos mamíferos poseen un órgano similar a un apéndice o apéndice, incluyendo primates, lagomorfos (por ejemplo, conejos), algunos roedores y marsupiales20. Para animales de laboratorio pequeños y de uso común, el conejo posee el apéndice vermiforme que se asemeja morfológicamente al humano21,22, pero GALT en el conejo es extremadamente grande en comparación con el de los seres humanos, ya que la mayoría de los los tejidos linfoides también se encuentran en los parches de Peyer ubicados en los intestinos pequeños y grandes21. Además, el conejo muestra una estructura folicular linfoide diferente, distribución de células T, y la densidad de inmunoglobulina del humano, lo que hace que el estudio de sus apéndices inapropiado21.
Los ratones son el modelo animal más utilizado para estudiar la fisiopatología humana y probar las diversas terápticas existentes y novedosas23,24,25. Se cree que el único racimo linfoide grande blanco en el ápice del caecum en ratones, conocido como parche cecaico, realiza funciones similares al apéndice humano26,27,28. Sin embargo, es prácticamente difícil separar el parche cecaico de caecum en ratones. Hasta ahora, los procedimientos quirúrgicos comunes para inducir la apendicitis en un modelo de ratón implican una incisión relativamente grande (por ejemplo, 1-2 cm) a través de la pared abdominal para tener acceso a todo el caecum (TablaSuplementaria 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.
Aquí, para generar un modelo de apendicectomía asociado con la enfermedad gastrointestinal, este informe presenta un protocolo quirúrgico fácil para la extracción de parches de ceca en ratones. Esto es seguido por la administración combinada del agente genotóxico AOM y el agente proinflamatorio DSS para la inducción de cáncer colorrectal asociado a la colitis similar al observado en humanos. La EII ha demostrado ser un factor de riesgo de cáncer intestinal37,38. La combinación de cáncer colorrectal crónico asociado a colitis crónica inducido por AOM/DSS ha sido bien establecida, y los lectores pueden referirse a Neufert et al., y Thaker et al. para procedimientos detallados39,40. Este modelo de apendicectomía murino reproducible y rápida se puede utilizar para estudiar la inflamación intestinal modulada por apéndice y la microbiota de colon, especialmente en el desarrollo y progresión de la EII y el cáncer colorrectal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Azoxymethane&#65288;AOM</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Inc.</td>
			<td>A5486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran Sulfate Sodium Salt&#65288;DSS</td>
			<td>MP Biomedicals,Inc.</td>
			<td>160110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Entoiodine</td>
			<td>Shanghai likon high technology disinfection co. LTD</td>
			<td>310102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital caliper</td>
			<td>Ningbo yuanneng trading co. LTD</td>
			<td>4859263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Silk Sutures</td>
			<td>Yuanlikang co. LTD</td>
			<td>20172650032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-0 Prolene Sutures</td>
			<td>Yuanlikang co. LTD</td>
			<td>20172650032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric coagulation pen</td>
			<td>Chuang mei medical equipment co. LTD</td>
			<td>28221777292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable syringe 1ml</td>
			<td>Shengguang medical products co. LTD</td>
			<td>3262-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable syringe 10ml</td>
			<td>Shengguang medical products co. LTD</td>
			<td>3262-2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Medicinal alcohol</td>
			<td>Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD</td>
			<td>371402AAJ008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Inc.</td>
			<td>57-33-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological Saline</td>
			<td>Shandong qidu pharmaceutical co. LTD</td>
			<td>H37020766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Cotton Swab</td>
			<td>Henan ruike medical co., LTD</td>
			<td>RK051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments-Ophthalmic</td>
			<td>Jinzhong Shanghai co.LTD</td>
			<td>WA3050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine appendectomy model of chronic colitis associated colorectal cancer by precise localization of caecal patch

