Name: assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00
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Die Autoren würdigen die Unterstützung des Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Als Universität) für die Infrastruktureinrichtungen.

Das Experiment wurde an primären Augenzellen/Stammzellen durchgeführt, die vom Schweizer Albino-Mausauge abgeleitet wurden. Die Verwendung von Tieren zur Augenernte für dieses Experiment wurde vom Institutional Animal Ethical Committee, Yenepoya (Considered to be University) genehmigt (IEAC-Zulassungsnummer, 6a/19.10.2016).
1. Zubereitungen von Reagenzien
HINWEIS: Die Ableitung von Primärzellen/Stammzellen von der Augenoberfläche der Maus geht über den Rahmen di...

<ol>
	<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+the+challenge+to+enable+and+protect+vision:+the+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+oxidative+stress.">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).</li><li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+(ROS)+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling.">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li><li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults.">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).</li><li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited:+eye-sun+protection+factor+(E-SPF(R)),+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear.">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li><li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers:+A+major+health+problem.">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li><li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li><li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells:+A+possible+role+in+neurotoxicity.">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion.">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li></ol>

Die hier beschriebene DCFDA-Färbemethode ermöglicht die Visualisierung von ROS in primären augenförmigen, mit UV-C-Strahlung behandelten primären okulären Lebendenzellen der Maus. Ein Vorteil dieser Färbemethode ist, dass sie es den Forschern auch ermöglicht, die unmittelbaren Auswirkungen von UV-C (3 Stunden nach UVC-Exposition) auf die lebenden Zellen und deren gleichzeitige Aufzählung für den Prozentsatz von ROS-positiven sowie abgestorbenen Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus können die Zellen, da die F...

Die Augenoberfläche (OS) ist eine funktionelle Einheit, die hauptsächlich aus der äußeren Schicht und drüsensen Epithelie von Hornhaut, lachrymaler Drüse, meibomianischer Drüse, Bindehaut, einem Teil der Augenlidränder und Innervationen besteht, die Signale1transduce. Die transparente kuppelförmige Hornhautschicht lenkt das Licht auf die Netzhaut. Dieses avaskuläre Gewebe besteht aus zellulären Komponenten wie Epithelzellen, Keratozyten und Endothelzellen und azellulären Komponenten wie Kollagen und Glycosaminoglycans2. Das Gebiet wird von Tränen entwässert, die auch die meisten Nährstoffe liefern. Die anatomische Position des Betriebssystems zwingt es zu einem direkten Kontakt mit der äußeren Umgebung und setzt es oft verschiedenen harten Komponenten wie hellem Licht, Mikroben, Staubpartikeln und Chemikalien aus. Dieser Faktor prädisponiert das Betriebssystem für körperliche Verletzungen und macht es anfällig für verschiedene Krankheiten.
Oxidativer Stress wird durch das Ungleichgewicht zwischen der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und den endogenen antioxidativen Abwehrmechanismen3verursacht. ROS werden in reaktive Moleküle und freie Radikale eingeteilt, die beide aus molekularem Sauerstoff(O2) durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung4abgeleitet werden. Die erste Gruppe besteht aus nicht-radikalen Arten wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Singlet-Sauerstoff (1O2) und letztere umfasst Arten wie Superoxid-Anionen(O2-) und Hydroxylradikale (•OH), unter anderem. Diese Moleküle sind Nebenprodukte normaler zellulärer Prozesse und ihre Rolle wurden in wichtige physiologische Funktionen wie Signaltransduktion, Genexpression und Wirtsabwehr5involviert. Eine verbesserte Produktion von ROS ist bekannt, als Reaktion auf Faktoren wie Pathogeninvasion erzeugt werden, Xenobiotika, und Exposition gegenüber ultravioletten (UV) Strahlung4. Diese Überproduktion von ROS führt zu oxidativem Stress, der zur Schädigung von Molekülen wie Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden führt6.
Natürliches Sonnenlicht, die vorherrschende Quelle von UV-Strahlung, besteht aus UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) und UV-C (290–200 nm)7. Es wurde eine inverse Korrelation zwischen der Wellenlänge und den Spektralenergien berichtet. Obwohl natürliche UV-C-Strahlung von der Atmosphäre absorbiert wird, emittieren künstliche Quellen wie Quecksilberlampen und Schweißgeräte und stellen daher eine berufliche Gefahr dar. Symptome der Exposition gegenüber Augen sind Photokeratitis und Photokeratokonjunktivitis8. Die Produktion von ROS ist einer der wichtigsten Mechanismen, um UV-induzierten Zellschadenzuzufügen 9. In der aktuellen Studie zeigen wir den Nachweis von ROS mit der 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat (DCFDA)-Färbungsmethode in primären Augenoberflächenzellen/Stammzellen der Maus, die UV-C ausgesetzt sind. Die grüne Fluoreszenz wurde mittels fluoreszierender Mikroskopie erfasst. Die Zellen wurden mit zwei Farbstoffen, Hoechst 33342 und rotem Propidiumjodid, gegengefärbt, um die lebenden bzw. abgestorbenen Zellen zu färben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883</td>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>SA 003700112</td>
			<td>Sterile dishes for culturing the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AT007</td>
			<td>Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, EU Origin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM99955</td>
			<td>One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutMax</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Hybridization oven/UV cross linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used as a supplement to increase the cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gentle cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage

