Name: assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00
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저자는 예네포야 연구 센터, 예네포야 (대학으로 간주)의 지원을 인정 인프라 시설에 대한.

실험은 스위스 알비노 마우스 눈에서 유래한 1차 안구 세포/줄기 세포에서 수행되었다. 이 실험을 위해 눈을 채취하기 위한 동물의 사용은 기관 동물 윤리위원회, 예네포야(대학로 간주됨)(IEAC 승인 번호, 6a/19.10.2016)에 의해 승인되었다.
1. 시약의 준비
참고 : 마우스 안구 표면에서 1 차 세포 / 줄기 세포의 유도는이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 그러므로, ...

<ol>
	<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+the+challenge+to+enable+and+protect+vision:+the+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+oxidative+stress.">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).</li><li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+(ROS)+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling.">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li><li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults.">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).</li><li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited:+eye-sun+protection+factor+(E-SPF(R)),+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear.">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li><li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers:+A+major+health+problem.">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li><li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li><li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells:+A+possible+role+in+neurotoxicity.">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion.">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li></ol>

여기에 기술된 DCFDA 염색 방법은 UV-C 방사선으로 처리된 마우스 1차 안구 라이브 세포에서 ROS의 시각화를 가능하게 한다. 이 염색 방법의 장점은 연구원이 살아있는 세포에 대한 UV-C (3 시간 UVC 노출 후)의 즉각적인 효과와 ROS 양성의 비율에 대한 동시 열거, 죽은 세포의 동시 열거를 연구 할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 염색 방법이 살아있는 세포에 사용됨에 따라, 세포는 UV-C 방사선의 지연된 효과...

안구 표면(OS)은 주로 각막, 래크리말 선, 마이보미안 선, 결막, 눈뚜껑 의 일부 및 신호를 변환하는 안구 의 일부의 외층 및 선 상피로 구성된 기능적 단위이다1. 투명 한 돔 모양의 각막 층망막에 빛을 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 혈관 조직은 상피 세포, 각질 세포, 내피 세포 및 콜라겐 및 글리코사미노글리칸과 같은 세포 성분으로 구성된다2. 이 지역은 또한 대부분의 영양소를 공급하는 눈물로 배수됩니다. OS의 해부학 적 위치는 종종 밝은 빛, 미생물, 먼지 입자 및 화학 물질과 같은 다양한 가혹한 구성 요소에 노출, 외부 환경과 직접 접촉하도록 강요한다. 이 요인은 물리적 인 부상에 OS를 걸리기 쉽게하고 다양한 질병에 경향이있습니다.
산화 스트레스는 반응성 산소 종(ROS)의 생산과 내인성 항산화 방어 메커니즘 사이의 불균형으로 인해 발생한다3. ROS는 반응성 분자 및 자유 라디칼로 분류되며, 둘 다 미토콘드리아 산화 인산화를 통해 분자 산소(O2)에서유래된다4. 상기 전군은 과산화수소(H2O2), 일중항산소(1O2)와같은 비라디칼 종으로 구성되며, 후자는 수퍼옥사이드 음이온(O2-) 및 하이드록실 라디칼(• OH)과 같은 종을 포함한다. 이들 분자는 정상적인 세포 과정의 부산물이며, 이들의 역할은 신호 전이, 유전자 발현 및 숙주 방어5와같은 중요한 생리기능에 연루되어 왔다. ROS의 향상된 생산은 병원균 침습, 제노바이오틱스, 및 자외선(UV) 방사선에 의한 노출과 같은 인자에 반응하여 생성되는 것으로 알려져있다 4. ROS의 이 과잉 생산은 핵산, 단백질 및 지질과 같은 분자의 손상으로 이끌어 내는 산화 응력 에서 유래6.
UV 방사선의 가장 지배적 인 소스 인 자연 태양광은 UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm), UV-C (290-200 nm)7로구성됩니다. 파장과 스펙트럼 에너지 사이의 역 상관 관계가 보고되었습니다. 천연 UV-C 방사선은 대기에 흡수되지만 수은 램프 및 용접 기구와 같은 인공 공급원이 방출되므로 직업적 위험이 있습니다. 눈에 노출의 증상은 광각막염과 광각막결막염 을 포함8. ROS의 생산은 UV 유도 된 세포 손상을 유발하는 주요 메커니즘 중 하나입니다9. 현재 연구에서는 UV-C에 노출된 마우스 1차 안구 표면 세포/줄기 세포에서 2',7'-디클로로디로디하이드로플루오레스세인 디아세이테인 디아세이테(DCFDA) 염색 방법을 사용하여 ROS검출을 입증합니다. 녹색 형광은 형광 현미경 검사법을 사용하여 포착되었습니다. 세포는 2개의 염료, Hoechst 33342 및 적색 프로피듐 요오드화물로 카운터-염색하였고, 살아있는 세포와 죽은 세포를 각각 염색하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883</td>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>SA 003700112</td>
			<td>Sterile dishes for culturing the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AT007</td>
			<td>Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, EU Origin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM99955</td>
			<td>One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutMax</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Hybridization oven/UV cross linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used as a supplement to increase the cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gentle cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage

안구 표면은 다양한 환경 적 요인으로 인해 정기적으로 마모됩니다. UV-C 방사선에 노출은 직업 건강 위험을 구성합니다. 여기에서, 우리는 UV-C 방사선에 마우스 안구 표면에서 1 차적인 줄기 세포의 노출을 보여줍니다. 반응성 산소 종 (ROS) 형성은 산화 스트레스 / 손상의 정도의 판독이다. 시험관 내 실험 환경에서는 산화 스트레스로 인해 생성된 죽은 세포의 백분율을 평가하는 것도 필수적입니다. 이 기사에서는 UV-C 노출 된 마우스의 2',7'-Dichlorofluescececetate (DCFDA) 염색을 시연할 것이며 DCFDA 염색의 형광 이미지에 기초한 1 차적인 안구 표면 줄기 세포 및 정량화를 시연할 것입니다. DCFDA 염색은 ROS 생성에 직접적으로 해당합니다. 우리는 또한 각각 프로피듐 요오드화물 (PI) 및 Hoechst 3332와 DCFDA (ROS 양성) 및 PI 양성 세포의 백분율로 동시에 염색함으로써 죽은 세포와 살아있는 세포의 정량화를 입증합니다.

DCFDA는 세포에서 ROS를 검출하기 위한 지표로 사용되는 형광의 화학적으로 감소된 형태인 무색 염료이다. 이 염료는 세포 내부에 갇히게되고 녹색 형광을 방출하는 형광 디클로로디하이드로 플루오레스신 (DCF)으로 쉽게 산화됩니다. 이 형광은 형광 현미경 검사법을 사용하여 검출될 수 있습니다. 세포는 다음과 같이 ROS 축적과 가시화 및 상관될 수 있다: (i) ROS가 없는 살아있는 세포는 높은 청색 형...

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Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

이 프로토콜은 마우스 안구 표면 세포로부터살아있는 1차 배양에서 반응성 산소 종(ROS), 살아있는 세포 및 죽은 세포의 동시 검출을 입증한다. 2',-7'-디클로로플루오레세테이트, 프로피듐 요오드화물 및 Hoechst 염색은 ROS, 죽은 세포 및 살아있는 세포를 각각 평가하기 위해 사용되며, 이미징 및 분석이 뒤따릅니다.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

