Name: assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכה ממרכז המחקר יאנפויה, יאנפוייה (באוניברסיטה) עבור מתקני התשתית הקונסטרוקטיבית.

הניסוי בוצע על התאים העינית העיקרי/תאי גזע נגזר עין העכבר השוויצרי לבקן. השימוש בבעלי חיים למסיק העיניים לניסוי זה אושר על ידי הוועדה המוסדית של בעלי החיים המוסדיים, Yenepoya (הנחשבת לאוניברסיטה) (מספר אישור IEAC, 6a/19.10.2016).
1. ההכנות של ריאגנטים
הערה: הנגזרת של תאים ראש...

<ol>
	<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+the+challenge+to+enable+and+protect+vision:+the+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+oxidative+stress.">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).</li><li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+(ROS)+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling.">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li><li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults.">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).</li><li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited:+eye-sun+protection+factor+(E-SPF(R)),+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear.">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li><li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers:+A+major+health+problem.">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li><li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li><li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells:+A+possible+role+in+neurotoxicity.">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion.">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li></ol>

The DCFDA הצביעת השיטה המתוארת כאן מאפשר ויזואליזציה של ROS בתוך העכבר הראשי העינית לחיות תאים מטופלים עם קרינת UV-C. היתרון של שיטה זו מכתים הוא גם מאפשר לחוקרים ללמוד את ההשפעות המיידיות של UV-C (3 שעות לאחר חשיפה UVC) על התאים החיים ואת הספירה הסימולטני שלהם עבור אחוז של ROS חיובי, כמו גם, תאים מתים. ית...

המשטח העינית (OS) היא יחידה תפקודית המורכבת בעיקר של השכבה החיצונית epithelia של קרנית, בלוטת la, בלוטת מייבואן, לחמית, חלק משולי מכסה העין ו innervations שינוי אותות1. שכבת הקרנית בצורת הכיפה השקופה מתמקדת באור על הרשתית. זו רקמה נמק העצם מורכב מרכיבים סלולריים כגון תאים אפיתל, keratocytes, ותאי האנדותל ורכיבים acellular כגון קולגן ו גליקוזנוגליקנים2. האזור מנוקז על ידי דמעות כי גם לספק את רוב החומרים המזינים. המיקום האנטומי של מערכת ההפעלה מאלץ אותו להיות במגע ישיר עם הסביבה החיצונית, לעתים קרובות חושף אותו לרכיבים קשים שונים כגון אור בוהק, חיידקים, חלקיקי אבק וכימיקלים. גורם זה מקדם את מערכת ההפעלה לפציעות פיזיות והופך אותו לנוטה למחלות שונות.
מתח חמצוני נגרמת בשל הdisequilibrium בין הייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) ואת נוגדי חמצון מנגנוני ההגנה האנדודוגני3. ROS מסווגים מולקולות תגובתי ורדיקלים חופשיים, שניהם נגזרים מחמצן מולקולרי (O2) באמצעות זרחון חמצוני מיטוכונדרילציה4. הקבוצה הקודמת מורכבת ממינים לא רדיקלים כגון מי חמצן (H2o2), סינגתן חמצן (1o2) והשני כולל מינים כגון סופראוקסיד אניונים (O2-), ו רדיקלים הידרוקסיל (•או), בין היתר. מולקולות אלה הן על ידי-מוצרים של תהליכים סלולריים נורמליים התפקידים שלהם היו מעורבים פונקציות פיזיולוגיות חשוב כגון התמרה אותות, ביטוי גנים, והגנה מארחים5. ייצור משופר של ROS ידוע להיווצר בתגובה לגורמים כגון הפלישה הפתוגן, xenobiotics, וחשיפה אולטרה סגול (UV) קרינה4. זה ייצור יתר של ROS תוצאות לחץ חמצוני שמוביל לנזק של מולקולות כגון חומצות גרעין, חלבונים, ושומנים6.
אור השמש הטבעי, המקור השולט ביותר של קרינת UV, מורכב UV-A (400 – 320 nm), UV-B (320 – 290 nm), ו-UV-C (290 – 200 ננומטר)7. דווח על קורלציה הפיכה בין אורך הגל לבין האנרגיות הספקטרליות. למרות קרינה UV-C טבעי נספג על ידי האטמוספירה, מקורות מלאכותיים כגון מנורות כספית ומכשירי ריתוך פולטים, ולכן, מהווים סיכון מקצועי. תסמינים של חשיפה לעיניים כוללים פוטוקרטיטיס ו פוטוקראטודלקת הלחמית8. הפקה של ROS הוא אחד המנגנונים העיקריים של גרימת נזק לתאי UV המושרה9. במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את הזיהוי של ROS באמצעות 2 ', 7 '-Diכלור דיהידרוטסטוסטרון diאצטט (DCFDA) הצביעת שיטה העכבר הראשי משטח עינית העין/תאי גזע חשופים UV-C. הזריחה הירוקה נתפסה. בעזרת מיקרוסקופ פלורסנט תאים היו מוכתם נגד שני צבעים, Hoechst 33342 ו אדום propidium יודיד, כדי להכתים את התאים חי ומת, בהתאמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883</td>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>SA 003700112</td>
			<td>Sterile dishes for culturing the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AT007</td>
			<td>Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, EU Origin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM99955</td>
			<td>One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutMax</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Hybridization oven/UV cross linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used as a supplement to increase the cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gentle cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage

משטח העינית נתון לבלאי רגיל ולקריעה בשל גורמים סביבתיים שונים. חשיפה לקרינת UV-C מהווה סיכון בריאותי תעסוקתי. כאן, אנו להדגים את החשיפה של תאי גזע ראשוני מן העכבר העינית משטח לקרינת UV-C. מינים חמצן תגובתי (ROS) היווצרות היא הבדיקה של היקף לחץ חמצוני/נזק. ב ניסיוני בקביעת חוץ גופית, זה חיוני גם כדי להעריך את אחוז התאים המתים שנוצרו עקב לחץ חמצוני. במאמר זה, אנו נדגים את 2 ', 7 '-Diלורוofluorescl (DCFDA) כתמים של UV-C חשוף העכבר הראשי משטח העינים הפנים בתאי גזע ואת הקוונפיקציה שלהם מבוסס על תמונות פלורסנט של DCFDA כתמים. DCFDA מכתים ישירות מתאים לדור ROS. אנו גם להדגים את הקוונפיקציה של תאים מתים וחיים על ידי מכתים בו זמנית עם propidium יודיד (PI) ו Hoechst 3332 בהתאמה ואת אחוז DCFDA (ROS חיוביים) ו PI חיובי תאים.

DCFDA הוא צבע חסר צבע כי הוא צורה כימית מופחתת של fluorescein המשמש כאינדיקטור לגילוי ROS בתאים. צבע זה מקבל לכוד בתוך תאים והוא תחמוצת בקלות כדי פלורסנט diכלור דיהידרוטסטוסטרון (DCF), אשר פולט זריחה ירוקה. ניתן לזהות את הקרינה הפלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. התאים יכולים להיות דמיינו ומתואם ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי הסימולטני של מינים חמצן תגובתי (ROS), תאים חיים, ותאים מתים בתרבויות הראשיות חי מפני העכבר משטח העינית תאים. 2 ', 7 '-diלורופלוט אצטט, propidium יודיד, וכתמים הופסט משמשים כדי להעריך את רוס, תאים מתים, ותאים חיים, בהתאמה, ואחריו הדמיה וניתוח.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

