Name: assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Forfatterne anerkender støtte fra Yenepoya Research Centre, Yenepoya (anses for at være universitet) for infrastrukturfaciliteter.

Forsøget blev udført på primære okulære celler / stamceller stammer fra den schweiziske albino museøje. Brugen af dyr til høst af øjnene til dette eksperiment blev godkendt af Den Institutionelle Etiske Komité for Dyrs Dyr, Yenepoya (anses for at være universitet) (IEAC-godkendelsesnummer, 6a/19.10.2016).
1. Præparater af reagenser
BEMÆRK: Afledning af primære celler/stamceller fra museoklær overflade ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. D...

<ol>
	<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+the+challenge+to+enable+and+protect+vision:+the+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+oxidative+stress.">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).</li><li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+(ROS)+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling.">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li><li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults.">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).</li><li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited:+eye-sun+protection+factor+(E-SPF(R)),+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear.">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li><li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers:+A+major+health+problem.">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li><li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li><li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells:+A+possible+role+in+neurotoxicity.">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion.">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li></ol>

Den DCFDA farvning metode, der er beskrevet her gør det muligt visualisering af ROS i mus primære okulære levende celler behandlet med UV-C-stråling. En fordel ved denne farvning metode er, at det også giver forskerne mulighed for at studere de umiddelbare virkninger af UV-C (3 timer efter UVC eksponering) på de levende celler og deres samtidige optælling for den procentdel af ROS positive, samt, døde celler. Da farvningsmetoden anvendes på levende celler, kan cellerne desuden inkuberes yderligere i de samme med...

Den okulære overflade (OS) er en funktionel enhed, der hovedsagelig består af det ydre lag og kirtelepithelia af hornhinden, lachrymal kirtel, meibomiankirtel, konjunktiva, en del af øjenlåget margener og innervations at transduce signaler1. Den gennemsigtige kuppel formet hornhinde lag fokuserer lys på nethinden. Denne avaskulære væv er sammensat af cellulære komponenter såsom epitelceller, keratorer, og endotelceller og acellulære komponenter såsom kollagen og glycosaminoglycans2. Området er drænet af tårer, der også leverer de fleste af de næringsstoffer. Den anatomiske position af OS tvinger det til at være i direkte kontakt med det ydre miljø, ofte udsætter det for forskellige barske komponenter såsom stærkt lys, mikrober, støvpartikler og kemikalier. Denne faktor prædisponerer OS til fysiske skader og gør det tilbøjelige til forskellige sygdomme.
Oxidativ stress er forårsaget på grund af uligevægt mellem produktionen af reaktive ilt arter (ROS) og endogene antioxidant forsvar mekanismer3. ROS er klassificeret i reaktive molekyler og frie radikaler, som begge er afledt af molekylær ilt (O2)gennem mitokondriel oxidativ fosforylering4. Den tidligere gruppe består af ikke-radikale arter som hydrogenperoxid (H2O2), singlet oxygen (1O2), og sidstnævnte omfatter arter som superoxidanioner (O2-) og hydroxylradikaler (•OH), blandt andre. Disse molekyler er biprodukter af normale cellulære processer og deres roller har været involveret i vigtige fysiologiske funktioner såsom signal transduktion, genekspression, og vært forsvar5. En forbedret produktion af ROS er kendt for at blive genereret som reaktion på faktorer som patogen invasion, xenobiotika, og eksponering for ultraviolet (UV) stråling4. Denne overproduktion af ROS resulterer i oxidativstress, der fører til skader på molekyler som nukleinsyrer, proteiner og lipider6.
Naturligt sollys, den mest dominerende kilde til UV-stråling, er sammensat af UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm), og UV-C (290-200 nm)7. Der er rapporteret om en omvendt sammenhæng mellem bølgelængden og spektrale energier. Selv om naturlig UV-C-stråling absorberes af atmosfæren, udsender kunstige kilder såsom kviksølvlamper og svejseinstrumenter og udgør derfor en erhvervsrisiko. Symptomer på eksponering for øjne omfatter fotokeratitis og fotokeratoconjunctivitis8. Produktion af ROS er en af de vigtigste mekanismer til at påføre UV-induceret cellulære skader9. I den aktuelle undersøgelse påviser vi påvisning af ROS ved hjælp af 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) farvningsmetode i de primære okulære overfladeceller/stamceller, der udsættes for UV-C. Den grønne fluorescens blev fanget ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Cellerne var kontrafarvede med to farvestoffer, Hoechst 33342 og rød propidiumiodid, for at plette henholdsvis levende og døde celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883</td>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>SA 003700112</td>
			<td>Sterile dishes for culturing the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AT007</td>
			<td>Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, EU Origin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM99955</td>
			<td>One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutMax</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Hybridization oven/UV cross linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used as a supplement to increase the cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gentle cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage

Okulær overflade udsættes for regelmæssig slitage på grund af forskellige miljømæssige faktorer. Udsættelse for UV-C-stråling udgør en sundhedsrisiko på arbejdspladsen. Her demonstrerer vi eksponeringen af primære stamceller fra museoklær overflade til UV-C-stråling. Reaktiv iltarter (ROS) dannelse er udlæsningen af omfanget af oxidativ stress / skade. I en eksperimentel in vitro indstilling, er det også vigtigt at vurdere procentdelen af døde celler genereret på grund af oxidativstress. I denne artikel vil vi demonstrere 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate (DCFDA) farvning af UV-C eksponeret mus primære okulære overflade stamceller og deres kvantificering baseret på fluorescerende billeder af DCFDA farvning. DCFDA farvning svarer direkte til ROS generation. Vi demonstrerer også kvantificeringen af døde og levende celler ved samtidig farvning med propidiumiodid (PI) og Hoechst 3332 henholdsvis og procentdelen af DCFDA (ROS positive) og PI positive celler.

DCFDA er et farveløst farvestof, der er en kemisk reduceret form for fluorescein, der anvendes som indikator for påvisning af ROS i celler. Dette farvestof bliver fanget inde i celler og er let oxideret til fluorescerende dichlorodihydrofluorescein (DCF), som udsender en grøn fluorescens. Denne fluorescens kan påvises ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. Cellerne kan visualiseres og korreleres med ROS-akkumulering som følger: (i) levende celler uden ROS udsender høj blå fluorescens; ii) levende celler med ROS-...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Denne protokol viser samtidig påvisning af reaktive iltarter (ROS), levende celler og døde celler i levende primære kulturer fra museoklære overfladeceller. 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate, propidiumiodid og Hoechst farvning anvendes til at vurdere henholdsvis ROS, døde celler og levende celler efterfulgt af billeddannelse og analyse.

Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Hej alle, mit navn er Dr.Bipasha Bose. Jeg arbejder som lektor og ansvarlig i Stamceller og Regenerative Medicine Center, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, Indien. Nu vil vi vise, hvordan man kan opdage for tilstedeværelsen for ROS, der er, reaktive ilt arter "i de levende kulturer fra musen okulære overflader, der har været udsat for forskellige doser af ultraviolet-C stråling.Fordelen ved denne teknik er, at vi her samtidig kan detektere for tilstedeværelsen af reaktive iltarter, levende og døde celler, uden at det er nødvendigt at have Vester-celler. Princippet i denne teknik hovedsagelig ligger i levende celle permeabilitet af farvestoffet DCFDA. DCFDA er en levende celle permeant farveløs farvestof, som under oxidativstress bliver handlet på af de intracellulære oxidases og bliver omdannet til grøn fluorescerende DCF.Derfor giver den grønne florescence os mulighed for at opdage for tilstedeværelsen af reaktive iltarter i de levende celler. På den anden side er propidium iodid et udelukkende dødt cellepermeant farvestof, som fluorescerer rødt. Det er en rDNA dobbelt-strandede intercalating farvestof.Men farvestoffet Hoechst er gennemtrængende for både de levende og døde celler. Det er en blå farve nuklear plet. Derfor er dette en meget enkel metode, hvor vi kan opdage for tilstedeværelsen af reaktive iltarter i langsigtede kulturer på en tidsafhængig måde sammen med vurderingen af døde celler.Pladepunkt to millioner celler pr 35 millimeter kultur retter. De celler, vi anvender, er cellerne fra musens okulære overflade. Fjern den maksimale mængde medier fra hver af cellerkulturretterne.Efterlad omkring 500 mikroliter af cellekultur medier i tæt kontakt med cellerne. Minimal mængde medier vil forhindre tørring af cellerne. Formålet med minimal mængde medier er dog at tillade maksimal penetration af UVC-eksponering.Tag cellerne under en UV-kilde, kan det være enten en UV Crosslinker, eller kan være enhver anden ultraviolet-C kilde. Eksponere cellerne til forskellige dosering af UVC-stråling såsom en, 10, 100, 1, 000, og 10,000 joule per meter kvadrat. Når cellerne har udsat for ultraviolet-C-stråling, skal lågene være i åben position.Dette vil give maksimal penetration af ultraviolet-C til cellerne og dermed vise den optimale dosis-respons af cellerne til ultraviolet-C stråling. Bring cellerne til laminar luftstrømmen hætte og genopfyld hver af retterne med to milliliter komplette medier. Dette komplette medie indeholder 20% føtal kvæg serum i DMEM, suppleret med kosttilskud såsom 1% minimum ikke-essentielle aminosyrer, og også 1%antibiotikum, der er penicillin og streptomycin.Derefter, efter genopfyldning med maksimal volumen, det vil sige to milliliter komplette medier, returnere pladerne til inkubatoren og inkubere i en periode på tre timer for at se tidlige virkninger af ultraviolet-C stråling. Forbered de levende cellefarvningsmedier i de sidste 15 minutter af tre timers post UVC celle inkubation. Farvning medier er udarbejdet i 10% FBS indeholder DMEM forvarmt til 37 grader.For at gøre 10 milliliter farvning medier, først tilføje fem microliter af DCFDA fra en bestand på 10 millimolar for at opnå en endelig koncentration på fem mikromolar. Bland godt ved pipettering op og ned. For det andet tilsættes fem mikroliter Hoechst-opløsning fra en bestand på 10 mg pr. ml for at opnå en endelig koncentration på fem mikrogram pr. ml.Nu blandes godt ved pipetting op og ned. Tilsættes endelig 200 mikroliter propidiumidodid fra en bestand på 1 mg pr. ml for at opnå en endelig koncentration på 20 mikrogram pr. ml. Bland godt ved pipettering op og ned.Nu er farvningsopløsningen klar til brug. Efter tre timers inkubation efter UVC-eksponering fjernes pladerne fra CO2-inkubatoren. Aspirere ud medierne fra hver af de retter, der har været udsat for forskellige doser af UVC såsom en, 10, 100, 1, 000, og 10,000 joule per meter kvadrat.Nu tilføje to milliliter frisklavet levende celle farvning medier til hver af retterne forsigtigt fra siderne af retterne. Pladerne returneres igen til CO2-inkubatoren og inkuberes i 15 minutter for farvning af levende celler. Efter 15 minutters inkubation i de levende cellefarvningsmedier fjernes farvningsmediet fra hver af de retter, der indeholder celler, der udsættes for forskellige doser ultraviolet C-stråling.Genopfyld cellerne med to milliliter komplet medie. Nu er cellerne klar til visning. Placer nu kontrolcellerne under lysfeltet i lysstofrør.Cellerne ser tilsyneladende normale, da de er kontrolceller. Under det blå felt kan vi fluorescerende totalceller. Under det grønne felt viser ROS generation.Da disse er kontrolceller, er der ikke genereret ROS. Under det røde felt er propidiumdodidfarvede døde celler synlige. Hold derefter UV-eksponerede 100 joule pr. meter kvadrat under det lyse felt.Under det blå felt, og også kan vi se det samlede cellenummer under det blå felt. Men når vi udsætter for grønt felt, ses DCFDA positive celler, og også PI positive døde celler ses. Endelig placere den maksimale UV-dosis, det er 10,000 joule per meter kvadratsynlige celler, under det lyse felt.Vi kan se unormal cellemorfologi. Men under det blå felt kan vi se samlede blå celler. Under det grønne felt ses grønne fluorescerende DCFDA-positive celler, der angiver ROS-generationen.Når cellerne udsættes for rødt felt, fluorescerede alle cellerne rødt, hvilket