Name: assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

ويعترف أصحاب البلاغ بالدعم المقدم من مركز ينبويا للبحوث، ينبويا (الذي يعتبر جامعياً) لمرافق الهياكل الأساسية.

أجريت التجربة على خلايا العين الأولية / الخلايا الجذعية المستمدة من عين الفأر ة المهق السويسرية. تمت الموافقة على استخدام الحيوانات لحصاد العيون لهذه التجربة من قبل اللجنة الأخلاقية الحيوانية المؤسسية، ينبويا (تعتبر جامعة) (رقم موافقة IEAC، 6a/19.10.2016).
1. الاستعدادات من الكواشف</p...

<ol>
	<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+the+challenge+to+enable+and+protect+vision:+the+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+oxidative+stress.">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).</li><li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+(ROS)+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling.">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li><li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults.">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).</li><li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited:+eye-sun+protection+factor+(E-SPF(R)),+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear.">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li><li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers:+A+major+health+problem.">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li><li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li><li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells:+A+possible+role+in+neurotoxicity.">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion.">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li></ol>

طريقة تلطيخ DCFDA الموصوفة هنا تمكن من تصور ROS في خلايا حية العين الأولية الماوس تعامل مع الأشعة فوق البنفسجية-C. ميزة طريقة تلطيخ هذه هو أنه يسمح أيضا للباحثين لدراسة الآثار الفورية للأشعة فوق البنفسجية -C (3 ساعات بعد التعرض UVC) على الخلايا الحية وتعدادها في وقت واحد لنسبة إيجابية ROS، وكذلك، ال...

سطح العين (OS) هو وحدة وظيفية تتكون أساسا من الطبقة الخارجية والظهارة الغدية للقرنية، الغدة lachrymal، الغدة meibomian، الملتحمة، جزء من هوامش غطاء العين والداخلية التي تشير عبر الترانسدوس1. تركز طبقة القرنية الشفافة على شكل قبة الضوء على شبكية العين. يتكون هذا النسيج اللاوعي من مكونات خلوية مثل الخلايا الظهارية والخلايا القرنية والخلايا الانائية والمكونات الخلوية مثل الكولاجين وجليكوزامينوجليكان2. يتم استنزاف المنطقة من الدموع التي توفر أيضا معظم المواد الغذائية. الموقع التشريحي لنظام التشغيل يجبرها على أن تكون على اتصال مباشر مع البيئة الخارجية، وغالبا ما يعرضها لمختلف المكونات القاسية مثل الضوء الساطع والميكروبات وجزيئات الغبار والمواد الكيميائية. هذا العامل يهيئ نظام التشغيل للإصابات الجسدية ويجعلها عرضة لمختلف الأمراض.
يحدث الإجهاد التأكسدي بسبب اختلال التوازن بين إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وآليات الدفاعات المضادة للأكسدة الذاتية3. يتم تصنيف ROS إلى جزيئات تفاعلية وجذور حرة ، وكلاهما مشتق من الأكسجين الجزيئي (O2)من خلال فوسفوريل الأكسدة الميتوكوندريا4. تتكون المجموعة السابقة من أنواع غير جذرية مثل بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)، الأكسجين المنفرد(1O2)، ويشمل هذا الأخير أنواعًا مثل أنيونات أكسيد فائق (O2-) ، وجذور الهيدروكسيل(•OH) ، من بين أمور أخرى. هذه الجزيئات هي المنتجات الثانوية للعمليات الخلوية العادية وأدوارها قد تورطت في وظائف فسيولوجية هامة مثل نقل الإشارة ، والتعبير الجيني ، والدفاع المضيف5. ومن المعروف أن إنتاج معزز من ROS يتم إنشاؤه استجابة لعوامل مثل غزو مسببات الأمراض ، xenobiotics ، والتعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV)4. هذا الإفراط في إنتاج ROS يؤدي إلى الإجهاد التأكسدي الذي يؤدي إلى تلف الجزيئات مثل الأحماض النووية والبروتينات والدهون6.
تتكون أشعة الشمس الطبيعية، المصدر الأكثر انتشارًا للأشعة فوق البنفسجية، من الأشعة فوق البنفسجية (400-320 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-B (320-290 نانومتر)، والأشعة فوق البنفسجية-C (290-200 نانومتر)7. وقد أبلغ عن وجود ارتباط عكسي بين الطول الموجي والطاقات الطيفية. وعلى الرغم من أن الغلاف الجوي يمتص الأشعة فوق البنفسجية - C الطبيعية، فإن المصادر الاصطناعية مثل مصابيح الزئبق وأدوات اللحام تنبعث منها، وبالتالي تشكل خطراً مهنياً. أعراض التعرض للعيون تشمل التهاب الكرات الضوئية والتهاب الكظر الملتحمة8. إنتاج ROS هي واحدة من الآليات الرئيسية لإلحاق الأشعة فوق البنفسجية الناجمة عن الضرر الخلوي9. في الدراسة الحالية، ونحن نبرهن على الكشف عن روس باستخدام 2',7'-ديكلوروديهيدروفلورسين diacetate (DCFDA) طريقة تلطيخ في خلايا سطح العين الأولية الماوس / الخلايا الجذعية المعرضة للأشعة فوق البنفسجية-C. تم التقاط الفلورية الخضراء باستخدام المجهر الفلوري. وكانت الخلايا ملطخة بصبغتين، هما Hoechst 33342 ويوديد البروبيديوم الأحمر، لتلطيخ الخلايا الحية والميتة، على التوالي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883</td>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>SA 003700112</td>
			<td>Sterile dishes for culturing the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AT007</td>
			<td>Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, EU Origin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM99955</td>
			<td>One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutMax</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Hybridization oven/UV cross linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used as a supplement to increase the cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gentle cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage

