Name: assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage
Uploaded: 2020-02-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Yazarlar, altyapı tesisleri için Yenepoya Araştırma Merkezi, Yenepoya (Üniversite olarak kabul edilir) desteği kabul.

Deney İsviçre albino fare gözünden elde edilen primer göz hücreleri/kök hücreler üzerinde gerçekleştirildi. Bu deney için hayvanların göz hasat için kullanımı Kurumsal Hayvan Etik Komitesi, Yenepoya (Üniversite olarak kabul) (IEAC onay numarası, 6a.19.10.2016) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlıkları
NOT: Fare oküler yüzeyinden birincil hücrelerin/kök hücrelerin türemesi bu protokolün kapsamı dışındadır. Bu nedenle, ...

<ol>
	<li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+the+challenge+to+enable+and+protect+vision:+the+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: the challenge to enable and protect vision: the Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Sridhar, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+cornea+and+ocular+surface.">Anatomy of cornea and ocular surface.</a> Indian Journal of Ophthalmoogy. 66 (2), 190-194 (2018).</li><li>Betteridge, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+oxidative+stress.">What is oxidative stress.</a> Metabolism. 49 (2), 3-8 (2000).</li><li>Ray, P. D., Huang, B. W., Tsuji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+(ROS)+homeostasis+and+redox+regulation+in+cellular+signaling.">Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.</a> Cell Signaling. 24 (5), 981-990 (2012).</li><li>Nita, M., Grzybowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Reactive+Oxygen+Species+and+Oxidative+Stress+in+the+Pathomechanism+of+the+Age-Related+Ocular+Diseases+and+Other+Pathologies+of+the+Anterior+and+Posterior+Eye+Segments+in+Adults.">The Role of the Reactive Oxygen Species and Oxidative Stress in the Pathomechanism of the Age-Related Ocular Diseases and Other Pathologies of the Anterior and Posterior Eye Segments in Adults.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3164734 (2016).</li><li>Covarrubias, L., Hernandez-Garcia, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development:+passive+or+active.">Function of reactive oxygen species during animal development: passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li><li>Behar-Cohen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+damage+to+the+eye+revisited:+eye-sun+protection+factor+(E-SPF(R)),+a+new+ultraviolet+protection+label+for+eyewear.">Ultraviolet damage to the eye revisited: eye-sun protection factor (E-SPF(R)), a new ultraviolet protection label for eyewear.</a> Clinical Ophthalmology. 8, 87-104 (2014).</li><li>Izadi, M., Jonaidi-Jafari, N., Pourazizi, M., Alemzadeh-Ansari, M. H., Hoseinpourfard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photokeratitis+induced+by+ultraviolet+radiation+in+travelers:+A+major+health+problem.">Photokeratitis induced by ultraviolet radiation in travelers: A major health problem.</a> Journal of Postgraduate Medicine. 64 (1), 40-46 (2018).</li><li>de Jager, T. L., Cockrell, A. E., Du Plessis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+Light+Induced+Generation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Ultraviolet Light Induced Generation of Reactive Oxygen Species.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 996, 15-23 (2017).</li><li>Degl'Innocenti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxadiazon+affects+the+expression+and+activity+of+aldehyde+dehydrogenase+and+acylphosphatase+in+human+striatal+precursor+cells:+A+possible+role+in+neurotoxicity.">Oxadiazon affects the expression and activity of aldehyde dehydrogenase and acylphosphatase in human striatal precursor cells: A possible role in neurotoxicity.</a> Toxicology. 411, 110-121 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC-Cdh1+Regulates+Neuronal+Apoptosis+Through+Modulating+Glycolysis+and+Pentose-Phosphate+Pathway+After+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reperfusion.">APC-Cdh1 Regulates Neuronal Apoptosis Through Modulating Glycolysis and Pentose-Phosphate Pathway After Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 39, 123-135 (2019).</li></ol>