안녕하세요, 내 이름은 박사 비파샤 보스입니다. 저는 부교수로 일하고 있으며 줄기 세포 및 재생 의학 센터, 예네포야 연구 센터, 예네포야 대학, 인도 만갈로어에서 담당하고 있습니다. 이제 우리는 자외선-C 방사선의 각종 복용량에 드러진 마우스 안구 표면에서 살아있는 배양에서"즉 반응성 산소 종인 ROS의 존재를 검출하는 방법을 시연할 것입니다.이 기술의 장점은 여기서 우리는 동시에 베스터 세포를 가질 필요없이 반응성 산소 종, 살아있는 죽은 세포의 존재를 감지 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 원리는 본질적으로 염료 DCFDA의 살아있는 세포 투과성에 있습니다. DCFDA는 살아있는 세포 무색 염료로, 산화 스트레스 가 세포 내 산화에 의해 행동되고 녹색 형광 DCF로 변환됩니다.따라서, 녹색 꽃은 우리가 살아있는 세포에 반응성 산소 종의 존재를 검출할 수 있게 합니다. 한편, 프로피듐 요오드제는 홍조를 적색으로 하는 만사세포 침전염염이다. 그것은 rDNA 이중 좌초 연염염입니다.그러나, 염료 Hoechst는 살아있는 세포와 죽은 세포 둘 다에 periss입니다. 푸른 색 핵 얼룩입니다. 따라서, 이것은 우리가 죽은 세포의 평가와 함께 시간 종속 방식으로 장기 배양에 반응성 산소 종의 존재를 검출 할 수있는 매우 간단한 방법입니다.플레이트 포인트 35 밀리미터 배양 접시 당 2 백만 셀. 우리가 적용하는 세포는 마우스 안구 표면에서 세포입니다. 각 세포 배양 접시에서 최대 양의 미디어를 제거합니다.세포 배양 매체의 약 500 마이크로리터를 세포와 밀접한 접촉으로 남겨 둡니다. 최소한의 양의 매체는 세포의 건조를 방지할 수 있습니다. 그러나 최소한의 양의 미디어의 목적은 UVC 노출의 최대 침투를 허용하는 것입니다.UV 소스에서 세포를 가지고, 그것은 UV 크로스 링커 일 수있다, 또는 다른 자외선-C 소스 가 될 수 있습니다. 1, 10, 100, 1, 000 및 10, 000 줄과 같은 UVC 방사선의 상이한 복용량에 세포를 노출하는 것은 미터 평방 당 10, 000 줄. 세포가 자외선-C 방사선에 노출되면 뚜껑은 열린 위치에 있어야합니다.이것은 세포에 자외선-C의 최대 침투를 허용하고 그러므로 자외선-C 방사선에 세포의 최적 복용량 반응을 보여줄 것입니다. 세포를 라미나르 공기 흐름 후드에 가져와 서 전체 미디어의 2 밀리리터와 각 접시를 보충. 이 완전한 매체는 DMEM에 있는 20% 태아 소 혈청을 포함합니다, 1%최소 비 필수 아미노산과 같은 보충교재로 보충되고, 또한 페니실린과 연쇄상 구균인 1%항생제.그 후, 최대 부피로 보충 한 후, 즉 완전한 매체의 두 밀리리터, 자외선-C 방사선의 초기 효과를 보기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에 플레이트를 반환하고 인큐베이터. UVC 세포 인큐베이션 후 3시간 후 의 마지막 15분 동안 라이브 셀 염색 매체를 준비한다. 스테인닝 미디어는 37도까지 미리 따뜻하게 DMEM을 포함하는 10 % FBS로 준비됩니다.염색 매체의 10 밀리리터를 만들기 위해, 먼저 5 마이크로 몰러의 최종 농도를 얻기 위해 10 밀리머의 주식에서 DCFDA의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 둘째, mL당 10밀리그램의 스톡에서 Hoechst 용액 5마이크로리터를 추가하여 mL당 5마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.이제 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 마지막으로 mL 당 1 밀리그램의 주식에서 프로피듐 요오드의 200 마이크로 리터를 추가하여 mL 당 20 마이크로 그램의 최종 농도를 얻습니다. 