שלום לכולם, שמי ד"ר ביפאשה בוס. אני עובד כפרופסור חבר ומ אחראי במרכז לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית, מרכז המחקר Yenepoya, אוניברסיטת Yenepoya, מנגלור, הודו. עכשיו אנחנו הולכים להדגים כיצד לזהות את הנוכחות עבור ROS כלומר, מיני חמצן תגובתי"בתרבויות לחיות מן המשטחים העין העכבר שנחשפו מינונים שונים של קרינת אולטרה סגול-C.היתרון של טכניקה זו הוא שכאן אנו יכולים לזהות בו זמנית לנוכחות של מיני חמצן תגובתי, תאים חיים ומתים, ללא צורך בתאי Vester. העיקרון של טכניקה זו טמון למעשה חבירה התא החי של DCFDA צבע. DCFDA הוא צבע חי מחלחל חסר צבע, אשר במהלך סטרס חמצוני מקבל פעל על ידי אוקסידזות תאיים מקבל מומר DCF פלואורסצנטי ירוק.לפיכך, הצמחייה הירוקה מאפשרת לנו לזהות נוכחות של מיני חמצן תגובתי בתאים החיים. מצד שני, פרופידיום יודיד הוא צבע מחלחל תא מת אך ורק אשר פלואורסצנטי אדום. זה צבע משולב כפול תקוע rDNA.עם זאת, הצבע Hoechst הוא מחלחל הן לתאים חיים ומתים. זה כתם גרעיני בצבע כחול. לפיכך, זוהי שיטה פשוטה מאוד שבה אנו יכולים לזהות נוכחות של מיני חמצן תגובתי בתרבויות ארוכות טווח באופן תלוי זמן יחד עם הערכה של תאים מתים.נקודת צלחת שני מיליון תאים לכל 35 מילימטר מנות תרבות. התאים שאנו מיישמים הם התאים מפני השטח העין של העכבר. הסר נפח מרבי של מדיה מכל אחת ממנות תרבות התאים.השאירו מאחור כ-500 מיקרוליטרים של מדיית תאים במגע הדוק עם התאים. כמות מינימלית של מדיה תמנע ייבוש של התאים. עם זאת, המטרה של כמות מינימלית של מדיה היא לאפשר חדירה מקסימלית של חשיפה UVC.קח את התאים תחת מקור UV, זה יכול להיות גם Crosslinker UV, או יכול להיות כל מקור אולטרה סגול-C אחר. לחשוף את התאים למינון שונה של קרינת UVC כגון אחד, 10, 100, 1, 000, ו 10, 000 joules למ"ר. כאשר התאים נחשפו לקרינה אולטרה סגולה-C, המכסים צריכים להיות במצב פתוח.זה יאפשר חדירה מקסימלית של אולטרה סגול-C לתאים ולכן להראות את המינון האופטימלי-תגובה של התאים לקרינה אולטרה סגולה-C. הביאו את התאים למכסה המנוע של זרימת האוויר למינאר וחדשו כל אחת מהמנות עם שני מיליליטר של מדיה שלמה. מדיה שלמה זו מכילה 20% סרום שור עוברי ב- DMEM, בתוספת תוספי מזון כגון 1% מינימום חומצות אמינו לא חיוניות, וגם 1%אנטיביוטיקה כי הוא פניצילין סטרפטומיצין.לאחר מכן, לאחר חידוש המלאי בנפח מרבי, כלומר שני מיליליטר של מדיה מלאה, להחזיר את הצלחות לחממה ואת האינקובטה לתקופה של שלוש שעות על מנת לראות השפעות מוקדמות של קרינת אולטרה סגול-C. הכינו את מדיית הכתמת התא החי ב-15 הדקות האחרונות של דגירה של תאי UVC לאחר שלוש שעות. מדיה מכתימה מוכנה ב- 10%FBS המכיל DMEM מחומם מראש ל- 37 מעלות.להכנת 10 מיליליטר של מדיה מכתים, תחילה להוסיף חמישה microliter של DCFDA ממניה של 10 מילימולר כדי להשיג ריכוז סופי של חמישה micromolar. מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה. שנית, להוסיף חמישה microliter של פתרון Hoechst ממניה של 10 מיליגרם למיליליטר כדי לקבל ריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם לכל mL.