Name: assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

De auteurs erkennen de steun van het Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Geacht universiteit) voor de infrastructurele faciliteiten.

Het experiment werd uitgevoerd op primaire oculaire cellen/ stamcellen afgeleid van het Zwitserse albino muisoog. Het gebruik van dieren voor het oogsten van de ogen voor dit experiment werd goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor het ethisch onderzoek van dieren, Yenepoya (geacht universiteit) (IEAC-goedkeuringsnummer, 6a/19.10.2016).
1. Voorbereidingen van reagentia
OPMERKING: De afleiding van primaire cellen/stamcellen van het oogoppervlak van de muis valt...

<ol>
	<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+the+challenge+to+enable+and+protect+vision:+the+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+oxidative+stress.">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).</li><li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+(ROS)+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling.">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li><li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults.">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).</li><li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited:+eye-sun+protection+factor+(E-SPF(R)),+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear.">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li><li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers:+A+major+health+problem.">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li><li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li><li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells:+A+possible+role+in+neurotoxicity.">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion.">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li></ol>

De DCFDA kleuring methode hier beschreven maakt de visualisatie van ROS in de muis primaire oculaire levende cellen behandeld met UV-C straling. Een voordeel van deze kleuringsmethode is dat het ook de onderzoekers in staat stelt om de onmiddellijke effecten van UV-C (3 uur na UVC-blootstelling) op de levende cellen en hun gelijktijdige opsomming voor het percentage ROS-positieve, evenals dode cellen te bestuderen. Bovendien, als de kleuring methode wordt gebruikt op de levende cellen, kunnen de cellen verder worden geï...

Het oculaire oppervlak (OS) is een functionele eenheid voornamelijk samengesteld uit de buitenste laag en klierepithelia van hoornvlies, lachrymale klier, meibomian klier, bindvlies, een deel van de ooglid marges en innervations die transduce signalen1. De transparante koepelvormige hoornvlieslaag richt licht op het netvlies. Dit avasculaire weefsel bestaat uit cellulaire componenten zoals epitheelcellen, keratocyten en endotheelcellen en acellulaire componenten zoals collageen en glycosaminoglycans2. Het gebied wordt afgevoerd door tranen die ook de meeste voedingsstoffen leveren. De anatomische positie van het OS dwingt het om in direct contact met de externe omgeving te zijn, vaak bloot stellen aan verschillende harde componenten zoals fel licht, microben, stofdeeltjes en chemicaliën. Deze factor predisponeert het OS voor lichamelijkletsel en maakt het gevoelig voor verschillende ziekten.
Oxidatieve stress wordt veroorzaakt door het gebrek aan evenwicht tussen de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en de endogene anti-oxidantafmechanismen3. ROS worden ingedeeld in reactieve moleculen en vrije radicalen, die beide afkomstig zijn van moleculaire zuurstof (O2) door mitochondriale oxidatieve fosforylatie4. De eerste groep bestaat uit niet-radicale soorten zoals waterstofperoxide (H2O2),singlet zuurstof (1O2) en de laatste omvat soorten zoals superoxide anionen (O2-), en hydroxyl radicalen(•OH), onder anderen. Deze moleculen zijn bijproducten van normale cellulaire processen en hun rollen zijn betrokken bij belangrijke fysiologische functies zoals signaaltransductie, genexpressie en hostdefense5. Een verbeterde productie van ROS is bekend te worden gegenereerd in reactie op factoren zoals pathogene invasie, xenobiotica, en blootstelling aan ultraviolette (UV) straling4. Deze overproductie van ROS resulteert in oxidatieve stress die leidt tot de schade van moleculen zoals nucleïnezuren, eiwitten en lipiden6.
Natuurlijk zonlicht, de meest overheersende bron van UV-straling, bestaat uit UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) en UV-C (290-200 nm)7. Een omgekeerde correlatie tussen de golflengte en spectrale energieën is gemeld. Hoewel natuurlijke UV-C-straling door de atmosfeer wordt geabsorbeerd, stoten kunstmatige bronnen zoals kwiklampen en lasinstrumenten uit en vormen daarom een beroepsrisico. Symptomen van blootstelling aan de ogen zijn fotokeratitis en photokeratoconjunctivitis8. Productie van ROS is een van de belangrijkste mechanismen van het toebrengen van UV-geïnduceerde cellulaire schade9. In de huidige studie tonen we de detectie van ROS aan met behulp van de 2',7'-Dichloordihydrofluorescelaat (DCFDA) kleuringsmethode in de primaire oculaire oppervlaktecellen/stamcellen van de muis die zijn blootgesteld aan UV-C. De groene fluorescentie werd vastgelegd met behulp van fluorescerende microscopie. Cellen werden tegengekleurd met twee kleurstoffen, Hoechst 33342 en rode propidiumjodide, om de levende en dode cellen te bevlekken, respectievelijk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883</td>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>SA 003700112</td>
			<td>Sterile dishes for culturing the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AT007</td>
			<td>Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, EU Origin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM99955</td>
			<td>One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutMax</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Hybridization oven/UV cross linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used as a supplement to increase the cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gentle cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage

Het oculaire oppervlak wordt onderworpen aan regelmatige slijtage als gevolg van verschillende omgevingsfactoren. Blootstelling aan UV-C-straling vormt een gevaar voor de gezondheid op het werk. Hier tonen we de blootstelling van primaire stamcellen van het oogoppervlak van de muis aan UV-C-straling. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) vorming is de uitlezing van de omvang van oxidatieve stress / schade. In een experimentele in vitro omgeving is het ook essentieel om het percentage dode cellen te beoordelen dat wordt gegenereerd als gevolg van oxidatieve stress. In dit artikel zullen we de 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat (DCFDA) kleuring van UV-C blootgestelde muis primaire oculaire oppervlakte stamcellen en hun kwantificering op basis van de fluorescerende beelden van DCFDA vlekken. DCFDA kleuring komt direct overeen met ros generatie. We tonen ook de kwantificering van dode en levende cellen door gelijktijdige kleuring met respectievelijk propidiumjodide (PI) en Hoechst 3332 en het percentage DCFDA (ROS-positieve) en PI-positieve cellen.

DCFDA is een kleurloze kleurstof die een chemisch gereduceerde vorm van fluorescein gebruikt als een indicator voor het opsporen van ROS in cellen. Deze kleurstof wordt gevangen in cellen en is gemakkelijk geoxideerd tot fluorescerende dichloordihydrofluoresceine (DCF), die een groene fluorescentie uitzendt. Deze fluorescentie kan worden gedetecteerd met behulp van fluorescerende microscopie. De cellen kunnen als volgt worden gevisualiseerd en gecorreleerd met ROS-accumulatie: i) levende cellen zonder ROS zenden hoge bla...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Dit protocol toont de gelijktijdige detectie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), levende cellen en dode cellen in levende primaire culturen van muisoculaire oppervlaktecellen. 2',7'-Dichloorfluoresceindiacetaat, propidiumjodide en Hoechst-vlekken worden gebruikt om respectievelijk de ROS-, dode cellen en levende cellen te beoordelen, gevolgd door beeldvorming en analyse.

