Name: measuring interactions between fluorescent probes and lignin in plant sections by sflim based on native autofluorescence
Uploaded: 2020-01-02T12:00:00
Duration: 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence at JoVE.com

Fanny Laurent (FARE) est chaleureusement remerciée pour la préparation des chiffres. La Fédération de Recherche FRABio (Université de Lille, CNRS) est reconnue pour fournir l'environnement technique propice à la réalisation de ce travail. Le financement a été obtenu auprès de l'Agence nationale de la recherche Français (projet LIGNOPROG ANR-14-CE05-0026).

1. Préparation de l'échantillon
REMARQUE : Les étapes successives pour la préparation des échantillons sont décrites à la figure 1.
<ol><li>Préparation de l'échantillon de plantes<ol>
<li>À partir de troncs ou de fragments de bois, coupez des échantillons de 1 cm de long avec des lames de rasoir sans endommager leur structure.</li>
		<li>Intégrez les échantillons dans le milieu du polyéthylène glycol (PEG), en les trempant dans des solutions successives d'augmentation de la concentration de PEG diluée dans l'eau jusqu'à ce qu'elle atteigne 100 % DE PEG.<ol>
<li>Placer l'échantillon sous vide pour enlever l'eau.</li>
			<li>Remuer délicatement les échantillons dans 30% v/v PEG pendant 24 h.</li>
			<li>Remuer délicatement les échantillons dans 50% v/v PEG pendant 24 h.</li>
			<li>Remuer délicatement les échantillons dans 100 % de PEG pendant 24 h à 70 oC (le PEG pur est solide à température ambiante).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Placer les échantillons dans des capsules à 70 oC (sur une plaque chaude) et diminuer progressivement la température jusqu'à ce qu'ils atteignent la température ambiante.</li>
		<li>Préparer soigneusement 30-60 sections plates d'épaisseur de ces blocs PEG à l'aide d'un microtome et de lames jetables.</li>
		<li>Recueillir et laver les sections dans trois bains successifs d'eau pendant 5 min pour enlever LE PEG des sections.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la sonde fluorescente<ol>
<li>Préparer une solution tampon de 30 mM de phosphate au pH 6.0.</li>
		<li>Peser PEG rhand dextran poudre de sonde de rhodamine.</li>
		<li>Dissoudre la poudre de sonde dans le tampon en remuant continuellement dans une fiole de verre pendant 1 h dans l'obscurité à une concentration finale de 0,1 g/L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloration de l'échantillon de plante<ol>
<li>Incuber les sections avec 500 l de la sonde fluorescente (voir 1.2.3) pendant 72 h (sans remuer) dans un tube en plastique (pas plus de 3 sections par tube) dans l'obscurité.</li>
		<li>Ramassez une section avec un pinceau, adsorbez le tampon avec une feuille propre (évitez de sécher la section), puis montez les sections incubées entre un verre de couverture et un bordereau de #1,5H.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. La durée de vie de la fluorescence et l'étalonnage du système de mesure spectrale
REMARQUE : Le flux de travail complet pour la mesure sFLIM est présenté à la figure 2.
<ol><li>Déterminer la largeur spectrale de la fenêtre du détecteur sFLIM.<ol>
<li>Mettre les cristaux d'urée dans une boîte de culture avec un fond en verre de 0,17 m.</li>
		<li>Placez la boîte de culture sur un porte-échantillon de microscope et sélectionnez l'objectif 20x.</li>
		<li>Sélectionnez un laser Ti:Sa avec une longueur d'onde de 900 nm et une puissance de 2%, et allumez la numérisation.</li>
		<li>Recueillir le deuxième signal harmonique sur le détecteur sFLIM. REMARQUE : Le deuxième signal harmonique est émis à exactement la demi-longueur d'onde d'excitation de 450 nm ; bien que instantanée, cette mesure fournit également la fonction de réponse instrumentale du système.</li>
		<li>Ajuster graduellement la longueur d'onde d'excitation laser de 900 à 980 nm jusqu'à ce que le deuxième signal harmonique soit recueilli dans le deuxième canal spectral (462,5 nm).</li>