עכשיו לערבב היטב על ידי צינור למעלה ולמטה. לבסוף להוסיף 200 microliters של פרופידיום יודיד ממניה של מיליגרם אחד לכל mL כדי לקבל ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם לכל mL. מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה.עכשיו פתרון הכתמים מוכן לשימוש. לאחר שלוש שעות של אינקובציה לאחר חשיפה UVC, להסיר את הצלחות מאינקובטור CO2. שאף את התקשורת מכל אחת מהמנות שנחשפו למינון שונה של UVC כגון אחת, 10, 100, 1, 000 ו- 10, 000 joules למ"ר.עכשיו מוסיפים שני מיליליטר של מדיה מוכתמת תאים חיים טריים לכל אחת מהמנות בעדינות מצדי הכלים. מחזירים את הצלחות שוב לאנקובטור CO2 וגוררים במשך 15 דקות להכתמת תאים חיים. לאחר 15 דקות של דגירה במדיה להכתמת תאים חיים, הסר את מדיית הכתמים מכל אחת מהמנות המכילות תאים החשופים למנות שונות של קרינת אולטרה סגול-C.לחדש את התאים עם שני מיליליטר של מדיה מלאה. כעת התאים מוכנים להצגה. עכשיו למקם את תאי הבקרה תחת השדה הבהיר של התמונה הפלואורסצנטי.התאים נראים נורמליים ככל הנראה מכיוון שהם תאי בקרה. תחת השדה הכחול אנחנו יכולים פלואורסצנטי תאים הכולל. תחת השדה הירוק מציג את הדור ROS.מאחר ש מדובר בתאי בקרה, לא נוצר ROS. מתחת לשדה האדום, תאים מתים מוכתמים פרופידיום יודיד גלויים. לאחר מכן לשמור על UV חשוף 100 joules למטר מרובע מתחת לשדה בהיר.מתחת לשדה הכחול, וגם אנו יכולים לראות את מספר התא הכולל מתחת לשדה הכחול. עם זאת, כאשר אנו חושפים לשדה ירוק, תאים חיוביים DCFDA נראים, וגם תאים מתים חיוביים PI נראים. לבסוף, מניחים את המינון המרבי UV, כלומר 10, 000 joules למטר תאים חשופים מרובע, תחת השדה הבהיר.אנחנו יכולים לראות מורפולוגיה של תאים לא תקינים. עם זאת, תחת השדה הכחול אנו יכולים לראות תאים כחולים מוחלטים. תחת השדה הירוק, תאים חיוביים DCFDA פלואורסצנטי ירוק נראים המציין את הדור ROS.כאשר התאים נחשפים לשדה אדום, כל התאים היו פלואורסצנטי אדום המציין מספר רב של מוות תאי כאשר התאים מטופלים עם 10, 000 joules למטר מרובע של מינון UV. עכשיו לסדר את התמונות שנתפסו בערוצים שונים לתוך לוח תמונה מורכבת אחת המתאימה מינונים אולטרה סגול-C ופקדים שלא נתלו. התמונות מסודרות בחלונית אחת בקבוצה.ראשית, השדה הבהיר. שנית, הכתם הגרעיני הכחול של הויכסט. שלישית, כתמי פרופידיום יודיד באשר לגרעין מת.רביעית, DCFDA לתאים חיוביים ROS. וחמישית, התמונה הממוזגת. כאשר אנו מסתכלים על השורה הראשונה והשניה של תמונות, כי הוא שליטה שלא נחשפה ואת התאים שנחשפו למינון UVC אחד joule למטר מרובע, הבחנו כי לא היו תאים חיוביים PI ולא ROS כי האיר, ובכך מצביע על היעדר מוחלט של ROS ומוות התא בפקדים שלא נחשפו כזה מינון UVC נמוך של ג'ול אחד למטר מרובע.עכשיו מגיע לשורה השלישית של תמונות מורכבות של התאים שנחשפו 100 joules למטר מרובע. אחוז נמוך מאוד של תאים, כ -10% היו חיוביים הן עבור PI והן DCFDA במינון זה, ובכך מצביע על כמות נמוכה של ייצור ROS ומוות תאים. עכשיו אנחנו עוברים למינון גבוה יותר של חשיפה לקרינה UVC, כלומר 1, 000 joules למ"ר כפי שצוין בשורה הרביעית של התמונה המשולבת.