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Hallo allemaal, mijn naam is Dr. Bipasha Bose. Ik werk als universitair hoofddocent en verantwoordelijk voor het Stem Cells and Reerative Medicine Center, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, India. Nu gaan we laten zien hoe te detecteren voor de aanwezigheid voor ROS dat wil zeggen, reactieve zuurstof soorten "in de levende culturen van de muis oculaire oppervlakken die zijn blootgesteld aan verschillende doses van ultraviolet-C straling.Het voordeel van deze techniek is dat we hier tegelijkertijd kunnen detecteren op de aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten, levende en dode cellen, zonder dat we Vester cellen hoeven te hebben. Het principe van deze techniek ligt in wezen in de levende cel doorlaatbaarheid van de kleurstof DCFDA. DCFDA is een levende cel permeant kleurloze kleurstof, die tijdens oxidatieve stress wordt gehandeld door de intracellulaire oxidases en wordt omgezet in groene fluorescerende DCF.Vandaar dat de groene florescentie ons in staat stelt om de aanwezigheid van reactieve zuurstofsoorten in de levende cellen op te sporen. Aan de andere kant, propidium jodide is een uitsluitend dode cel permeant kleurstof die fluoresceren rood. Het is een rDNA dubbelstrengde intercalating kleurstof.Echter, de kleurstof Hoechst is permeant aan zowel de levende en dode cellen. Het is een blauwe kleur nucleaire vlek. Vandaar, dit is een zeer eenvoudige methode waarbij we kunnen detecteren voor de aanwezigheid van reactieve zuurstof soorten in lange termijn culturen in een tijd afhankelijke manier, samen met de beoordeling van dode cellen.Plaatpunt twee miljoen cellen per 35 millimeter kweekschotels. De cellen die we toepassen zijn de cellen van het muizenoculair oppervlak. Verwijder het maximale volume van de media uit elk van de celkweek gerechten.Laat ongeveer 500 microliters van celkweekmedia achter in nauw contact met de cellen. Minimale hoeveelheid media zal het drogen van de cellen voorkomen. Echter, het doel van minimale hoeveelheid media is om de maximale penetratie van UVC blootstelling mogelijk te maken.Neem de cellen onder een UV-bron, het kan ofwel een UV Crosslinker, of kan een andere ultraviolet-C bron. Stel de cellen bloot aan verschillende dosering UVC-straling, zoals een, 10, 100, 1, 000 en 10.000 joules per vierkante meter. Wanneer de cellen zijn blootgesteld aan ultraviolet-C straling, moeten de deksels in de open positie.Dit zal een maximale penetratie van de ultraviolet-C naar de cellen mogelijk maken en dus de optimale dosisrespons van de cellen op de ultraviolet-C-straling weergeven. Breng de cellen naar de laminaire luchtstroom kap en vul elk van de gerechten met twee milliliter van complete media. Deze volledige media bevat 20%foetale runderserum in DMEM, aangevuld met supplementen zoals 1%minimaal niet-essentiële aminozuren, en ook 1%antibioticum dat penicilline en streptomycine is.Daarna, na het aanvullen met maximaal volume, dat is twee milliliter van volledige media, terug te keren naar de incubator en incubeer voor een periode van drie uur om vroege effecten van ultraviolet-C straling te zien. Bereid de live cel kleuring media in de laatste 15 minuten van drie uur na UVC cel incubatie. Kleuring media wordt bereid in 10%FBS met DMEM voorverwarmd tot 37 graden.Voor het maken van 10 milliliter kleuring media, eerst vijf microliter dcfda toe te voegen uit een voorraad van 10 millimolar om een definitieve concentratie van vijf micromolar te verkrijgen. Meng goed door pipetting op en neer. Ten tweede, voeg vijf microliter Hoechst oplossing uit een voorraad van 10 milligram per mL om een uiteindelijke concentratie van vijf microgram per mL te verkrijgen.Nu goed mengen door pipetting op en neer. Voeg ten slotte 200 microliter propidiumjodide toe uit een bestand van één milligram per mL om een uiteindelijke concentratie van 20 microgram per mL te verkrijgen. Meng goed door pipetting op en neer.Nu is de kleuroplossing klaar voor gebruik. Na drie uur incubatie na blootstelling aan UVC, verwijder de platen uit de CO2-incubator. Aspirate uit de media van elk van de gerechten die zijn blootgesteld aan verschillende dosering van UVC, zoals een, 10, 100, 1, 000, en 10, 000 joules per vierkante meter.Voeg nu twee milliliter vers bereide live cel kleuring media aan elk van de gerechten voorzichtig vanaf de zijkanten van de gerechten. Breng de platen weer terug naar de CO2-incubator en broed gedurende 15 minuten in voor levende celvlekken. Na 15 minuten van incubatie in de levende cel kleuring media, verwijder de kleuring media van elk van de gerechten met cellen blootgesteld aan verschillende doses ultraviolet-C straling.Vul de cellen aan met twee milliliter volledige media. Nu zijn de cellen klaar om te bekijken. Plaats nu de controlecellen onder het heldere veld van de fluorescerende imager.De cellen zien er blijkbaar normaal, omdat ze controlecellen. Onder het blauwe veld kunnen we de fluorescerende totale cellen. Onder het groene veld toont de ROS generatie.Aangezien dit controlecellen zijn, is er geen ROS gegenereerd. Onder het rode veld zijn de propidium jodide gekleurde dode cellen zichtbaar. Houd vervolgens de UV blootgesteld 100 joules per meter vierkant onder het heldere veld.Onder het blauwe veld, en ook kunnen we het totale celnummer onder het blauwe veld zien. Echter, wanneer we blootstellen aan groen veld, DCFDA positieve cellen worden gezien, en ook PI positieve dode cellen worden gezien. Ten slotte, plaats de maximale UV-dosis, dat is 10.000 joules per meter vierkante