indikerer et stort antal celledød, når cellerne behandles med 10.000 joule pr. meter kvadrat af UV-dosering. Nu arrangere billederne taget i forskellige kanaler i en enkelt sammensat billede panel svarende til ultraviolet-C doser og ueksponerede kontroller. Billederne er arrangeret i et enkelt panel i gruppen.Først det lyse felt. For det andet Hoechst blå nukleare plet. For det tredje, propidium iodid farvning som for døde kerner.Fjerde, DCFDA for ROS positive celler. Og for det femte det flettede billede. Når vi ser på den første og anden række af billeder, det er ueksponeret kontrol og cellerne udsat for UVC dosis en joule per meter kvadrat, vi observerede, at der hverken var PI eller ROS positive celler, der havde tændt op, hvilket indikerer en fuldstændig mangel på ROS og celledød i ueksponerede kontroller og sådan en lav UVC dosis på en joule per meter kvadrat.Nu kommer til den tredje række af sammensatte billeder af de celler, der blev udsat for 100 joule per meter kvadrat. En meget lav procentdel af celler, omkring 10% var positive for både PI og DCFDA ved denne dosis, hvilket indikerer lav mængde af ROS generation og celledød. Nu går vi videre til en yderligere højere dosis af UVC stråling, det vil sige 1.000 joule per meter kvadrat som angivet i fjerde række af det sammensatte billede.Her var omkring 70% af cellerne positive for PI og DCFDA. Endelig går vi videre til den højeste dosis af UVC eksponering, det vil sige 10.000 joule per meter kvadrat som repræsenteret i femte række af det sammensatte billede. Her blev fundet, at næsten 100% af cellerne var positive for både PI og DCFDA, hvilket indikerer en 100% celledød og ROS generation på denne særlige UVC dosis.Overfør billederne til billedbehandlingssoftwaren. Åbn først det blå billede, der angiver Hoescht-defarvede kerner, dvs. Åbn optællingsværktøjet, og klik på hver af cellerne én ad gangen for at få nummeret.Åbn nu billedet taget under den røde kanal, der angiver PI positive døde celler. Åbn optællingsværktøjet, og klik på hver af de røde pletter, der angiver antallet for pi-positive døde celler. Når optællingen af de døde celler er overstået, skal du klikke på den grønne kanal erobrede celler og åbne tælleværktøjet og klikke på hver af de grønne pletter, der angiver de celler, der viser ROS generation.Gennemfør optællingen af de grønne celler, der er fanget under den grønne kanal, og brug derefter formlen optælle procentdelen af celledød ved UVC-skader og procentdel af ROS-produktion ved HJÆLP AF UVC-skader. Dette beregnes ved hjælp af det enkle formelnummer pi-positive celler, det vil sige de røde fluorescerende celler, divideret med antallet af Hoechst positive celler ganget med 100. Procentdel af ROS produktion med UV-skader beregnes ved hjælp af formlen, antallet af DCFDA positive, eller grønne fluorescerende celler, divideret med antallet af Hoechst positive celler ganget med 100.Når du har både procenterne, det vil sige procentdelen af celledød og procentdelen af ROS-produktion, skal du bruge disse værdier til at afbilde en søjlegraf. X-akse angiver doseringen af UV, mens y-akse angiver procentdelen af celler. De grønne bjælker angiver procentdelen af ROS-generation, mens den røde bjælke angiver procentdelen af celledød.Ved analyse, Det er indlysende, at ved UVC dosis 100 joule der er 10% ROS generere celle samt en 10% celledød. Der henviser til, ved UVC dosis 10 rejst til tre joule per meter kvadrat, 70% celler udstillet ROS generation samt celledød. Mens der ved den højeste dosis af UVC, det er 10 rejst til fire joule per meter kvadrat, omkring 100% celler udstillet celledød samt ROS produktion.Derfor kan det konkluderes, at der er en stærk positiv sammenhæng mellem ROS generation og celledød. Afslutningsvis er denne teknik meget praktisk til samtidig vurdering af reaktive iltarter, levende og døde celler i levende, normal begivenhedskultur. Denne teknik er også nyttig til begrænset vurdering af reaktive iltarter, levende og døde celler, i langsigtede kulturer, der har været udsat for forskellige celle skadelige stoffer såsom ultraviolet stråling, eller kemiske agenser.Og denne teknik kan også guide en forsker til bestemmelse af den optimale tid til høst af cellerne sådan på 50% ROS, 75% ROS, så og så videre som der kan være for mange downstream applikationer, såsom QR til PCR og vestlige blotting.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produktion og anvendelse af Lentivirus til selektivt at transducere Primary oligodendrocyt precursorceller for<em&gt; In vitro</em&gt; myelinering Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering af såret Scratch-analysen til at påvise ændringer i murine Mesenchymale stromacelle Migration efter skade ved Opløselig Cigaret røgekstrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik Target Mikroinjektion til udviklingslandene<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Vækst af mus Preantral follikler Under simulerede vægtløshed

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anvendelse af RNAi og Heat-shock-induceret transskription faktor udtryk til at omprogrammere kønsceller til neuroner i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion og validering af cellulære gulne i primære humane celler

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monocular Visuel afsavn og okulær dominans Plasticity Måling i musen primære visuelle cortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...