Die Augenoberfläche ist aufgrund verschiedener Umwelteinflüsse regelmäßig abnutzend. Die Exposition gegenüber UV-C-Strahlung stellt eine Gesundheitsgefährdung am Arbeitsplatz dar. Hier zeigen wir die Exposition von Primärstammzellen von der Maus-Augenoberfläche gegenüber UV-C-Strahlung. Die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist die Auslesung des Ausmaßes von oxidativem Stress/Schäden. In einer experimentellen In-vitro-Einstellung ist es auch wichtig, den Prozentsatz der toten Zellen zu bewerten, die durch oxidativen Stress erzeugt werden. In diesem Artikel zeigen wir die 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate (DCFDA) Färbung von UV-C-exponierten primären Augenoberflächenstammzellen der Maus und deren Quantifizierung auf der Grundlage der fluoreszierenden Bilder der DCFDA-Färbung. DCFDA Färbung entspricht direkt der ROS-Generation. Wir zeigen auch die Quantifizierung von toten und lebenden Zellen durch gleichzeitige Färbung mit Propidiumiodid (PI) bzw. Hoechst 3332 bzw. dem Prozentsatz der DCFDA (ROS-positiven) und PI-positiven Zellen.

DCFDA ist ein farbloser Farbstoff, der eine chemisch reduzierte Form von Fluorescein ist, die als Indikator für den Nachweis von ROS in Zellen verwendet wird. Dieser Farbstoff wird in Zellen eingeschlossen und leicht zu fluoreszierendem Dichlordihydrofluorescein (DCF) oxidiert, das eine grüne Fluoreszenz aussendet. Diese Fluoreszenz kann mit fluoreszierender Mikroskopie nachgewiesen werden. Die Zellen können visualisiert und mit der ROS-Akkumulation wie folgt korreliert werden: (i) lebende Zellen ohne ROS emittieren h...

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Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Dieses Protokoll demonstriert den gleichzeitigen Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), lebenden Zellen und abgestorbenen Zellen in lebenden Primärkulturen aus Maus-Augenoberflächenzellen. 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate, Propidiumiodid und Hoechst-Färbung werden verwendet, um die ROS,, abgestorbene Zellen und lebende Zellen zu bewerten, gefolgt von Bildgebung und Analyse.