		<li>Déterminer la longueur spectrale de la fenêtre (12,5 nm).</li>
		<li>Si la plage spectrale diffère de ce qui est prévu, dépanner en faisant ce qui suit.<ol>
<li>Ajuster le laser à 910 nm.</li>
			<li>Déplacez la position de grille avec une roue de défilement pour mesurer le deuxième signal harmonique sur le premier canal seulement (première limite de canal).</li>
			<li>Ajuster le laser à 935 nm.</li>
			<li>Déplacez la position de grille avec une roue de défilement pour mesurer le deuxième signal harmonique sur le premier canal seulement (deuxième limite de canal).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibration des canaux spectromètres globaux<ol>
<li>Insérez le miroir sur la scène du microscope.</li>
		<li>Sélectionnez le laser continu visible (458 nm, 1% de puissance).</li>
		<li>Recueillir le signal de réflexion sur le détecteur sFLIM et vérifier si les photons sont mesurés dans le canal spectral approprié.</li>
		<li>Répétez l'étape 2.2.2 et 2.2.3 avec tous les lasers continus disponibles (514 nm, 561 nm et 633 nm).</li>
		<li>Si le canal spectral diffère de ce qui est prévu, déplacez la position de grille avec la roue de défilement et répétez les étapes 2.1 et 2.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Caractérisation de la fluorescence de l'échantillon
<ol><li>Dans un spectrofluoromètre équipé d'un accessoire porte-film (p. ex. l'instrument Jasco FP-8500), placez l'échantillon de section végétale (non incubé avec la sonde fluorescente).</li>
	<li>Mesurez l'émission de fluorescence généralement sur la plage 300-600 nm tout en excitant l'échantillon généralement sur la gamme 250-550 nm.</li>
	<li>Tracer l'intensité de la fluorescence par rapport à l'excitation et les longueurs d'onde des émissions pour dessiner une carte de fluorescence 3D.</li>
	<li>Déterminer la zone maximale d'excitation/émission de la parcelle.</li>
</ol>4. Mesure spectrale FRET
<ol><li>Étalonnage autofluorescence<ol>
<li>Sélectionnez l'objectif 20x (NA: 0.8).</li>
		<li>Définir l'excitation laser à deux photons à 750 nm.</li>
		<li>Placez la section de la paille de blé (WS) seule entre la glissière et la glissière.</li>
		<li>Appliquer les paramètres suivants dans le logiciel. Passez en mode lambda. Sélectionnez le détecteur spectral ChS avec une résolution de 9,7 nm. Sélectionnez la plage spectrale entre 420 et 722 nm.</li>
		<li>Acquérir l'image.</li>
		<li>Déterminer le pic d'émission des donateurs (470 nm avec cette configuration).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calibrage de l'accepteur<ol>
<li>Placer les sondes fluorescentes à base de rhodamine dans une boîte de culture avec un fond de verre de 0,17 m.</li>
		<li>Acquérir l'image avec le même réglage.</li>
		<li>Déterminez le pic d'émission de l'accepteur (570 nm avec cette configuration).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminez la plage spectrale avec le signal maximum « WS seul » et aucun signal d'acceptation comme émission de donneur uniquement pour les mesures sFLIM (460-490 nm avec cette configuration).</li>
	<li>Mesure de l'échantillon<ol>
<li>Placez la section de la plante tachée entre la glissière et la glissière.</li>
		<li>Acquérir l'image avec le même réglage.</li>
		<li>Enregistrer le fichier lsm.</li>
		<li>Associer qualitativement un événement FRET fort à une diminution du pic d'émission des donneurs par rapport à l'« échantillon WS seul » et à une augmentation du pic d'émission d'accepteur par rapport à l'échantillon de rhodamine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. mesures sFLIM
REMARQUE: Pour la configuration sFLIM, le système utilisé est une configuration de domaine de temps sFLIM comme décrit précédemment10. Un microscope droit et divers temps corrélés cartes de comptage de photon unique et fabricants de microscope saucinaux peuvent être utilisés et le protocole doit être adapté en conséquence.