כאן, כ -70% מהתאים היו חיוביים עבור PI ו- DCFDA. לבסוף, אנו עוברים למינון הגבוה ביותר של חשיפה UVC, כלומר 10, 000 joules למ"ר כפי שמוצג בשורה החמישית של התמונה המשולבת. כאן נמצאו כי כמעט 100% מהתאים היו חיוביים הן עבור PI והן עבור DCFDA, ובכך הצביעו על מוות של 100% תאים ודור ROS במינון UVC מסוים זה.העבר את התמונות לתוכנת ההדמיה. פתח תחילה את התמונה הכחולה המציינת את הגרעינים המוכתמים של הושט, זהו המספר הכולל של תאים. פתח את כלי הספירה ולחץ על כל אחד מהתאים בזה אחר זה כדי לקבל את המספר.כעת פתח את התמונה שנלכדה מתחת לתעלה האדומה המציינת את התאים המתים החיוביים של PI. פתח את כלי הספירה ולחץ על כל אחת מהנקודות האדומות המציינות את הספירה עבור התאים המתים החיוביים של PI. לאחר ספירת התאים המתים נגמר, לחץ על הערוץ הירוק שנתפסו תאים ולפתוח את כלי הספירה ולחץ על כל אחד מהנקודות הירוקות המציין את התאים המציגים את הדור ROS.השלם את ספירת התאים הירוקים שנלכדו תחת הערוץ הירוק ולאחר מכן באמצעות הנוסחה לספור את אחוז המוות של תאים על ידי נזק UVC ואחוז ייצור ROS על ידי נזק UVC. זה מחושב באמצעות מספר הנוסחה הפשוטה של תאים חיוביים PI, כלומר תאים פלואורסצנטיים אדומים, מחולק במספר התאים החיוביים Hoechst כפול 100. אחוז ייצור ROS על ידי נזק UV מחושב באמצעות הנוסחה, מספר DCFDA חיובי, או תאים פלואורסצנטיים ירוקים, מחולק במספר התאים החיוביים Hoechst כפול 100.ברגע שיש לך את שני האחוזים, כלומר אחוז מוות של תאים ואת אחוז ייצור ROS, להשתמש בערכים אלה כדי להתוות גרף עמודות. ציר X מציין את המינון של UV, ואילו ציר y מציין את אחוז התאים. הסורגים הירוקים מציינים את אחוז יצירת ROS, בעוד שהסורג האדום מציין את אחוז המוות של תאים.לאחר ניתוח, ברור כי במינון UVC 100 joules יש 10%ROS יצירת תאים, כמו גם 10% מוות תאי. בעוד במינון UVC 10 העלה לשלוש joules למטר מרובע, 70% תאים הציגו ייצור ROS, כמו גם מוות של תאים. בעוד במינון הגבוה ביותר של UVC, כלומר 10 הרים לארבעה joules למ"ר, כ 100% תאים הציגו מוות של תאים, כמו גם ייצור ROS.לפיכך, ניתן להסיק כי יש מתאם חיובי חזק בין הדור ROS ומוות התא. לסיכום, טכניקה זו שימושית מאוד להערכה בו זמנית של מיני חמצן תגובתי, תאים חיים ומתים בתרבות אירועים חיה ונורמלית. טכניקה זו שימושית גם להערכה מוגבלת של מיני חמצן תגובתי, תאים חיים ומתים, בתרבויות ארוכות טווח אשר נחשפו סוכני נזק לתאים שונים כגון קרינה אולטרה סגולה, או חומרים כימיים.טכניקה זו יכולה גם להנחות חוקר לקביעת הזמן האופטימלי לקצירת התאים כגון ב 50%ROS, 75%ROS, כך וכן הלאה כפי שיכול להיות עבור יישומים רבים במורד הזרם, כגון QR כדי PCR ו כתמים מערביים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

מניעת ויזואלי מונוטוני ושליטה העין הפלסטיות מדידה העכבר קליפת הראיה העיקרית

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...