يتعرض سطح العين للبلى العادية بسبب عوامل بيئية مختلفة. ويشكل التعرض للأشعة فوق البنفسجية - C خطرا على الصحة المهنية. هنا، نُظهر تعرض الخلايا الجذعية الأولية من سطح العين للفأر ة إلى الأشعة فوق البنفسجية-C. أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) تشكيل هو قراءة مدى الإجهاد التأكسدي / الضرر. في الإعداد التجريبي في المختبر ، من الضروري أيضًا تقييم النسبة المئوية للخلايا الميتة الناتجة عن الإجهاد التأكسدي. في هذه المقالة، سوف نبرهن على 2',7'-Dichloroforesindiacetate (DCFDA) تلطيخ الأشعة فوق البنفسجية-C يتعرض الخلايا الجذعية الرئيسية سطح العين الماوس وقياسها على أساس الصور الفلورية من تلطيخ DCFDA. DCFDA تلطيخ يتوافق مباشرة مع جيل ROS. كما نبرهن على القياس الكمي للخلايا الميتة والحية عن طريق تلطيخ متزامن مع يوديد البروبيديوم (PI) وهويشت 3332 على التوالي والنسبة المئوية لخلايا DCFDA (ROS إيجابية) وPI الإيجابية.

DCFDA هو صبغة عديم اللون التي هي شكل من أشكال الفلورسين المختزلكيميائي استعمل كمؤشر للكشف عن روس في الخلايا. هذه الصبغة يحصل المحاصرين داخل الخلايا وتتأكسد بسهولة إلى الفلورسنت ديكلورودي هيدروفلورسين (DCF), التي تنبعث منها الفلورسيس الأخضر. يمكن الكشف عن هذا الفلورية باستخدام المجهر الفلوري....

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

يوضح هذا البروتوكول الكشف المتزامن لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والخلايا الحية والخلايا الميتة في الثقافات الأولية الحية من خلايا سطح العين الماوس. 2', 7'-Dichloroforesindiacetate, يتم استخدام يوديد البروبيديوم, وتلطيخ Hoechst لتقييم ROS, الخلايا الميتة, والخلايا الحية, على التوالي, تليها التصوير والتحليل.

تقييم الضرر التأكسدي في الخلايا السطحية الرئيسية للفأرة /الخلايا الجذعية استجابة للأضرار فوق البنفسجية-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