<ol><li>Passez le système en mode sFLIM.<ol>
<li>Définir le microscope confocal tel que décrit dans 4.1.1 et 4.1.2.</li>
		<li>Passez au mode Non-Descanned dans le logiciel pour envoyer des photons fluorescents au détecteur sFLIM.</li>
		<li>Définir l'acquisition sFLIM en mode Enable pour permettre le comptage des photons sur le SPC150.</li>
		<li>Sélectionnez la collection de temps de 30 s sur SPC150.</li>
		<li>Vérifiez que le CFD se situe entre 1 x 105 et 1 x 106. CAUTION: Assurez-vous que le nombre de photons mesurés sur la carte TCSPC est toujours inférieur à 1% de la fréquence d'excitation laser (dans cette configuration, la fréquence d'excitation laser est de 80 Mhz et le taux de détection ne peut pas dépasser 800 kHz dans n'importe quel pixel pour éviter un effet d'empilement11).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la section de l'usine « WS alone » entre la glissière et la glissière.<ol>
<li>Définir le logiciel en mode continu pour permettre le balayage laser.</li>
		<li>Choisissez la zone de mesure sur l'échantillon.</li>
		<li>Cliquez sur Démarrer sur le SPC150.</li>
		<li>Enregistrer le fichier sdt.</li>
		<li>Répétez le processus pour au moins 10 échantillons par condition.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la section de la plante tachée entre la glissière et la glissière.<ol>
<li>Répétez les étapes 5.2.1 - 5.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. analyse sFLIM
<ol><li>Sélectionnez les données sFLIM acquises sur "WS alone" et importez-les au logiciel SPCImage à l'aide de File . Importation.</li>
	<li>Sélectionnez les paramètres d'ajustement.<ol>
<li>À partir de l'option Modèle, sélectionnez Multi-exponentials incomplets: 12,5 ns.
</li>
		<li>À partir de l'option Préférences, sélectionnez Calculerla réponse instrumentale automatiquement .</li>
		<li>Dans le menu droit du panneau principal, sélectionnez le modèle 2 en forme exponentielle : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59925/59925equ01.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour chaque canal, appliquez le modèle d'ajustement et enregistrez les paramètres d'ajustement sur une feuille de calcul (un1, un2, t1, t2).</li>
	<li>Pour la comparaison entre les canaux et les expériences, calculez la durée de vie moyenne de fluorescence dans une feuille de calcul (Tm) : <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59925/59925equ02.jpg">
</li>
	<li>Calculez la durée de vie moyenne pour tous les échantillons (au moins 10) dans tous les canaux.<ol>
<li>Analyser Tm sur les canaux des donneurs (du canal 1 à 3: 460-490 nm) et déterminer le canal dédié (canal 2 correspondant à 467,5 - 480 nm) qui affiche le nombre de photons le plus élevé et correspond à l'émission maximale de lignine. Les valeurs du canal 2 doivent être utilisées à l'étape 6.7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sélectionnez les données sFLIM acquises sur Les WS tachés et les importer au logiciel SPCImage.<ol>
<li>Répétez les étapes 6.1-6.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculer l'efficacité FRET EFRET pour le donateur dans le canal sélectionné précédent WS Alone (TmD) et à partir de l'échantillon de plante tachée (TmDA): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59925/59925equ03.jpg">
</li>
	<li>Comparez les valeurs sFLIM et EFRET entre le WS et l'échantillon.<ol>
<li>Considérez unFret e positif associé à une diminution homogène de la durée de vie entre WS et l'échantillon à analyser comme un événement FRET (voir les résultats représentatifs et les travaux de Spriet et coll.12 et Terryn etal. 10 pour plus de détails).</li>
		<li>Considérez une diminution de la durée de vie distribuée différemment pour être due à un mélange de FRET et de niveau de compactage de lignine et n'interprétez pas comme interactions moléculaires.</li>
		<li>Considérer aucune modification à vie comme une absence de signal FRET mesurable, mais pas comme un manque d'interaction avec la lignine</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Inouye, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+deconstruction+of+molecular+architecture+in+corn+stover.">Multiscale deconstruction of molecular architecture in corn stover.</a> Scientific Reports. 4, 3756 (2014).</li><li>Li, X., Zheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin-enzyme+interaction:+Mechanism,+mitigation+approach,+modeling,+and+research+prospects.">Lignin-enzyme interaction: Mechanism, mitigation approach, modeling, and research prospects.</a> Biotechnology Advances. 35 (4), 466-489 (2017).</li><li>Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+aspects+of+the+grass+cell+wall.">Unique aspects of the grass cell wall.</a> Current Opinion in Plant Biology. 11 (3), 301-307 (2008).</li><li>Lynd, L. 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Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les mesures de la durée de vie de la fluorescence et du spectre d'émission permettent de combiner les avantages des deux méthodes. En effet, les mesures spectrales manquent à elles seules de sensibilité et restent qualitatives. D'autre part, la durée de vie de fluorescence est la méthode de choix pour les mesures quantitatives traditionnelles fret, mais il a été démontré que l'autofluorescence de lignine pourrait varier en fonction de la composition de lignine et de l'environnement16. Ainsi, les interactions de lignine avec un accepteur ou des changements structurels de lignine ne peuvent pas être discriminées puisqu'elles ont toutes deux comme conséquence une diminution de vie. Comme nous l'avons démontré, la méthode développée fournit une mesure claire, sensible et quantitative des interactions entre les molécules de lignine et d'accepteur dans les sections végétales. Même si les différentes étapes de la méthode ont été rigoureusement optimisées, la prudence doit être particulièrement prise pour les points suivants.