Burada açıklanan DCFDA boyama yöntemi, UV-C radyasyonu ile tedavi edilen fare primer göz canlı hücrelerinde ROS'un görüntülenmesine olanak sağlar. Bu boyama yönteminin bir avantajı da araştırmacılar UV-C hemen etkilerini incelemek için izin olmasıdır (3 saat uvc sonrası maruz kalma) canlı hücreler ve ROS pozitif yüzdesi için eşzamanlı numaralandırma, yanı sıra, ölü hücreler. Ayrıca, boyama yöntemi canlı hücreler üzerinde kullanıldığından, hücreler UV-C radyasyonunun gecikmiş etki...

Göz yüzeyi (OS) fonksiyonel bir birim ağırlıklı olarak dış tabaka ve kornea glandüler epitel oluşan, lachrymal bezi, meibomian bezi, konjonktiva, göz kapağı marjları ve innervasyonları bir parçası bu transduce sinyalleri1. Şeffaf kubbe şeklindeki kornea tabakası retinaüzerine ışık odaklanır. Bu avasküler doku epitel hücreleri, keratositler ve endotel hücreleri ve kollajen ve glikozaminoglikanlar 2 gibi hücresel bileşenler gibi hücresel bileşenlerden oluşur2. Alan da besinlerin çoğunu kaynağı gözyaşları tarafından boşaltılır. İşletim sistemi anatomik konumu genellikle parlak ışık, mikroplar, toz parçacıkları ve kimyasallar gibi çeşitli sert bileşenlere maruz, dış çevre ile doğrudan temas olması için zorlar. Bu faktör işletim sistemi fiziksel yaralanmalara yatkındır ve çeşitli hastalıklara yatkın hale getirir.
Oksidatif stres reaktif oksijen türlerinin üretimi arasındaki dengesizlik nedeniyle kaynaklanır (ROS) ve endojen antioksidan savunma mekanizmaları3. ROS, moleküler oksijenden (O2)mitokondriyal oksidatif fosforilasyon4ile elde edilen reaktif moleküller ve serbest radikaller olarak sınıflandırılır. Eski grup hidrojen peroksit (H2O2),singlet oksijen (1O2) gibi radikal olmayan türlerden oluşur ve ikincisi süperoksit anyonlar (O2-), ve hidroksil radikalleri(•OH) gibi türleri içerir. Bu moleküller normal hücresel süreçlerin yan ürünleridir ve rolleri sinyal transdüksiyonu, gen ekspresyonu ve konaksavunması5 gibi önemli fizyolojik fonksiyonlarda rollenmiştir. Ros gelişmiş bir üretim patojen invazyonu, ksizbiyotikler ve ultraviyole maruz kalma gibi faktörlere yanıt olarak üretildiği bilinmektedir 4. ROS'un bu aşırı üretimi, nükleik asitler, proteinler velipidler6 gibi moleküllerin zarar görmesine yol açan oksidatif strese yol açar.
Doğal güneş ışığı, UV radyasyonunun en baskın kaynağı, UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) ve UV-C (290-200 nm)7oluşur. Dalga boyu ve spektral enerjiler arasında ters bir korelasyon bildirilmiştir. Doğal UV-C ışınları atmosfer tarafından emilir rağmen, cıva lambaları ve kaynak aletleri gibi yapay kaynaklar yayarlar ve bu nedenle, bir mesleki tehlike oluşturmaktadır. Gözlere maruz kalma belirtileri fotokeratit ve fotokeratokonjonktivit8içerir. ROS üretimi UV kaynaklı hücresel hasar inflicting önemli mekanizmalardan biridir9. Mevcut çalışmada, UV-C'ye maruz kalan fare primer oküler yüzey hücrelerinde/kök hücrelerinde 2',7'-Diklorodihidrofloresesein diasetat (DCFDA) boyama yöntemi kullanılarak ROS saptanması gösterilmiştir. Yeşil floresan floresan mikroskopi ile yakalandı. Hücreler, canlı ve ölü hücreleri lekelemek için iki boya, Hoechst 33342 ve kırmızı propidium iyodür ile karşı lekeli idi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6883</td>
			<td>2&#39;,7&#39;-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dish (35 mm)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>SA 003700112</td>
			<td>Sterile dishes for culturing the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>AT007</td>
			<td>Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, EU Origin</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM99955</td>
			<td>One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutMax</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HL-2000 Hybrilinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Hybridization oven/UV cross linker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td>Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids (100X)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td>Used as a supplement to increase the cell growth and viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TryplE Express</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Gentle cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZOE Fluorescent Cell Imager</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of oxidative damage in the primary mouse ocular surface cells/stem cells in response to ultraviolet-c (uv-c) damage