مرحباً بالجميع، اسمي د.بيباشا بوس. أعمل أستاذاً مشاركاً و مسؤولاً في مركز الخلايا الجذعية والطب التجديدي، مركز ينبويا للأبحاث، جامعة ينبويا، مانجالور، الهند. الآن نحن نذهب لشرح كيفية الكشف عن وجود لروس وهذا هو ، أنواع الأكسجين التفاعلي "في الثقافات الحية من الأسطح العينية الماوس التي تعرضت لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية- جيم.وميزة هذه التقنية هي أنه هنا يمكننا الكشف في وقت واحد عن وجود أنواع الأكسجين التفاعلية ، والخلايا الحية والميتة ، دون الحاجة إلى خلايا فيستر. مبدأ هذه التقنية يكمن أساسا في نفاذية الخلية الحية للصبغ DCFDA. DCFDA هو صبغة حية خلية عديم اللون، والتي خلال الأكسدة يحصل على التصرف من قبل أوكسيداسيس داخل الخلايا ويحصل على تحويلها إلى DCF الفلورية الخضراء.وبالتالي، فإن الفلوريس الأخضر تمكننا من الكشف عن وجود أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الحية. من ناحية أخرى، يوديد بروبيديوم هو صبغة نفاذية الخلايا الميتة حصرا التي الفلوريس الأحمر. بل هو صبغة مزدوجة rDNA المتشابكة.ومع ذلك ، فإن الصبغة هويشست هو permeant على حد سواء حية والخلايا الميتة. بل هو وصمة عار زرقاء اللون النووي. ومن ثم، فإن هذه طريقة بسيطة جداً يمكننا من خلالها اكتشاف وجود أنواع أكسجين تفاعلية في الثقافات طويلة الأجل بطريقة تعتمد على الزمن إلى جانب تقييم الخلايا الميتة.لوحة نقطة مليوني خلية لكل 35 ملليمتر الأطباق الثقافية. الخلايا التي نطبقها هي الخلايا من سطح العين الماوس. إزالة الحد الأقصى لحجم وسائل الإعلام من كل من الأطباق ثقافة الخلية.ترك وراءها حوالي 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام ثقافة الخلية على اتصال وثيق مع الخلايا. الحد الأدنى من وسائل الاعلام منع جفاف الخلايا. ومع ذلك ، فإن الغرض من الحد الأدنى من وسائل الإعلام هو السماح للاختراق الأقصى للتعرض UVC.تأخذ الخلايا تحت مصدر الأشعة فوق البنفسجية، يمكن أن يكون إما Crosslinker الأشعة فوق البنفسجية، أو يمكن أن يكون أي مصدر الأشعة فوق البنفسجية-C الأخرى. تعريض الخلايا لجرعة مختلفة من إشعاع UVC مثل واحد، 10، 100، 1، 000، و 10، 000 جول لكل متر مربع. عندما تتعرض الخلايا للأشعة فوق البنفسجية- C، ينبغي أن تكون الأغطية في وضع مفتوح.وهذا سيسمح أقصى اختراق للأشعة فوق البنفسجية -C إلى الخلايا وبالتالي تظهر الجرعة المثلى استجابة للخلايا للأشعة فوق البنفسجية-C. جلب الخلايا إلى غطاء محرك الهواء غطاء الرأس الهواء laminar وتجديد كل من الأطباق مع ملليلتر اثنين من وسائل الإعلام كاملة. هذا الوسائط كاملة يحتوي على 20٪ مصل الأبقار الجنين في DMEM, تستكمل مع المكملات الغذائية مثل 1٪ الحد الأدنى من الأحماض الأمينية غير الأساسية, وأيضا 1٪ المضادات الحيوية التي هي البنسلين وstreptomycin.بعد ذلك، بعد تجديد مع الحد الأقصى من حجم، وهذا هو ملليلتر اثنين من وسائل الإعلام كاملة، والعودة لوحات إلى الحاضنة واحتضان لمدة ثلاث ساعات من أجل رؤية الآثار المبكرة للأشعة فوق البنفسجية-C. إعداد خلية حية تلطيخ وسائل الإعلام في آخر 15 دقيقة من ثلاث ساعات الحضانة خلية UVC. يتم إعداد وسائل الاعلام تلطيخ في 10٪ FBS التي تحتوي على DMEM قبل warmed إلى 37 درجة.لصنع 10 ملليلتر من وسائل الاعلام تلطيخ، أولا إضافة خمسة ميكرولتر من DCFDA من مخزون من 10 ملليمولار وذلك للحصول على تركيز النهائي من خمسة ميكرومولار. مزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. ثانيا، إضافة خمسة ميكرولتر من الحل Hoechst من مخزون من 10 ملليغرام لكل مل للحصول على تركيز النهائي من خمسة ميكروغرام لكل مل.