En ce qui concerne les échantillons, la qualité de la section de l'usine est essentielle pour assurer l'imagerie en cours d'orientation. Les différentes étapes pour l'intégration PEG doivent être strictement suivies. L'étape finale de lavage est essentielle pour s'assurer qu'aucune interférence du PEG ne reste dans les échantillons. En outre, la concentration et le pH de tampon devraient être strictement identiques pour toutes les mesures puisque tout changement peut avoir un impact fort sur des propriétés de fluorescence.
La mesure à vie peut également être délicate. La durée de vie de fluorescence du donneur peut être instable, par exemple en raison d'une excitation élevée. Dans un tel cas, l'adage de la puissance laser et le zoom peut résoudre le problème. Une autre source bien connue d'artefacts dans les mesures du TCSPC est le carambolage des impulsions de photons. En effet, TCSPC ne peut pas mesurer la vitesse de deux photons émis entre les deux mêmes impulsions laser. Bien que les échantillons de plantes soient très structurés, la fluorescence n'est pas homogène et peut entraîner un effet de carambolage caché. Bien que le nombre de photons par seconde reste inférieur à la limite d'excitation de 1 %, il peut être plus élevé dans certaines zones d'échantillonnage. Pour s'assurer qu'il n'y a pas d'expériences de carambolage, il est possible de mesurer la durée de vie de la fluorescence du donneur à un flux de photons différent. Si la durée de vie augmente pendant que le flux diminue, un effet de carambolage modifie les mesures. Le flux optimal de photon est atteint avec la stabilité de vie du donateur.
En ce qui concerne l'analyse de la courbe de désintégration sFLIM, nous recommandons de s'appuyer sur chaque courbe individuelle pour s'assurer que le modèle décrit avec précision les mesures. Si ce n'est pas le cas, assurez-vous d'abord qu'aucun des artefacts mentionnés précédemment n'a corrompu les données. Ensuite, l'étape 2.1.4 fournit la fonction de réponse instrumentale (IRF) du système. Si IRF présente quelques anomalies, optimisez le chemin optique pour les minimiser. Un IRF mesuré pour l'ajustement pendant l'étape 6.2 peut également être utilisé. Enfin, les degrés de liberté du modèle d'ajustement peuvent être augmentés à une décomposition de trois exponentielles dans l'étape 6.2. Cependant, le nombre de photons requis pour la détermination de la vie et de la proportion est élevé et il est donc recommandé de ne les utiliser que pour atteindre une durée de vie moyenne plus stable à partir de l'étape 6.4. Des informations plus exhaustives sur la FLIM, sa caractérisation18, sFLIM et son application12 notamment à la lignine10, peuvent être trouvées dans la littérature.
Bien que difficile, la mesure fret dans les tissus végétaux à l'aide de l'autofluorescence indigène montre certains avantages. Par rapport aux mesures FRET effectuées sur des tissus vivants dans lesquels les études d'interaction entre les biomolécules nécessitent souvent le génie génétique pour exprimer des marqueurs fluorescents intrinsèques, tissus végétaux lignifiés comme ceux présentés ici, offrent naturel l'autofluorescence et les sondes fluorescentes extrinsèques peuvent être facilement ajoutées, ce qui permet d'économiser beaucoup de temps. Cependant, selon les espèces végétales analysées et sur d'éventuels pré-traitements effectués, l'autofluorescence est susceptible d'être modifiée, de sorte qu'elle doit être soigneusement caractérisée et le fluorophore utilisé comme sonde pourrait devoir être adapté.
La méthode sFLIM doit être appliquée aux sondes fluorescentes dépourvues d'activité catalytique (PEG et dextran). Dans le cadre de l'hydrolyse de lignocellulose végétale, des interactions des enzymes dans divers échantillons de biomasse pourraient être exécutées, ayant probablement pour résultat la détermination de l'impact de la localisation (cellules et tissus) sur la force d'interaction. La prochaine étape d'optimisation sera l'automatisation de l'étape d'analyse. En effet, avec suffisamment de données analysées, une procédure d'analyse basée sur l'apprentissage automatique pourrait être déployée pour l'analyse automatisée du phénotype, ce qui augmenterait son agrément au dépistage rapide de l'efficacité de l'enzyme-biomasse. En outre, sFLIM ne nécessite pas la fixation de l'échantillon et peut être facilement appliqué à des études dynamiques d'interaction enzyme-lignine. Une telle méthode unique est susceptible de guider la stratégie d'ingénierie des enzymes et le prétraitement de la biomasse afin d'optimiser la valorisation de la lignocellulose.