Oküler yüzey çeşitli çevresel faktörler nedeniyle düzenli aşınma ve yıpranmaya maruz kılmaktadır. UV-C radyasyonuna maruz kalmak iş sağlığı açısından tehlike oluşturur. Burada, fare oküler yüzeyinden UV-C radyasyonuna birincil kök hücrelerin maruz kalma gösteriş. Reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu oksidatif stres/hasar ın derecelerinin okunmasıdır. Deneysel bir in vitro ayarda, oksidatif stres nedeniyle oluşan ölü hücrelerin yüzdesini değerlendirmek de gereklidir. Bu yazıda, UV-C maruz kalan fare primer oküler yüzey kök hücrelerinin 2',,7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) boyama ve dcfda boyama floresan görüntüleridayalı bunların nicelliği gösterecektir. DCFDA boyama doğrudan ROS üretimine karşılık gelir. Ayrıca sırasıyla propidium iyodür (PI) ve Hoechst 3332 ile eşzamanlı boyama ve DCFDA (ROS pozitif) ve PI pozitif hücrelerin yüzdesi ile ölü ve canlı hücrelerin sayısallaştırılmasını gösteriyoruz.

DCFDA hücrelerde ROS tespit etmek için bir gösterge olarak kullanılan floresan kimyasal olarak azaltılmış bir formu renksiz bir boya. Bu boya hücrelerin içinde sıkışıp alır ve kolayca floresan diklorodihidrolüorescein okside edilir (DCF), hangi yeşil floresan yayan. Bu floresan floresan mikroskopi ile tespit edilebilir. Hücreler şu şekilde görüntülenebilir ve ROS birikimi ile ilişkilendirilebilir: (i) ROS'suz canlı hücreler yüksek mavi floresan yontabilir; (ii) ROS birikimi ile canlı hücreler ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage at JoVE.com

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Bu protokol, fare oküler yüzey hücrelerinden canlı birincil kültürlerde reaktif oksijen türlerinin (ROS), canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin eşzamanlı olarak tespitini göstermektedir. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iyodür ve Hoechst boyama ros, ölü hücreleri ve canlı hücreleri değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla, görüntüleme ve analiz izledi.

Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Herkese merhaba, benim adım Dr.Bipasha Bose. Ben bir doçent olarak çalışmak ve Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp Merkezi, Yenepoya Araştırma Merkezi, Yenepoya Üniversitesi, Mangalore, Hindistan sorumlu. Şimdi, çeşitli dozlarda ultraviyole-C radyasyonuna maruz kalan fare oküler yüzeylerinden canlı kültürlerde reaktif oksijen türlerinin ROS'un varlığını nasıl tespit edebileceğimizi göstereceğiz.Bu tekniğin avantajı, burada aynı anda reaktif oksijen türlerinin varlığı için tespit edebilirsiniz, canlı ve ölü hücreler, Vester hücreleri gerek kalmadan. Bu tekniğin prensibi esas olarak boya DCFDA canlı hücre geçirgenliği yatıyor. DCFDA canlı hücre permeant renksiz boya, oksidatif stres sırasında hücre içi oksidazlar tarafından üzerine hareket alır ve yeşil floresan DCF dönüştürülür alır.Bu nedenle, yeşil floresans bize canlı hücrelerde reaktif oksijen türlerinin varlığı için tespit sağlar. Öte yandan, propidium iyodür sadece ölü bir hücre permeant boya olan floresan kırmızı. Bu bir rDNA çift iplikçikli intercalating boya.Ancak, boya Hoechst hem canlı hem de ölü hücreler için perkasted olduğunu. Mavi renkli bir nükleer leke. Bu nedenle, bu ölü hücrelerin değerlendirilmesi ile birlikte bir zaman bağımlı bir şekilde uzun vadeli kültürlerde reaktif oksijen türlerinin varlığı için tespit edebilirsiniz çok basit bir yöntemdir.Plaka noktası 35 milimetrelik kültür yemekleri başına iki milyon hücre. Uyguladığımız hücreler fare oküler yüzeyindeki hücreler. Hücre kültürü yemeklerinin her birinden maksimum ortam hacmini çıkarın.Hücrelerle yakın temas halinde hücre kültürü ortamının yaklaşık 500 mikrolitresini geride bırakın. En az miktarda ortam hücrelerin kurumasını önleyecektir. Ancak, ortam en az miktarda amacı UVC maruz maksimum penetrasyon sağlamaktır.Bir UV kaynağı altında hücreleri alın, ya bir UV Crosslinker olabilir, ya da başka bir ultraviyole-C kaynağı olabilir. Bir, 10, 100, 1, 000 ve metre kare başına 10, 000 joule gibi UVC radyasyon farklı dozaj hücreleri maruz. Hücreler ultraviyole-C radyasyonuna maruz kaldığında, kapaklar açık pozisyonda olmalıdır.Bu hücrelere ultraviyole-C maksimum penetrasyon sağlayacak ve dolayısıyla ultraviyole-C radyasyon hücrelerinin optimal doz-yanıt göstermek. Hücreleri laminar hava akışı başlığına getirin ve iki mililitre tam ortamla her yemeği yenile. Bu tam medya Içerir 20%fetal sığır serumU DMEM, gibi takviyeleri ile takviyeler 1%minimum esansiyel olmayan amino asitler, ve ayrıca% 1 penisilin ve streptomisin antibiyotik.Daha sonra, maksimum hacim ile yenilenme sonra, tam medya iki mililitre, ultraviyole-C radyasyonun erken etkilerini görmek için üç saatlik bir süre için kuvöz ve kuluçka plakaları iade. UvC hücre kuluçka sonrası üç saat son 15 dakika içinde canlı hücre boyama ortamı hazırlayın. Boyama ortamı 37 dereceye kadar önceden ısıtılmış DMEM içeren %10 FBS'de hazırlanır.Boyama medya 10 mililitre yapmak için, ilk dcfda beş mikrolitre eklemek 10 milimolar bir stok böylece beş mikromolar son konsantrasyon elde etmek için. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın. İkinci olarak, mL başına beş mikrogram lık son konsantrasyonelde etmek için mL başına 10 miligramlık bir stoktan beş mikrolitre Hoechst çözeltisi ekleyin.