الآن مزيج جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. وأخيراً أضف 200 ميكرولترات من يوديد بروبديسيوم من مخزون من مليغرام واحد لكل مل للحصول على تركيز نهائي من 20 ميكروغرام لكل مل. مزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.الآن حل تلطيخ جاهزة للاستخدام. بعد ثلاث ساعات من التعرض بعد الحضانة، إزالة لوحات من حاضنة CO2. التعرق من وسائل الإعلام من كل من الأطباق التي تعرضت لجرعة مختلفة من UVC مثل واحد، 10، 100، 1، 000، و 10، 000 جول لكل متر مربع.الآن إضافة ملليلتر من الخلايا الطازجة على الهواء مباشرة تلطيخ وسائل الإعلام إلى كل من الأطباق بلطف من جانبي الأطباق. ارجع اللوحات إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون مرة أخرى وحضن لمدة 15 دقيقة لتلطين المباشر للخلايا. بعد 15 دقيقة من الحضانة في وسائل الاعلام تلطيخ الخلية الحية، وإزالة وسائل الاعلام تلطيخ من كل من الأطباق التي تحتوي على الخلايا المعرضة لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية-C.قم بتجديد الخلايا بمليلترين من الوسائط الكاملة. الآن الخلايا جاهزة للعرض. الآن ضع خلايا التحكم تحت المجال المشرق من جهاز التصوير الفلورسنت.الخلايا تبدو طبيعية على ما يبدو لأنها خلايا التحكم. تحت الحقل الأزرق يمكننا الخلايا الكلية المفلورة. تحت الحقل الأخضر يظهر جيل ROS.منذ هذه هي خلايا التحكم، لا يوجد ROS ولدت. تحت الحقل الأحمر، وروبودييوم يوديد الخلايا الميتة الملون مرئية. ثم الحفاظ على الأشعة فوق البنفسجية يتعرض 100 جول لكل متر مربع تحت حقل مشرق.تحت الحقل الأزرق، وأيضا يمكننا أن نرى العدد الإجمالي للخلية تحت الحقل الأزرق. ومع ذلك، عندما نتعرض للحقل الأخضر، وينظر DCFDA الخلايا الإيجابية، وأيضا PI خلايا ميتة إيجابية وينظر. وأخيرا، ضع جرعة الأشعة فوق البنفسجية القصوى، وهذا هو 10،000 جول لكل متر الخلايا المكشوفة مربع، تحت حقل مشرق.يمكننا أن نرى مورفولوجيا الخلية غير الطبيعية. ومع ذلك ، تحت الحقل الأزرق يمكننا أن نرى الخلايا الزرقاء الكلية. تحت الحقل الأخضر، وينظر الأخضر الفلورية DCFDA الخلايا الإيجابية تشير إلى جيل ROS.عندما تتعرض الخلايا للحقل الأحمر، كانت جميع الخلايا الفلوريسكينغ الأحمر مما يدل على عدد كبير من موت الخلايا عندما يتم التعامل مع الخلايا مع 10،000 جول لكل متر مربع من جرعة الأشعة فوق البنفسجية. الآن ترتيب الصور التي تم التقاطها في قنوات مختلفة في لوحة صورة مركبة واحدة المقابلة لجرعات الأشعة فوق البنفسجية C والضوابط غير مكشوف. يتم ترتيب الصور في لوحة واحدة في المجموعة.أولاً، الحقل المشرق. ثانياً، البقعة النووية الزرقاء (هويشست) ثالثا ، مادة يوديد البروديوم تلطيخ كما للنيات الميتة.رابعاً، DCFDA للخلايا الإيجابية ROS. وخامساً، الصورة المدمجة. عندما ننظر إلى الصف الأول والثاني من الصور، وهذا هو التحكم غير المكشوف والخلايا المعرضة لجرعة UVC جول واحد لكل متر مربع، لاحظنا أنه لم يكن هناك PI ولا ROS الخلايا الإيجابية التي كانت مضاءة، مما يشير إلى غياب كامل للروس وموت الخلايا في ضوابط غير مكشوفة ومثل هذه جرعة منخفضة UVC من جول واحد لكل متر مربع.الآن القادمة إلى الصف الثالث من الصور المركبة من الخلايا التي تعرضت ل100 جول لكل متر مربع. نسبة منخفضة جدا من الخلايا، حوالي 10٪ كانت إيجابية لكل من PI وDCFDA في هذه الجرعة، مما يدل على انخفاض كمية من جيل ROS وموت الخلايا. الآن ننتقل إلى مزيد من جرعة أعلى من التعرض للإشعاع UVC، وهذا هو 1،000 جول لكل متر مربع كما هو مبين في الصف الرابع من الصورة المركبة.