Hydrolysant la lignocellulose en sucres monomériques tels que le glucose nécessite des enzymes. Leur activité est connue pour être limitée par l'établissement d'interactions non spécifiques entre les enzymes et la lignine1,2, ce dernier étant un polymère hydrophobe et un constituant majeur de la lignocellulose3. Ainsi, la mesure quantitative de ces interactions directement à l'échelle cellulaire est un défi qui doit être abordé pour optimiser l'activité catalytique enzymatique et le prétraitement de la lignocellulose4.
La mesure du transfert d'énergie par résonance (FRET) est une méthode de choix pour mesurer l'interaction des biomolécules in situ. Ce transfert d'énergie non radiatif peut se produire entre un donneur et un fluorophore accepteur s'ils remplissent des conditions différentes. Le spectre des émissions des donateurs doit chevaucher, au moins partiellement, le spectre d'excitation des accepteurs. Le choix des fluorophores est donc crucial pour de telles expériences. Ensuite, l'efficacité du transfert diminue avec la sixième puissance de leur distance5 et ne se produit que si les deux molécules sont à proximité (généralement dans la gamme nanométrique). D'autres éventualités peuvent modifier l'efficacité du transfert, comme l'orientation dipole-dipole, mais sont atténuées si les fluorophores ont de la flexibilité.
FRET peut être mesurée par différentes techniques et des descriptions détaillées peuvent être trouvées dans la littérature6,7. En bref, les principales méthodes s'appuient sur : i) émission sensibilisée dans laquelle la variation de la fluorescence des émissions d'accepteurs est suivie et fournit principalement des résultats qualitatifs; ii) le photoblanchiment d'accepteur dans lequel la fluorescence d'émission de distributeur est mesurée avant et après le photoblanchiment d'accepteur (dans ce cas, des estimations plus précises de FRET peuvent être réalisées mais exigent la puissance laser forte appliquée aux échantillons fixes); iii) la mesure à vie qui diminue pour le donneur en présence de l'accepteur. Cette méthode nécessite des instruments spécifiques et permet des mesures d'interaction précises et sensibles entre les fluorophores. Compte tenu de la mesure FRET entre les sondes fluorescentes et la lignocellulose, la principale difficulté est que la lignocellulose n'est pas un seul fluorophore bien caractérisé: il a une forte autofluorescence indigène et à l'échelle spectrally, principalement provenant de lignine, et dépendant de l'espèce de biomasse8,9.
Dans cet article, nous proposons une procédure nouvelle et originale adaptée à des sections d'échantillons de bois/plantes. Cette méthode basée sur sFLIM ouvre la voie à des mesures quantitatives fret entre les sondes fluorescentes et la lignine dans les échantillons de lignocellulose indigène.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 710 NLO</td>
			<td>for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to collect sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high precision microscope cover glasses 170+/-5&#181;m n&#176;1,5#</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0107032</td>
			<td>saled by Dutscher s.a in France</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infra-red pulsed laser</td>
			<td>COHERENT</td>
			<td>CHAMELEON VISION</td>
			<td>For sample excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Research Plus monocanal 20-200&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with corresponding tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Research Plus monocanal 2-20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with corresponding tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LR45D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome blades disposable (pack of 50)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T5024</td>
			<td>saled by Oxford Instruments in France</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-Rhodamine, 10 kDa</td>
			<td>Creative Peg Works</td>
			<td>PSB-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-Rhodamine, 20 kDa</td>
			<td>Creative Peg Works</td>
			<td>PSB-22642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-Rhodamine, 5 kDa</td>
			<td>Creative Peg Works</td>
			<td>PSB-2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter five easy plus</td>
			<td>Mettler toledo</td>
			<td>FEP20</td>
			<td>with electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450</td>
			<td>Merck (sigma-Aldrich)</td>
			<td>P5402-1kg</td>
			<td>for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T586</td>
			<td>for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary microtome</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>HM 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sFLim detector</td>