Bewertung von oxidativen Schäden in den primären Maus-Augen-Oberflächenzellen/Stammzellen als Reaktion auf Uv-C-Schäden (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Hallo an alle, mein Name ist Dr.Bipasha Bose. Ich arbeite als außerordentlicher Professor und verantwortlich im Stem Cells and Regenerative Medicine Center, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, Indien. Jetzt werden wir zeigen, wie wir für das Vorhandensein von ROS, d. h. reaktiven Sauerstoffspezies, in den lebenden Kulturen von den Augenoberflächen der Maus, die verschiedenen Dosen ultravioletter C-Strahlung ausgesetzt wurden, erkennen können.Der Vorteil dieser Technik ist, dass wir hier gleichzeitig für das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies, lebenden und abgestorbenen Zellen erkennen können, ohne dass vester Zellen benötigt werden. Das Prinzip dieser Technik liegt im Wesentlichen in der Durchlässigkeit der lebenden Zelle dcFDA. DCFDA ist ein lebender Zellpermeant farbloser Farbstoff, der während des oxidativen Stresses von den intrazellulären Oxidasen betätigt und in grüne Fluoreszenz-DCF umgewandelt wird.Daher ermöglicht uns die grüne Blütenstand es uns, das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies in den lebenden Zellen zu erkennen. Andererseits ist Propidiumiodid ein ausschließlich toter Zellpermeant-Farbstoff, der rot fluoresziert. Es ist ein rDNA doppelsträngiger Interkalierender Farbstoff.Der Farbstoff Hoechst ist jedoch sowohl für die lebenden als auch für die abgestorbenen Zellen durchstoent. Es ist ein blauer Farbe kernier Fleck. Daher ist dies eine sehr einfache Methode, bei der wir das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies in Langzeitkulturen zeitabhängig zusammen mit der Bewertung abgestorbener Zellen erkennen können.Tellerpunkt zwei Millionen Zellen pro 35 Millimeter Kulturgerichte. Die Zellen, die wir anwenden, sind die Zellen von der Maus-Augenoberfläche. Entfernen Sie die maximale Volumen menge medien aus jedem der Zellkultur-Gerichte.Lassen Sie rund 500 Mikroliter Zellkulturmedien in engem Kontakt mit den Zellen zurück. Minimale Medienmenge verhindert das Trocknen der Zellen. Der Zweck einer minimalen Medienmenge besteht jedoch darin, die maximale Penetration der UVC-Exposition zu ermöglichen.Nehmen Sie die Zellen unter einer UV-Quelle, es kann entweder ein UV-Vernetzen, oder kann jede andere ULTRAviolett-C-Quelle sein. Setzen Sie die Zellen einer unterschiedlichen Dosierung von UVC-Strahlung aus, z. B. 10, 100, 1 000 und 10 000 Joule pro Quadratmeter. Wenn die Zellen ultravioletter C-Strahlung ausgesetzt sind, sollten sich die Deckel in der offenen Position befinden.Dies ermöglicht eine maximale Penetration des Ultraviolett-C in die Zellen und zeigt somit die optimale Dosis-Reaktion der Zellen auf die Ultraviolett-C-Strahlung. Bringen Sie die Zellen auf die laminare Luftstromhaube und füllen Sie jedes der Gerichte mit zwei Milliliter komplette Medien auf. Dieses komplette Medium enthält 20% fetales Rinderserum in DMEM, ergänzt mit Ergänzungen wie 1%Minimum nicht-essentielle Aminosäuren, und auch 1%Antibiotikum, das Penicillin und Streptomycin ist.Danach, nach dem Auffüllen mit maximalem Volumen, d. h. zwei Milliliter nbiss, geben Sie die Platten an den Inkubator zurück und inkubieren Sie für einen Zeitraum von drei Stunden, um die frühen Auswirkungen der Ultraviolett-C-Strahlung zu sehen. Bereiten Sie die Live-Zell-Färbungsmedien in den letzten 15 Minuten der dreistündigen 3-Stündigen nach der UVC-Zellinkubation vor. Färbemedien werden in 10%FBS hergestellt, die DMEM vorgewärmt auf 37 Grad enthalten.Für die Herstellung von 10 Milliliter Färbemedien, fügen Sie zuerst fünf Mikroliter DCFDA aus einem Bestand von 10 Millimolar, um eine endgültige Konzentration von fünf Mikromolar zu erhalten. Gut mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Zweitens, fügen Sie fünf Mikroliter Hoechst-Lösung aus einem Bestand von 10 