هنا، كان حوالي 70٪ من الخلايا إيجابية لPI وDCFDA. وأخيرا ، ننتقل إلى أعلى جرعة من التعرض للأشعة فوق الزعنفة ، وهذا هو 10000 جول لكل متر مربع كما هو الحال في الصف الخامس من الصورة المركبة. هنا وجدت أن ما يقرب من 100٪ من الخلايا كانت إيجابية لكل من PI وDCFDA، مما يدل على موت 100٪ خلية وروز جيل في هذه الجرعة UVC خاصة.نقل الصور إلى برنامج التصوير. فتح أول صورة زرقاء تشير إلى النوى الملطخة Hoescht، وهذا هو العدد الإجمالي للخلايا. افتح أداة العد وانقر فوق كل خلية واحدة في كل مرة للحصول على الرقم.الآن فتح الصورة التي تم التقاطها تحت القناة الحمراء تشير إلى PI الخلايا الميتة إيجابية. افتح أداة العد وانقر فوق كل نقطة حمراء تشير إلى عدد الخلايا الميتة الإيجابية PI. مرة واحدة في عد الخلايا الميتة هو أكثر، انقر على القناة الخضراء القبض على الخلايا وفتح أداة العد وانقر فوق كل من البقع الخضراء التي تشير إلى الخلايا التي تظهر جيل ROS.استكمال عد الخلايا الخضراء التي تم التقاطها تحت القناة الخضراء، ثم استخدام الصيغة تعداد النسبة المئوية لوفيات الخلايا عن طريق تلف UVC والنسبة المئوية لإنتاج ROS بواسطة تلف UVC. يتم حساب هذا باستخدام عدد الصيغة البسيطة للخلايا الإيجابية PI، وهذا هو الخلايا المفلورة الحمراء، مقسوما على عدد من الخلايا الإيجابية Hoechst مضروبة في 100. النسبة المئوية لإنتاج ROS بواسطة أضرار الأشعة فوق البنفسجية يتم حسابها باستخدام الصيغة، عدد DCFDA إيجابية، أو الخلايا الفلورية الخضراء، مقسوما على عدد من الخلايا الإيجابية Hoechst مضروبة في 100.وبمجرد حصولك على كل من النسب المئوية، وهي النسبة المئوية لوفيات الخلايا والنسبة المئوية لإنتاج ROS، استخدم هذه القيم لرسم رسم بياني شريطي. يشير المحور س إلى جرعة الأشعة فوق البنفسجية، في حين يشير المحور ص إلى النسبة المئوية للخلايا. تشير الأشرطة الخضراء إلى النسبة المئوية لـ ROS، في حين يشير الشريط الأحمر إلى النسبة المئوية لوفيات الخلايا.على التحليل, ومن الواضح أن في جرعة UVC 100 جول هناك 10٪ ROS توليد الخلية، فضلا عن موت خلية 10٪.10٪. في حين أن في جرعة UVC 10 التي أثيرت إلى ثلاثة جول لكل متر مربع, 70٪ أظهرت الخلايا روز جيل وكذلك موت الخلايا. بينما في أعلى جرعة من UVC، وهذا هو 10 التي أثيرت إلى أربعة جول لكل متر مربع، حوالي 100٪ أظهرت الخلايا موت الخلايا وكذلك إنتاج ROS.وبالتالي، يمكن استنتاج أن هناك علاقة إيجابية قوية بين جيل ROS وموت الخلايا. في الختام ، هذه التقنية هي مفيدة جدا لتقييم المتزامنة لأنواع الأكسجين التفاعلية ، والخلايا الحية والميتة في العيش ، وثقافة الحدث العادي. هذه التقنية مفيدة أيضا لتقييم محدود لأنواع الأكسجين التفاعلية، والخلايا الحية والميتة، في الثقافات على المدى الطويل التي تعرضت لمختلف العوامل الضارة الخلايا مثل الأشعة فوق البنفسجية، أو العوامل الكيميائية.ويمكن لهذه التقنية أيضا توجيه الباحث لتحديد الوقت الأمثل لحصاد الخلايا مثل في 50٪ ROS، 75٪ ROS، وذلك وهكذا دواليك كما يمكن أن يكون هناك للعديد من التطبيقات المصب، مثل QR إلى PCR ونشاف الغربية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات تكون الميالين

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

تعظيم الاستفادة من الفحص الجرح خدش للكشف عن تغيرات في الفئران الوسيطة اللحمية الهجرة الخلية بعد الأضرار التي كتبها القابلة للذوبان استخراج دخان السجائر

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

أحادي ة الحرمان البصري والبصري قياس الدونة الهيمنة في القشرة البصرية الابتدائية الماوس

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...