Şimdi yukarı ve aşağı borular yaparak iyice karıştırın. Son olarak mL başına 20 mikrogram lık son konsantrasyonelde etmek için mL başına bir miligramlık bir stoktan 200 mikrolitre propidium iyodür ekleyin. Yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın.Şimdi boyama çözeltisi kullanıma hazırdır. UVC'ye maruz kaldıktan sonra üç saatlik kuluçka dan sonra, plakaları CO2 kuluçka makinesinden çıkarın. Bir, 10, 100, 1, 000 ve metre kare başına 10,000 joule gibi UVC çeşitli dozda maruz kalmış yemeklerin her birinden medya aspire.Şimdi yemeklerin kenarlarından hafifçe her tabak için taze hazırlanmış canlı hücre boyama medya iki mililitre ekleyin. Plakaları tekrar CO2 kuluçka makinesine geri verin ve canlı hücre boyama için 15 dakika kuluçkaya yatırın. Canlı hücre boyama ortamlarında 15 dakikalık kuluçkadan sonra, farklı dozlarda ultraviyole-C radyasyonuna maruz kalan hücreleri içeren her bir yemekten boyama ortamını çıkarın.Hücreleri iki mililitre tam ortamla doldurun. Artık hücreler görüntülemeye hazır. Şimdi kontrol hücrelerini floresan görüntüleyicinin parlak alanının altına yerleştirin.Kontrol hücreleri oldukları için hücreler normal görünüyor. Mavi alanın altında toplam hücreleri floresan olabilir. Yeşil alanın altında ROS nesil gösterir.Bunlar kontrol hücreleri olduğundan, üretilen ROS yoktur. Kırmızı alanın altında, propidium iyodür lekeli ölü hücreler görülebilir. Sonra UV parlak alan altında metre kare başına 100 joule maruz tutun.Mavi alanın altında, ve ayrıca mavi alanın altındaki toplam hücre numarasını görebiliriz. Ancak, yeşil alana maruz kaldığımız zaman DCFDA pozitif hücreler görülür ve ayrıca PI pozitif ölü hücreler görülür. Son olarak, maksimum UV dozu yerleştirin, yani 10, 000 joule metre kare maruz hücreleri başına, parlak alan altında.Anormal hücre morfolojisini görebiliyoruz. Ancak, mavi alanın altında toplam mavi hücreleri görebilirsiniz. Yeşil alanın altında, yeşil floresan DCFDA pozitif hücreler ROS kuşağını gösterir.Hücreler kırmızı alana maruz kaldığında, tüm hücreler, hücreler UV dozunun metre karebaşına 10,000 joule ile tedavi edildiğinde hücre ölümü çok sayıda gösteren kırmızı floresan edildi. Şimdi ultraviyole-C dozları ve maruz kalan kontroller karşılık gelen tek bir kompozit görüntü paneli içine çeşitli kanallarda yakalanan görüntüleri düzenlemek. Görüntüler grup halinde tek bir panel halinde düzenlenmiştir.İlk olarak, parlak alan. İkincisi, Hoechst mavi nükleer lekesi. Üçüncüsü, ölü çekirdekler için propidium iyodür boyama.Dördüncü, ROS pozitif hücreler için DCFDA. Ve beşincisi, birleştirilmiş görüntü. Görüntülerin birinci ve ikinci satırına baktığımızda, maruz kalmamış kontrol ve UVC dozuna maruz kalan hücreler metre kare başına bir joule, biz ışıklı vardı ne PI ne de ROS pozitif hücreler olduğunu gözlemledik, bu nedenle maruz kalmamış kontrollerde ROS ve hücre ölümü tam bir yokluğu gösteren ve metre kare başına bir joule gibi düşük UVC dozu.