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요.이제 염색 솔루션을 사용할 준비가 되었습니다. UVC 노출 후 3시간 동안 잠복후 CO2 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 1, 10, 100, 1, 000 및 10, 000 평방 미터 당 10, 000 줄과 같은 UVC의 다양한 복용량에 노출 된 각 요리에서 미디어를 흡인.이제 갓 준비된 라이브 셀 스테닝 미디어를 접시 의 측면에서 부드럽게 두 밀리리터를 추가합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 다시 반환하고 라이브 셀 염색을 위해 15 분 동안 배양하십시오. 살아있는 세포 염색 매체에서 15분 동안 배양한 후, 자외선-C 방사선의 상이한 복용량에 노출된 세포를 포함하는 각 접시에서 염색 매체를 제거한다.완전한 매체의 2 밀리리터로 세포를 보충하십시오. 이제 셀이 볼 준비가 되었습니다. 이제 형광 이미저의 밝은 필드 아래에 제어 세포를 배치합니다.세포는 통제 세포이기 때문에 명백하게 정상보입니다. 파란 들판 아래에서 우리는 형광 총 세포를 할 수 있습니다. 녹색 필드 아래에는 ROS 생성이 표시됩니다.이들은 제어 세포이기 때문에, 생성된 ROS가 없습니다. 적색 필드 아래에서, 프로피듐 요오드 염색 죽은 세포가 볼 수 있습니다. 그런 다음 밝은 필드 아래에 미터 평방 미터 당 100 줄에 노출 된 UV를 유지합니다.파란색 필드 아래에서, 또한 우리는 파란색 필드 아래총 셀 번호를 볼 수 있습니다. 그러나, 우리가 녹지에 노출될 때, DCFDA 양성 세포가 보입니다, 또한 PI 양성 사구는 보입니다. 마지막으로, 최대 UV 용량을 배치, 즉 10, 000 미터 평방 노출 세포 당 줄, 밝은 필드 아래에.우리는 비정상적인 세포 형태를 볼 수 있습니다. 그러나, 푸른 필드 에서 우리는 총 파란색 세포를 볼 수 있습니다. 녹색 필드 에서, 녹색 형광 DCFDA 양성 세포는 ROS 생성을 나타내는 볼 수 있습니다.세포가 적색장에 노출될 때, 모든 세포는 세포가 UV 투여량의 미터 당 10, 000 줄로 취급될 때 많은 수의 세포사를 나타내는 적색을 형광하였다. 이제 다양한 채널에서 캡처한 이미지를 자외선-C 용량 및 노출되지 않은 컨트롤에 대응하는 단일 복합 이미지 패널로 정렬합니다. 이미지는 그룹의 단일 패널로 정렬됩니다.첫째, 밝은 필드. 둘째, 호흐스트 블루 핵 얼룩. 셋째, 죽은 핵에 관해서는 요오드 염색을 프로디듐 요오드데.넷째, ROS 양성 세포를 위한 DCFDA. 그리고 다섯 째, 병합된 이미지입니다. 우리가 이미지의 첫 번째와 두 번째 행을 볼 때, 즉 노출되지 않은 제어 및 미터 평방 당 하나의 줄에 노출 되지 않은 세포, 우리는 PI 도 ROS 양성 세포가 조명 했다 관찰, 따라서 노출 되지 않은 컨트롤에 ROS와 세포 죽음의 완전 한 부재와 하나의 joule 평방 미터 당 의 이러한 낮은 UVC 복용량을 나타내는 것을 관찰.이제 미터 평방 미터 당 100 줄에 노출 된 세포의 합성 이미지의 세 번째 행에 오고. 세포의 매우 낮은 비율, 약 10%는 이 복용량에서 PI와 DCFDA 둘 다에 대해 긍정적이었다, 따라서 ROS 생성 및 세포 죽음의 낮은 양을 나타내는. 이제 우리는 복합 이미지의 네 번째 행에 표시된 바와 같이 미터 평방 미터 당 1, 000 줄인 UVC 방사선 노출의 더 높은 용량으로 이동합니다.여기서, 세포의 대략 70%는 PI와 DCFDA를 위해 양수이었습니다. 