Name: assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner støtte fra Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Anses å være Universitet) for de infrastrukturelle anleggene.

Eksperimentet ble utført på primære okulære celler / stamceller avledet fra det sveitsiske albino museøyet. Bruken av dyr for høsting av øynene for dette eksperimentet ble godkjent av Institutional Animal Ethical Committee, Yenepoya (Anses å være Universitet) (IEAC godkjenningsnummer, 6a/19.10.2016).
1. Preparater av reagenser
MERK: Avledning av primærceller/stamceller fra musens okulære overflate er utenfor omfanget av denne protokollen. Derfor demonstrere...

<ol>
	<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+the+challenge+to+enable+and+protect+vision:+the+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+oxidative+stress.">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).</li><li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+(ROS)+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling.">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li><li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults.">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).</li><li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited:+eye-sun+protection+factor+(E-SPF(R)),+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear.">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li><li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers:+A+major+health+problem.">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li><li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li><li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells:+A+possible+role+in+neurotoxicity.">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion.">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li></ol>

DCFDA farging metoden beskrevet her muliggjør visualisering av ROS i musen primære okulære levende celler behandlet med UV-C stråling. En fordel med denne fargemetoden er at det også gjør det mulig for forskerne å studere de umiddelbare effektene av UV-C (3 timer etter UVC-eksponering) på levende celler og deres samtidige opplisting for prosentandelen av ROS-positive, så vel som døde celler. Videre, som farging metoden brukes på levende celler, cellene kan bli ytterligere inkubert i samme media i lengre tid (f...

Okulær overflate (OS) er en funksjonell enhet hovedsakelig består av det ytre laget og kjertelepitelen av hornhinnen, lachrymal kjertel, meibomian kjertel, conjunctiva, en del av øyelokkmarginer og innerveringer som transduce signaler1. Det gjennomsiktige kuppelformede hornhinnen legger fokus på netthinnen. Dette avaskulære vevet består av cellulære komponenter som epitelceller, keratocytter og endotelceller og acellulære komponenter som kollagen og glykosaminoglykaner2. Området er drenert av tårer som også forsyner de fleste næringsstoffene. Os anatomiske posisjon tvinger det til å være i direkte kontakt med det ytre miljøet, og utsetter det ofte for ulike harde komponenter som sterkt lys, mikrober, støvpartikler og kjemikalier. Denne faktoren predisponerer operativsystemet for fysiske skader og gjør det utsatt for ulike sykdommer.
Oksidativt stress skyldes disequilibrium mellom produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) og endogene antioksidantforsvarsmekanismer3. ROS er klassifisert i reaktive molekyler og frie radikaler, som begge er avledet fra molekylært oksygen (O2) gjennom mitokondrieoksidatorylering4. Den tidligere gruppen består av ikke-radikale arter som hydrogenperoksid (H2O2),enkeltoksygen (1O2) og sistnevnte inkluderer blant annet arter som superoksidanioner (O2-) og hydroksylradikaler (•OH). Disse molekylene er biprodukter av normale cellulære prosesser og deres roller har vært innblandet i viktige fysiologiske funksjoner som signaltransduksjon, genuttrykk og vertsforsvar5. En forbedret produksjon av ROS er kjent for å bli generert som svar på faktorer som patogen invasjon, xenobiotika, og eksponering for ultra fiolett (UV) stråling4. Denne overproduksjonen av ROS resulterer i oksidativt stress som fører til skade på molekyler som nukleinsyrer, proteiner og lipider6.
Naturlig sollys, den mest dominerende kilden til UV-stråling, består av UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) og UV-C (290–200 nm)7. En invers sammenheng mellom bølgelengden og spektralenergiene er rapportert. Selv om naturlige UV-C-strålinger absorberes av atmosfæren, avgir kunstige kilder som kvikksølvlamper og sveiseinstrumenter, og utgjør derfor en yrkesfare. Symptomer på eksponering for øyne inkluderer fotokeratitt og fotokeratoconjunctivitis8. Produksjon av ROS er en av de viktigste mekanismene for å påføre UV-indusert cellulær skade9. I den nåværende studien viser vi påvisning av ROS ved hjelp av 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) farging ser metode i musen primære okulære overflateceller / stamceller utsatt for UV-C. Den grønne fluorescensen ble fanget ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Cellene var motfarget med to fargestoffer, Hoechst 33342 og rød propidiumjodid, for å beise de levende og døde cellene, henholdsvis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883</td>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>SA 003700112</td>
			<td>Sterile dishes for culturing the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AT007</td>
			<td>Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, EU Origin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM99955</td>
			<td>One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutMax</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Hybridization oven/UV cross linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used as a supplement to increase the cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gentle cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage

Okulær overflate er utsatt for vanlig slitasje på grunn av ulike miljøfaktorer. Eksponering for UV-C-stråling utgjør en helsefare på arbeidsplassen. Her viser vi eksponeringen av primære stamceller fra musenokulær overflate til UV-C-stråling. Reaktiv oksygenart (ROS) dannelse er avlesningen av omfanget av oksidativt stress/ skade. I en eksperimentell in vitro-innstilling er det også viktig å vurdere prosentandelen av døde celler som genereres på grunn av oksidativt stress. I denne artikkelen vil vi demonstrere 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) farging av UV-C eksponert mus primære okulær overflate stamceller og deres kvantifisering basert på fluorescerende bilder av DCFDA farging. DCFDA farging direkte tilsvarer ROS generasjon. Vi viser også kvantifisering av døde og levende celler ved samtidig farging med propidiumjodid (PI) og Hoechst 3332 henholdsvis og prosentandelen av DCFDA (ROS positive) og PI positive celler.

DCFDA er en fargeløs fargestoff som er en kjemisk redusert form for fluorescein som brukes som en indikator for å oppdage ROS i celler. Dette fargetået blir fanget inne i celler og oksideres lett til fluorescerende diklorodihydrofluorescein (DCF), som avgir en grønn fluorescens. Denne fluorescensen kan oppdages ved hjelp av fluorescerende mikroskopi. Cellene kan visualiseres og korreleres med ROS akkumulering som følger: (i) levende celler uten ROS avgir høy blå fluorescens; (ii) levende celler med ROS akkumulerin...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Denne protokollen demonstrerer samtidig påvisning av reaktive oksygenarter (ROS), levende celler og døde celler i levende primære kulturer fra musen okulære overflateceller. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium jodid, og Hoechst farging brukes til å vurdere ROS, døde celler, og levende celler, henholdsvis, etterfulgt av bildebehandling og analyse.