Milligramm pro ml, um eine endgültige Konzentration von fünf Mikrogramm pro ml zu erhalten.Jetzt gut mischen, indem Sie nach oben und unten. Schließlich fügen Sie 200 Mikroliter Propidiumjodid aus einem Vorrat von einem Milligramm pro ml hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Mikrogramm pro ml zu erhalten. Gut mischen, indem Sie nach oben und unten pfeifen.Jetzt ist die Färbelösung einsatzbereit. Entfernen Sie nach drei Stunden Inkubation nach UVC-Exposition die Platten aus dem CO2-Inkubator. Aspirieren Sie die Medien von jedem der Gerichte, die verschiedenen Dosierungen von UVC ausgesetzt wurden, wie ein, 10, 100, 1 000, und 10 000 Joule pro Quadratmeter.Nun fügen Sie zwei Milliliter frisch zubereitete Live-Zell-Färbung Sendemittel zu jedem der Gerichte sanft von den Seiten des Geschirrs. Die Platten wieder in den CO2-Inkubator zurückgeben und 15 Minuten lang für die Färbung von Lebenden Zellen inkubieren. Nach 15 Minuten Inkubation in den LebendenZell-Färbemedien entfernen Sie die Färbemedien aus jedem der Gerichte, die Zellen enthalten, die unterschiedlichen Dosen von ULTRAviolett-C-Strahlung ausgesetzt sind.Füllen Sie die Zellen mit zwei Milliliter n. B. gesamtmediale Medien auf. Jetzt sind die Zellen bereit für die Anzeige. Platzieren Sie nun die Steuerzellen unter das helle Feld des fluoreszierenden Imagers.Die Zellen sehen scheinbar normal aus, da sie Kontrollzellen sind. Unter dem blauen Feld können wir die fluoreszierenden Gesamtzellen. Unter der grünen Wiese zeigt die ROS-Generation.Da es sich um Kontrollzellen handelt, wird kein ROS generiert. Unter dem roten Feld sind die propidium iodid entleichen Zellen sichtbar. Dann halten Sie die UV-belichtet 100 Joule pro Quadratmeter unter dem hellen Feld.Unter dem blauen Feld, und auch können wir die Gesamtzahl der Zellen unter dem blauen Feld sehen. Wenn wir jedoch der grünen Wiese aussetzen, werden DCFDA-positive Zellen gesehen, und auch PI-positive abgestorbene Zellen werden gesehen. Platzieren Sie schließlich die maximale UV-Dosis, d. h. 10.000 Joule pro Meter freigelegter Zellen pro Meter, unter das helle Feld.Wir können abnormale Zellmorphologie sehen. Unter dem blauen Feld können wir jedoch insgesamt blaue Zellen sehen. Unter dem grünen Feld werden grüne fluoreszierende DCFDA-positive Zellen gesehen, die auf die ROS-Generation hinweisen.Wenn die Zellen einem roten Feld ausgesetzt sind, fluoreszieren alle Zellen rot, was auf eine große Anzahl von Zellabsterben hindeutet, wenn die Zellen mit 10.000 Joule pro Quadratmeter UV-Dosierung behandelt werden. Ordnen Sie nun die in verschiedenen Kanälen aufgenommenen Bilder in einem einzigen zusammengesetzten Bildpanel an, das den Ultraviolett-C-Dosen und nicht exponierten Steuerelementen entspricht. Die Bilder sind in einem einzigen Panel in der Gruppe angeordnet.Erstens, das helle Feld. Zweitens, der Hoechst blaue Kernfleck. Drittens, Propidiumjodid Färbung wie für tote Kerne.Viertens, DCFDA für ROS-positive Zellen. Und fünftens, das verschmolzene Bild. Wenn wir uns die erste und die zweite Bildreihe ansehen, d.h. die unbelichtete Kontrolle und die Zellen, die der UVC-Dosis einen Joule pro Meter Quadrat ausgesetzt sind, stellten wir fest, dass es weder PI- noch ROS-positive Zellen gab, die aufgeleuchtet waren, was auf ein völliges Fehlen von ROS und Zelltod bei nicht exponierten Kontrollen und eine so niedrige UVC-Dosis von einem Joule pro Quadratmeter hindeutet.Nun kommen sie zur dritten Reihe von zusammengesetzten Bildern der Zellen, die 100 Joule pro Quadratmeter ausgesetzt waren. Ein sehr geringer Prozentsatz der Zellen, etwa 10%, waren sowohl für PI als auch für DCFDA in dieser Dosis positiv, was auf eine geringe Menge an ROS-Generierung und Zelltod hindeutet. Nun geht es zu einer weiter höheren Dosis UVC-Strahlung, d. h. 1.000 Joule pro Quadratmeter, wie in der vierten Reihe des zusammengesetzten Bildes angegeben.Hier waren etwa 70% der Zellen positiv für PI und DCFDA. Schließlich kommen wir zur höchsten Dosis UVC-Exposition, d. h. 10.000 Joule pro Quadratmeter, wie in der fünften Reihe des zusammengesetzten Bildes dargestellt. Hier wurden festgestellt, dass fast 100% der Zellen sowohl für PI als auch für DCFDA positiv waren, was auf einen 100%Zelltod und die ROS-Generierung bei dieser speziellen UVC-Dosis hindeutet.