El apéndice humano ha sido implicado recientemente para desempeñar importantes papeles biológicos en la patogénesis de diversas enfermedades complejas, como el cáncer colorrectal, la enfermedad inflamatoria intestinal y la enfermedad de Parkinson. Para estudiar la función del apéndice, se ha establecido un modelo de apendicectomía murino asociado a la enfermedad intestinal y su protocolo paso a paso se describe aquí. Este informe introduce un protocolo fácil para la eliminación de parches de cecal en ratones seguido de la inducción química del cáncer colorrectal crónico asociado a la colitis utilizando una combinación de sulfato de dextran sódico (DSS) y azoximetano (AOM). Las células específicas de IgA y la concentración de IgA se redujeron significativamente tras la eliminación del parche ceaquídico en ratones machoC57BL/6 en comparación con los del grupo falso. La administración simultánea del 2% de DSS y AOM dio lugar a casi el 80% de supervivencia de ratones en grupos de farsa y apendicectomía sin pérdida significativa de peso corporal. Los resultados histológicos confirmaron la inflamación colónica y diferentes grados de adenocarcinoma. Este modelo se puede utilizar para el estudio del papel funcional del apéndice en el mantenimiento de la homeostasis de la microbiota intestinal y la patogénesis de la colitis intestinal y neoplasias malignas, así como para el desarrollo potencial de terapias de segmentación de fármacos.

Establecimiento del modelo de apendicectomía murina
Este modelo de apendicectomía murina de cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica se puede generar siguiendo los pasos quirúrgicos e inducción secuenciales como se ilustra en la Figura1. Las posiciones más frecuentes de caecum están en la fosa ilíaca izquierda y derecha seguida de la línea media del abdomen (Figura2). La tasa exitosa de prelocalizaci...

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Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch

El protocolo presentado describe una extirpación quirúrgica fácil del apéndice (parche cecaco) en un ratón seguido de la inducción del cáncer colorrectal asociado a la enfermedad inflamatoria intestinal. Este modelo de apendicectomía murina permite investigar el papel biológico del apéndice en la patogénesis de la enfermedad gastrointestinal humana.

Modelo de apendicectomía murine del cáncer colorrectal asociado a la colitis crónica por localización precisa del parche de Caecal

The human appendix has been recently implicated to play important biological roles in the pathogenesis of various complex diseases, such as colorectal ...