마지막으로, 우리는 복합 이미지의 다섯 번째 행에 표시된 바와 같이 미터 평방 미터 당 10, 000 줄입니다 UVC 노출의 가장 높은 복용량으로 이동합니다. 여기에 세포의 거의 100 %가 PI와 DCFDA 모두에 대해 양성이었다는 것을 발견, 따라서 이 특정 UVC 용량에서 100 %의 세포 죽음과 ROS 생성을 나타내는.이미지를 이미징 소프트웨어로 전송합니다. 먼저 Hoescht 염색 핵을 나타내는 파란색 이미지를 엽니 다, 즉 세포의 총 수입니다. 카운트 도구를 열고 숫자를 갖기 위해 각 셀을 한 번에 하나씩 클릭합니다.이제 PI 양성 죽은 세포를 나타내는 빨간색 채널 아래에 캡처 된 이미지를 엽니 다. 카운팅 도구를 열고 PI 양수 죽은 세포의 수를 나타내는 각 빨간색 반점을 클릭합니다. 죽은 세포의 계산이 끝나면, 녹색 채널 캡처 된 세포를 클릭하고 계수 도구를 열고 ROS 생성을 나타내는 세포를 나타내는 녹색 반점의 각을 클릭합니다.녹색 채널에서 캡처된 녹색 셀의 계수를 완료한 다음, 포뮬러를 사용하여 UVC 손상 및 UVC 손상에 의한 ROS 생산의 백분율에 의한 세포 사멸의 비율을 확대합니다. 이는 PI 양성 세포의 간단한 수식 수를 사용하여 계산되며, 즉 적색 형광 세포이며, Hoechst 양성 세포의 수로 나누어 100을 곱한다. UV 손상에 의한 ROS 생산의 백분율은 100을 곱한 Hoechst 양성 세포의 수로 나눈 수식, DCFDA 양성 또는 녹색 형광 세포의 수를 사용하여 계산됩니다.셀 사망 비율과 ROS 생산 비율의 백분율인 백분율이 모두 있으면 이러한 값을 사용하여 막대 그래프를 플롯합니다. X축은 UV의 투여량을 나타내는 반면 y축은 세포의 백분율을 나타냅니다. 녹색 막대는 ROS 생성 의 백분율을 나타내고 빨간색 막대는 세포 사망 비율을 나타냅니다.분석 시, UVC 용량 100 줄에는 10%의 ROS 생성 세포와 10%의 세포 사망이 있음이 분명합니다. UVC 투여량 10에서 미터 정사각형 당 3개의 줄로 상승하는 반면, 70%의 세포는 세포 사멸뿐만 아니라 ROS 생성을 나타냈다. UVC의 가장 높은 복용량에 있는 동안, 그 10 미터 평방 미터 당 4 줄로 제기, 약 100% 세포는 세포 죽음 뿐만 아니라 ROS 생산을 전시.따라서, ROS 생성과 세포 사멸 사이에 강한 긍정적 인 상관 관계가 있다는 결론을 내릴 수 있습니다. 결론적으로, 이 기술은 살아있는, 일반적인 사건 문화에서 반응성 산소 종, 살아있는 및 죽은 세포의 동시 평가를 위해 아주 편리합니다. 이 기술은 또한 반응성 산소 종, 살아있는 및 죽은 세포, 자외선, 또는 화학 에이전트와 같은 각종 세포 손상 제에 노출된 장기 배양에서 제한된 평가에 유용합니다.그리고 이 기술은 또한 PCR 및 서양 블로팅에 QR과 같은 많은 다운스트림 응용 에 대한 수 로 등등 50 %ROS, 75 %ROS, 등등에서 세포를 수확하기위한 최적의 시간을 결정하기위한 연구원을 안내 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

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생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한<em&gt; 체외</em&gt; 수초 분석

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연구

발생학

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

마우스 1 차 적인 시각 피 질에 있는 단안 시각 박탈 및 안구 우세 가소성 측정

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...