blootgestelde cellen, onder het heldere veld.We kunnen abnormale celmorfologie zien. Echter, onder het blauwe veld kunnen we zien totale blauwe cellen. Onder het groene veld worden groene fluorescerende DCFDA-positieve cellen gezien die de ROS-generatie aangeven.Wanneer de cellen worden blootgesteld aan rood veld, alle cellen waren fluorescerende rood aangeeft een groot aantal celdood wanneer de cellen worden behandeld met 10.000 joules per meter vierkant van UV-dosering. Schik nu de beelden die in verschillende kanalen zijn vastgelegd in een enkel samengesteld beeldpaneel dat overeenkomt met de ultraviolette-C-doses en onbelichte besturingselementen. De afbeeldingen zijn gerangschikt in één paneel in groep.Ten eerste, het heldere veld. Ten tweede, de Hoechst blauwe nucleaire vlek. Ten derde, propidium jodide kleuring als voor dode kernen.Ten vierde, DCFDA voor ROS positieve cellen. En ten vijfde, het samengevoegde beeld. Als we kijken naar de eerste en de tweede rij beelden, dat is onbelichte controle en de cellen blootgesteld aan de UVC dosis een joule per meter vierkant, merkten we op dat er noch PI noch ROS positieve cellen die was verlicht, waardoor een volledige afwezigheid van ROS en celdood in onbelichte controles en zo'n lage UVC dosis van een joule per meter plein.Nu komt naar de derde rij van samengestelde beelden van de cellen die werden blootgesteld aan 100 joules per meter vierkant. Een zeer laag percentage cellen, ongeveer 10% waren positief voor zowel PI en DCFDA bij deze dosis, wat wijst op een lage hoeveelheid ROS-generatie en celdood. Nu gaan we over op een verdere hogere dosis UVC-blootstelling aan straling, dat is 1.000 joules per vierkante meter, zoals aangegeven in de vierde rij van het samengestelde beeld.Hier was ongeveer 70% van de cellen positief voor PI en DCFDA. Ten slotte gaan we over op de hoogste dosis UVC-belichting, dat is 10.000 joules per vierkante meter, zoals weergegeven in de vijfde rij van het samengestelde beeld. Hier waren vinden dat bijna 100% van de cellen positief waren voor zowel PI en DCFDA, wat wijst op een 100% cel dood en ROS generatie op deze specifieke UVC dosis.Breng de beelden over naar de beeldsoftware. Open eerst de blauwe afbeelding die de door Hoescht gekleurde kernen aangeeft, dat is het totale aantal cellen. Open het telgereedschap en klik op elk van de cellen een voor een om het nummer te hebben.Open nu het beeld dat is vastgelegd onder het rode kanaal met vermelding van de PI-positieve dode cellen. Open het telgereedschap en klik op elk van de rode vlekken die de telling voor de PI-positieve dode cellen aangeven. Zodra het tellen van de dode cellen voorbij is, klikt u op het groene kanaal gevangen cellen en open het telgereedschap en klik op elk van de groene vlekken met vermelding van de cellen met de ROS-generatie.Voltooi het tellen van de groene cellen die onder het groene kanaal zijn opgevangen en schrijf vervolgens het percentage celdood op door UVC-schade en percentage van de ROS-productie door UVC-schade. Dit wordt berekend met behulp van het eenvoudige formulenummer van PI-positieve cellen, dat wil zeggen de rode fluorescerende cellen, gedeeld door het aantal Positieve Hoechstcellen vermenigvuldigd met 100. Percentage ros-productie door UV-schade wordt berekend aan de hand van de formule, het aantal DCFDA-positieve of groene fluorescerende cellen, gedeeld door het aantal positieve Hoechst-cellen vermenigvuldigd met 100.Zodra u beide percentages hebt, dat is percentage van celdood en het percentage rosproductie, gebruikt u deze waarden om een staafgrafiek in kaart te brengen. X-as geeft de dosering van UV aan, terwijl y-as het percentage cellen aangeeft. De groene balken geven het percentage ROS-generatie aan, terwijl de rode balk het percentage celdood aangeeft.Na analyse, is het duidelijk dat bij UVC dosis 100 joules is er 10%ROS genererende cel evenals een 10%cel dood. Terwijl bij de UVC dosis 10 verhoogd tot drie joules per meter vierkant, 70%-cellen vertonen ROS generatie evenals celdood. Terwijl bij de hoogste dosis UVC, dat is 10 verhoogd tot vier joules per meter vierkant, ongeveer 100% cellen tentoongesteld celdood evenals ROS productie.Vandaar, kan worden geconcludeerd dat er een sterke positieve correlatie tussen de ROS generatie en celdood. Tot slot, deze techniek is erg handig voor gelijktijdige beoordeling van reactieve zuurstofsoorten, levende en dode cellen in levende, normale gebeurteniscultuur. Deze techniek is ook nuttig voor een beperkte beoordeling van reactieve zuurstofsoorten, levende en dode cellen, in langdurige culturen die zijn blootgesteld aan verschillende celbeschadigende stoffen zoals ultraviolette straling, of chemische agentia.En deze techniek kan ook een onderzoeker begeleiden voor het bepalen van de optimale tijd voor het oogsten van de cellen zoals bij 50%ROS, 75%ROS, enzovoort, want er kan veel downstream toepassingen zijn, zoals QR naar PCR en Western blotting.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor<em&gt; In Vitro</em&gt; Myelination Testen

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Groei van de Preantral follikels muis onder gesimuleerde microzwaartekracht

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computationele analyse van de Caenorhabditis elegans Germline te bestuderen van de distributie van kernen, eiwitten en het cytoskelet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monoculaire visuele ontbering en oculaire dominantie plasticiteit meting in de muis primaire visuele cortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...