El protocolo general describe los procedimientos quirúrgicos fácilmente realizados para extraer el apéndice conocido como parche caecal en ratones. El modelo de apendicectomía murina se puede utilizar para estudiar las funciones biológicas del apéndice en la patogénesis de la enfermedad gastrointestinal humana. El apéndice humano es un órgano discutible.Estudios recientes han sugerido que el apéndice juega un papel importante en el mantenimiento de la salud intestinal. Para estudiar la función biológica del apéndice, la generación de un modelo animal de apendicectomía asociada a la enfermedad es fundamental. En este protocolo, describiremos un simple y seguro pasos quirúrgicos para extraer el apéndice, conocido como parche caecal en ratones.Para garantizar el éxito de este modelo, hay tres pasos clave como verá en el siguiente vídeo. Primero, localice el cecum de los ratones antes de la cirugía. Segundo, hacer una pequeña incisión en el abdomen.Tercero, desinfectar y cerrar el muñón de cecum. La primera parte, la apendicectomía de ratones. Preparar instrumentos quirúrgicos estériles y soluciones de limpieza antes de la cirugía.Anestesice y asegure el ratón en una plataforma en posición supina colocando cuatro tiras de cinta adhesiva médica a través de las extremidades para evitar el movimiento postural durante la cirugía. Toque suavemente todo el abdomen del ratón para encontrar la sensación de protuberancia. Cubra la cortina y desinfecte el área afeitada del abdomen del ratón lo más ancha posible usando dos veces de entoiodina.Haga una incisión longitudinal que va de 0,5 centímetros a un centímetro en la línea media del abdomen. De acuerdo con la ubicación predeterminada del cecum, busque el caecum y exteriorícelo suavemente durante aproximadamente un centímetro de largo para identificar el parche caecal. Utilice una solución salina fisiológica precalentó y estéril para hidratar el intestino.Para prevenir posibles complicaciones de sangrado e infección postoperatoria, ligar los vasos sanguíneos mesentéricos del cecum usando el 8-0 Sutura. Hidratar el cecum con la solución salina. Marque la región de resección usando la sutura 4-0 con bucle abierto cerca del ápice del cecum en el colon proximal.Corte el parche cecal debajo de la resección marcada usando micro-tijeras y limpie el contenido calcáreo residual con hisopos de algodón medicinal. Desinfectar el muñón de cecum con entoiodina. Cierre el muñón con sutura en marcha utilizando el 8-0 Sutura.Retire con cuidado el lazo de rosca 4-0, utilizado anteriormente para marcar la resección en el muñón de cecum. Esterilice la posición suturada usando entoiodina. Rehidratar la zona de corte con la solución salina.Cierre la capa de musculatura con sutura corriente usando 8-0 hilo de sutura. Cierre las capas de la piel con suturas interrumpidas con rosca de sutura 4-0. Desinfectar el corte quirúrgico dos veces con entoiodina.Luego, retire el yodo usando 75%alcohol médico. Gire suavemente el ratón hacia atrás. Inyectar por vía subcutánea 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal de buprenorfina y 0,4 mililitros de solución salina fisiológica.Y apoya el ratón en la almohadilla de calor, hasta que vuelva a la conciencia. Vuelva a colocar el ratón en la jaula estéril y vigile de cerca el ratón para detectar los signos de dolor durante tres días después de la cirugía para asegurar su recuperación. La segunda parte:Inducción del cáncer colorrectal asociado a la colitis con azoximetano, AOM, y Sulfato de sodio Dextran, DSS, siete días después de la apendicectomía.Descongelar una alícuota de AOM y diluirla a 1 miligramo por mililitro usando 0.9% de solución salina normal. Todo el proceso de preparación se lleva a cabo en la campana de humos. Disolver cuatro gramos de polvo DSS en 200 mililitros de agua autoclave para preparar 2%DSS.Cada jaula contiene cinco ratones. Realizar una inyección intraperitoneal de AOM con 0,01 mililitros por gramo por ratón basándose en su peso. Sustituya el agua autoclavada por 2%DSS durante cinco días.Los ratones serán alimentados con agua autoclavada durante dos ciclos adicionales. La tercera parte:Resultados. Los resultados de flujo y ELISA indican la eliminación exitosa del parche caecal.Este procedimiento puede contribuir a la reducción significativa de las células plasmáticas específicas de IgA, un cambio obvio de IgA secretor en el intestino grueso, en comparación con 3%DSS, que tiene una alta tasa de mortalidad y un cambio de peso significativo debido a heces sangrantes graves, prolapso de ano y abcess abdominal. El 2%DSS es adecuado para todo el proceso por su alta tasa de supervivencia a casi 80%y un cambio de peso razonable en grupos falsos y de apendicectomía. Como se muestra en estas imágenes, hemos inducido con éxito los tumores colorrectales asociados a la colitis.En las imágenes de tinción H&E, la flecha negra indica úlcera mucosa, la punta de flecha indica adenocarcinoma y una flecha blanca indica la infiltración de neutrófilos entre las glándulas. Se pueden observar diferentes etapas del adenocarcinoma tanto en grupos falsos como de apendicectomía. Este modelo de apendicectomía murina rentable se puede utilizar para responder a algunas preguntas importantes tales como: ¿cuál es el papel del apéndice en la regulación de las bacterias intestinales y cómo participa en la respuesta inmune en el tejido linfoide asociado al intestino.Recuerde, para evitar el daño en la adhesión del intestino, la ubicación previa del cecum y la pequeña incisión de la piel son importantes. Además, usamos el 2%DSS para inducir colitis. Pero una mayor concentración de DSS se puede utilizar para otras cepas de ratones.

Research

JoVE Journal

Medicine

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

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In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Investigación

Medicina

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane (AOM) and Dextran Sulfate Sodium (DSS)

Modeling Colitis-Associated Cancer with Azoxymethane AOM and Dextran Sulfate Sodium DSS

Modelado Colitis asociada a cáncer con azoximetano (AOM) y Sodio sulfato de dextrano (DSS)

Individuals with inflammatory bowel disease (IBD), such as Crohn's disease (CD) or ulcerative colitis (UC) are at increased risk of developing colorectal ...

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Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

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