Übertragen Sie die Bilder an die Bildverarbeitungssoftware. Öffnen Sie zuerst das blaue Bild, das die Hoescht-gebeizten Kerne anzeigt, d. h. die Gesamtzahl der Zellen. Öffnen Sie das Zählwerkzeug, und klicken Sie auf jede Zelle nacheinander, um die Zahl zu erhalten.Öffnen Sie nun das Bild, das unter dem roten Kanal aufgenommen wurde und die PI-positiven toten Zellen anzeigt. Öffnen Sie das Zählwerkzeug, und klicken Sie auf jeden der roten Flecken, der die Anzahl der positiven abgestorbenen PI-Zellen angibt. Sobald die Zählung der abgestorbenen Zellen abgeschlossen ist, klicken Sie auf den grünen Kanal erfasste Zellen und öffnen Sie das Zählwerkzeug und klicken Sie auf jeden der grünen Flecken, die die Zellen anzeigen, die die ROS-Generation anzeigen.Schließen Sie die Zählung der grünen Zellen ab, die unter dem grünen Kanal erfasst wurden, und führen Sie dann die Formel auf, um den Prozentsatz des Zelltodes durch UVC-Schäden und den Prozentsatz der ROS-Produktion durch UVC-Schäden aufzuzählen. Dies wird mit der einfachen Formelzahl der PI-positiven Zellen berechnet, d.h. den roten Fluoreszenzzellen, geteilt durch die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen multipliziert mit 100. Der Prozentsatz der ROS-Produktion durch UV-Schäden wird anhand der Formel, Anzahl der DCFDA-positiven oder grünen Fluoreszenzzellen berechnet, dividiert durch die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen multipliziert mit 100.Sobald Sie sowohl die Prozentsätze, d. h. den Prozentsatz des Zelltodes, als auch den Prozentsatz der ROS-Produktion haben, verwenden Sie diese Werte, um ein Balkendiagramm darzustellen. X-Achse gibt die Dosierung von UV an, während y-Achse den Prozentsatz der Zellen angibt. Die grünen Balken geben den Prozentsatz der ROS-Generierung an, während der rote Balken den Prozentsatz des Zelltodes angibt.Bei der Analyse ist es offensichtlich, dass bei UVC-Dosis 100 Joule gibt es 10%ROS erzeugende Zelle sowie einen 10%Zelltod. Während bei der UVC-Dosis 10 auf drei Joule pro Quadratmeter angehoben wurde, zeigten 70%Zellen die ROS-Generation sowie den Zelltod. Während bei der höchsten Dosis von UVC, das ist 10 auf vier Joule pro Meter Quadrat erhöht, etwa 100%Zellen zeigten Zelltod sowie ROS-Produktion.Daher kann geschlossen werden, dass es eine starke positive Korrelation zwischen der ROS-Generation und dem Zelltod gibt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik sehr praktisch für die gleichzeitige Bewertung von reaktiven Sauerstoffspezies, lebenden und abgestorbenen Zellen in lebender, normaler Ereigniskultur ist. Diese Technik ist auch nützlich für die begrenzte Bewertung von reaktiven Sauerstoffspezies, lebenden und abgestorbenen Zellen, in Langzeitkulturen, die verschiedenen zellschädigenden Mitteln wie ultravioletter Strahlung oder chemischen Mitteln ausgesetzt waren.Und diese Technik kann auch einen Forscher bei der Bestimmung der optimalen Zeit für die Ernte der Zellen wie 50%ROS, 75%ROS, so und so weiter, wie es für viele nachgeschaltete Anwendungen, wie QR zu PCR und Western Blotting sein kann führen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Myelinisierung Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

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In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

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Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monokulare visuelle Deprivation und Ocular Dominance Plastizitätsmessung in der Maus primäre visuelle Kortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...