Şimdi metre kare başına 100 joule maruz kalan hücrelerin kompozit görüntülerin üçüncü satırı geliyor. Hücrelerin çok düşük bir yüzdesi, yaklaşık 10% bu dozda hem PI ve DCFDA için pozitif, böylece ROS üretimi ve hücre ölümü düşük miktarda gösteren. Şimdi uvc radyasyona maruz kalma daha yüksek bir doz için hareket, kompozit görüntünün dördüncü satırında belirtildiği gibi metre kare başına 1.000 joule.Burada, hücrelerin yaklaşık% 70 PI ve DCFDA için pozitif. Son olarak, kompozit görüntünün beşinci satırında temsil edildiği gibi, en yüksek dozda UVC maruziyetine geçiyoruz, yani metre karebaşına 10,000 joule. Burada hücrelerin neredeyse% 100 pi ve DCFDA için pozitif olduğunu bulmak, böylece bir gösteren 100%hücre ölümü ve ROS üretimi bu özel UVC dozda.Görüntüleri görüntüleme yazılımına aktarın. Önce Hoescht lekeli çekirdekleri gösteren mavi görüntüyü açın, bu hücrelerin toplam sayısıdır. Sayma aracını açın ve sayıya sahip olmak için hücrelerin her birini teker teker tıklatın.Şimdi PI pozitif ölü hücreleri gösteren kırmızı kanal altında yakalanan görüntüyü açın. Sayma aracını açın ve PI pozitif ölü hücrelerin sayısını gösteren kırmızı noktaların her birini tıklatın. Ölü hücrelerin sayımı bittikten sonra, yakalanan yeşil kanala tıklayın ve sayma aracını açın ve ROS neslini gösteren hücreleri gösteren yeşil noktaların her birini tıklatın.Yeşil kanal altında yakalanan yeşil hücrelerin sayımını tamamlayın ve formülü kullanarak UVC hasarı ve UVC hasarı ile ROS üretim yüzdesi ile hücre ölüm yüzdesi sayıştırın. Bu, 100 ile çarpılır Hoechst pozitif hücrelerin sayısına bölünen kırmızı floresan hücreleri olan PI pozitif hücrelerin basit formül numarası kullanılarak hesaplanır. UV hasarına göre ROS üretim yüzdesi formülü kullanılarak hesaplanır, DCFDA pozitif sayısı, veya yeşil floresan hücreleri, Hoechst pozitif hücrelerin sayısı 100 ile çarpılır bölünür.Hücre ölüm yüzdesi ve ROS üretim yüzdesi olmak üzere her iki yüzdeye de sahip olduktan sonra, bir çubuk grafiği çizmek için bu değerleri kullanın. X ekseni UV dozajını, y ekseni ise hücrelerin yüzdesini gösterir. Yeşil çubuklar ROS neslinin yüzdesini gösterirken, kırmızı çubuk hücre ölüm yüzdesini gösterir.Analiz üzerine, UVC dozu 100 joule%10 ROS üreten hücre nin yanı sıra %10 hücre ölümü olduğu açıktır. UVC dozu 10 metre kare başına üç joule yükseltilmiş ise, 70% hücreleri ROS üretimi yanı sıra hücre ölümü sergiledi. UVC en yüksek dozda iken, yani 10 metre kare başına dört joule yükseltilmiş, yaklaşık% 100 hücreleri hücre ölümü yanı sıra ROS üretimi sergiledi.Bu nedenle, ROS üretimi ile hücre ölümü arasında güçlü bir pozitif korelasyon olduğu sonucuna varılabilir. Sonuç olarak, bu teknik reaktif oksijen türlerinin eşzamanlı olarak değerlendirilmesi için çok kullanışlıdır, canlı ve ölü hücreler canlı, normal olay kültürü. Bu teknik aynı zamanda reaktif oksijen türlerinin sınırlı değerlendirilmesi için yararlıdır, canlı ve ölü hücreler, ultraviyole radyasyon gibi çeşitli hücre zararlı ajanlar maruz kalmış uzun vadeli kültürlerde, veya kimyasal ajanlar.Ve bu teknik aynı zamanda pcr ve Batı lekeleme qr gibi birçok downstream uygulamaları için olabilir gibi% 50 ROS, % 75 ROS, vb ve benzeri olarak hücreleri hasat için en uygun zamanı belirlemek için bir araştırmacı rehberlik edebilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

Vitro Simüle mikrogravite altında fare Preantral follikül gelişimi

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Monocular Visual Deprivation and Ocular Dominance Plasticity Measurement in the Mouse Primary Visual Cortex

Fare Birincil Görsel Kortekste Monoküler Görme Yoksunluğu ve Oküler Baskınlık Plastisite Ölçümü

Monocular visual deprivation is an excellent experimental paradigm to induce primary visual cortical response plasticity. In general, the response of the ...