Vurdering av oksidativ skade i primær mus okulære overflateceller / stamceller som svar på ultrafiolett-C (UV-C) skade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Hei alle sammen, jeg heter Dr.Bipasha Bose. Jeg jobber som førsteamanuensis og har ansvaret for stamceller og regenerativmedisinsenter, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, India. Nå skal vi demonstrere hvordan å oppdage for tilstedeværelsen for ROS som er reaktive oksygenarter"i levende kulturer fra musen okulære overflater som har blitt utsatt for ulike doser av ultrafiolett-C stråling.Fordelen med denne teknikken er at her kan vi samtidig oppdage for tilstedeværelse av reaktive oksygenarter, levende og døde celler, uten å måtte ha Vester-celler. Prinsippet om denne teknikken ligger i hovedsak i levende cellepermeabilitet av fargestoff DCFDA. DCFDA er en levende celle permeant fargeløs fargestoff, som under oksidativt stress blir handlet på av intracellulære oksidaser og blir omgjort til grønn fluoriserende DCF.Derfor gjør den grønne florescence oss i stand til å oppdage for tilstedeværelse av reaktive oksygenarter i de levende cellene. På den annen side er propidiumjodid en utelukkende død celle permeant fargestoff som fluorescerer rødt. Det er en rDNA dobbelttrådet intercalating fargestoff.Fargestoffet Hoechst er imidlertid gjennomsyret av både levende og døde celler. Det er en blå farge kjernefysisk flekk. Derfor er dette en veldig enkel metode der vi kan oppdage for tilstedeværelse av reaktive oksygenarter i langsiktige kulturer på en tidsavhengig måte sammen med vurderingen av døde celler.Plate punkt to millioner celler per 35 millimeter kultur retter. Cellene vi bruker er cellene fra musokulær overflate. Fjern maksimalt volum av medier fra hver av cellekulturrettene.Legg igjen rundt 500 mikroliter cellekulturmedier i nær kontakt med cellene. Minimal mengde medier vil forhindre tørking av cellene. Hensikten med minimal mengde medier er imidlertid å tillate maksimal penetrasjon av UVC-eksponering.Ta cellene under en UV-kilde, det kan være enten en UV Crosslinker, eller kan være en annen ultrafiolett-C kilde. Utsett cellene for forskjellig dosering av UVC-stråling som en, 10, 100, 1, 000 og 10 000 joule per kvadratmeter. Når cellene har utsatt for ultrafiolett-C-stråling, bør lokkene være i åpen stilling.Dette vil tillate maksimal penetrasjon av ultrafiolett-C til cellene og dermed vise den optimale doseresponsen av cellene til ultrafiolett-C-stråling. Ta cellene til laminær luftstrømhette og fyll hver av rettene med to milliliter komplette medier. Dette komplette mediet inneholder 20% føtal storfe serum i DMEM, supplert med kosttilskudd som 1% minimum ikke-essensielle aminosyrer, og også 1% antibiotika som er penicillin og streptomycin.Etterpå, etter etterfylling med maksimalt volum, det vil si to milliliter komplett media, returnere platene til inkubatoren og inkubere i en periode på tre timer for å se tidlige effekter av ultrafiolett-C-stråling. Forbered live cellefarging media i de siste 15 minuttene av tre timers post UVC celle inkubasjon. Farging media er utarbeidet i 10% FBS inneholder DMEM pre-varmet til 37 grader.For å lage 10 milliliter flekker, legg først til fem mikroliter DCFDA fra et lager på 10 millimolar for å oppnå en endelig konsentrasjon på fem mikromos. Bland godt ved å pipetter opp og ned. For det andre, legg til fem mikroliter Hoechst-løsning fra en beholdning på 10 mg per ml for å oppnå en endelig konsentrasjon på fem mikrogram per ml.Bland godt ved å pipetter opp og ned. Til slutt legge til 200 mikroliter propidiumjodid fra en bestand av ett mg per ml for å oppnå en endelig konsentrasjon på 20 mikrogram per ml. Bland godt ved å pipetter opp og ned.Nå er fargeløsningen klar til bruk. Etter tre timers inkubasjon etter UVC-eksponering, fjern platene fra CO2-inkubatoren. Aspirer ut media fra hver av rettene som har blitt utsatt for ulike dosering av UVC som en, 10, 100, 1, 000 og 10.000 joule per kvadratmeter.Legg nå til to milliliter nylaget levende cellefargingsmedier til hver av rettene forsiktig fra sidene av oppvasken. Returner platene til CO2 inkubatoren igjen og inkuber i 15 minutter for levende cellefarging. Etter 15 minutter med inkubasjon i levende cellefarging media, fjerne farging media fra hver av rettene som inneholder celler utsatt for ulike doser av ultrafiolett-C stråling.Etterfyll cellene med to milliliter komplette medier. Nå er cellene klare til visning. Plasser nå kontrollcellene under det lyse feltet til den fluorescerende imageren.Cellene ser tilsynelatende normale ut siden de er kontrollceller. Under det blå feltet kan vi fluorisere totalt celler. Under det grønne feltet viser ROS generasjon.Siden disse er kontrollceller, er det ingen ROS generert. Under det røde feltet er propidiumjodidfargede døde celler synlige. Hold deretter UV-eksponert 100 joule per meter kvadrat under det lyse feltet.Under det blå feltet, og også vi kan se det totale cellenummeret under det blå feltet. Men når vi utsetter for grønt felt, er DCFDA positive celler sett, og også PI positive døde celler er sett. Til slutt, plasser den maksimale UV-dosen, det vil si 10.000 joule per meter firkantede eksponerte celler, under det lyse feltet.Vi kan se unormal cellemorfologi. Men under det blå feltet kan vi se totalt blå celler. Under det grønne feltet ses grønne fluoriserende DCFDA-positive celler som indikerer ROS-generasjonen.Når cellene er utsatt for rødt felt, alle cellene var fluorescing rød indikerer et stort antall celle død når cellene behandles med 10,000 joules per meter kvadrat av UV dosering. Ordne nå bildene som er tatt i ulike kanaler i et enkelt sammensatt bildepanel som tilsvarer ultrafiolette-C-doser og ueksponerte kontroller. Bildene er ordnet i ett enkelt panel i gruppen.Først det lyse feltet. For det andre, den hoechst blå kjernefysiske flekken. Tredje, propidiumjodid farging som for døde kjerner.Fjerde, DCFDA for ROS positive celler. Og for det femte, det sammenslåtte bildet. Når vi ser på den første og andre raden med bilder, som er ueksponert kontroll og cellene utsatt for UVC-dosen en joule per meter kvadrat, observerte vi at det verken var PI eller ROS positive celler som hadde lyset opp, og dermed indikerer et fullstendig fravær av ROS og celledød i ueksponerte kontroller og en så lav UVC-dose på en joule per meter kvadrat.Nå kommer til den tredje raden med sammensatte bilder av cellene som ble utsatt for 100 joule per kvadratmeter kvadratmeter. En svært lav prosentandel av celler, ca 10%var positive for både PI og DCFDA ved denne dosen, og dermed indikerer lav mengde ROS generasjon og celledød. Nå går vi videre til en ytterligere høyere dose UVC-strålingseksponering, det vil si 1000 joule per meter kvadrat som angitt i fjerde rad av sammensatt bilde.Her var omtrent 70% av cellene positive for PI og DCFDA. Til slutt går vi videre til høyeste dose UVC-eksponering, det vil si 10.000 joule per meter kvadrat som representert i den femte raden av sammensatt bilde. Her ble funnet at nesten 100% av cellene var positive for både PI og DCFDA, og dermed indikerer en 100% celledød og ROS generasjon ved denne spesielle UVC dose.Overfør bildene til bildeprogramvaren. Først åpne det blå bildet som indikerer Hoescht farget kjerner, det er det totale antall celler. Åpne telleverktøyet og klikk hver av cellene én om gangen for å få nummeret.Åpne nå bildet tatt under den røde kanalen som indikerer PI-positive døde celler. Åpne telleverktøyet, og klikk på hver av de røde flekkene som angir antallet for PI-positive døde celler. Når tellingen av de døde cellene er over, klikker du på den grønne kanalen fanget celler og åpne telleverktøyet og klikk hver av de grønne flekkene som indikerer cellene som viser ROS-generasjonen.Fullfør tellingen av de grønne cellene som er fanget under den grønne kanalen, og bruk deretter formelen nummererer prosentandelen av celledød ved UVC-skade og prosentandel av ROS-produksjon ved UVC-skade. Dette beregnes ved hjelp av det enkle formelnummeret til PI-positive celler, det vil si de røde fluoriseringscellene, delt på antall Hoechst-positive celler multiplisert med 100. Prosentandel av ROS-produksjon ved UV-skade beregnes ved hjelp av formelen, antall DCFDA-positive eller grønne fluoriseringsceller, delt på antall Hoechst-positive celler multiplisert med 100.Når du har både prosentene, det vil si prosentandel av celledød og prosentandelen av ROS-produksjon, bruker du disse verdiene til å tegne en stolpediagram. X-aksen indikerer doseringen av UV, mens y-aksen indikerer prosentandelen av celler. De grønne linjene angir prosentandelen av ROS-generering, mens den røde linjen angir prosentandelen av celledød.Ved analyse er det tydelig at ved UVC dose 100 joules er det 10% ROS genererecelle samt en 10% celle død. Mens ved UVC dose 10 hevet til tre joule per meter kvadrat, 70% celler viste ROS generasjon samt celledød. Mens på den høyeste dosen av UVC, det vil si 10 hevet til fire joules per meter kvadrat, ca 100% celler viste celledød samt ROS produksjon.Derfor kan det konkluderes med at det er en sterk positiv sammenheng mellom ROS-generasjonen og celledød. Til slutt er denne teknikken veldig nyttig for samtidig vurdering av reaktive oksygenarter, levende og døde celler i levende, normal arrangementskultur. Denne teknikken er også nyttig for begrenset vurdering av reaktive oksygenarter, levende og døde celler, i langsiktige kulturer som har blitt utsatt for ulike celleskademidler som ultrafiolett stråling eller kjemiske midler.Og denne teknikken kan også veilede en forsker for å bestemme den optimale tiden for høsting av cellene som 50% ROS, 75% ROS, så og så videre som det kan være for mange nedstrøms applikasjoner, for eksempel QR til PCR og vestlig blotting.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Produksjon og bruk av Lentivirus til Selektivt transduce Primær oligodendrocyte forløper celler for<em&gt; In Vitro</em&gt; myelination Analyser

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimalisering av Wound Scratch analysen å oppdage endringer i Murint Mesenchymale stromal Cell Migration Etter Skade ved Løselig sigarettrøyk Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Veksten av musen Preantral follikler Under simulert mikrogravitasjon

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Bruk av RNAi og varme-sjokk-indusert transkripsjon faktor uttrykk å omprogrammere bakterie celler til nerveceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induksjon og validering av mobilnettet Senescence i primære menneskeceller

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Monocular visuell deprivasjon og okulær dominans plasticity måling i musen primære visuelle cortex

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...