			<td>BECKER-HICKL</td>
			<td>SPC 150</td>
			<td>for lifetime acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O</td>
			<td>Merck (sigma-Aldrich)</td>
			<td>71500</td>
			<td>for buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O</td>
			<td>Merck (sigma-Aldrich)</td>
			<td>30435-1kg</td>
			<td>for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da</td>
			<td>Merck (sigma-Aldrich)</td>
			<td>R8881-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring interactions between fluorescent probes and lignin in plant sections by sflim based on native autofluorescence

Dans la biomasse lignocellulosique (LB), l'activité des enzymes est limitée par l'apparition d'interactions non spécifiques avec la lignine pendant le processus d'hydrolyse, qui maintient les enzymes loin de leur substrat. La caractérisation de ces interactions complexes est donc un défi dans des substrats complexes tels que lb. La méthode mesure ici les interactions moléculaires entre les molécules étiquetées au fluorophore et la lignine autofluorescente indigène, qui seront révélées par le transfert d'énergie de résonance de La Rster (FRET). Contrairement aux mesures FRET dans les cellules vivantes utilisant deux fluorophores exogènes, les mesures FRET chez les plantes utilisant la lignine ne sont pas négligeables en raison de son autofluorescence complexe. Nous avons développé un pipeline d'acquisition et d'analyse original avec l'observation corrélée de deux propriétés complémentaires de fluorescence : l'émission de fluorescence et la durée de vie. sFLIM (microscopie d'imagerie à vie spectrale et fluorescente) fournit la quantification de ces interactions avec une sensibilité élevée, révélant différents niveaux d'interaction entre les biomolécules et la lignine.

Pour démontrer la capacité de disséquer les interactions moléculaires entre la lignine et les molécules étiquetées fluorescentes, nous avons d'abord utilisé trois échantillons différents(figure 3): paille de blé indigène (WS), paille de blé indigène incubée avec PEG marqué avec de la rhodamine (PR10), et paille de blé indigène avec dextran marqué avec de la rhodamine (DR10). PR10 est connu pour interagir avec la lignine tandis que DR10 est censé être inerte13,14,15. les courbes sFLIM(figure 3, en haut) montrent quelques modifications qui peuvent être obtenues entre l'échantillon de référence (WS) et deux cas d'interaction (DR10 et PR10). En effet, on peut d'abord facilement remarquer l'augmentation de fluorescence dans les régions spectrales correspondant à la plage d'émission de rhodamine. L'observation attentive des trois courbes de désintégration du premier canal révèle également une inflexion plus forte pour LA DR10 que pour LE PR10. Après l'ajustement des courbes de désintégration du photon et le calcul de chaque canal moyenne fluorescence durée de vie, la signature FRET devient plus évident (Figure 3, en bas). En effet, alors que la durée de vie de la fluorescence augmente et diminue alternativement le long du spectre de fluorescence pour l'échantillon WS, une signature FRET claire est observée pour les deux PR10 et DR10 avec: 1) une valeur constante à vie dans le canal d'émission donateur seulement (3 premiers canaux, en bleu); et 2) une durée de vie croissante de fluorescence dans le canal spectral correspondant à une contribution croissante du fluorophore donneur à vie élevé.
Une fois que fret sans ambiguïté a été déterminé, la comparaison de la durée de vie de la fluorescence de la lignine (canal 2) permet de quantifier la diminution de la durée de vie entre WS (0,47 ns), DR10 (0,42 ns) et PR10 (0,36 ns) et révèle ainsi des interactions moléculaires entre la lignine et PR10 et DR10 avec une affinité plus forte pour PR10.
Pour illustrer la pertinence de cette méthode pour quantifier différents niveaux d'interaction, nous choisissons trois autres échantillons, imitant l'accessibilité d'enzyme sur des échantillons de plantes traités : WS acid-traité (AWS), en combination avec PR de deux poids moléculaires contrastés de 5 kDa et 20 kDa (PR5 et PR20). Après une inspection minutieuse des signatures sFLIM, la durée de vie de la fluorescence de la lignine est extraite (Figure 4). Comme indiqué précédemment, la durée de vie de la fluorescence de la lignine peut être modifiée par son environnement16,17. Après traitement acide, les mesures de vie de fluorescence dans AWS (0.28 ns) devient plus bas que précédemment mesuré pour WS (0.47 ns), qui confirme l'exigence de la procédure sFLIM pour l'interprétation sans ambiguïté de la diminution de vie et la nécessité de contrôles négatifs pour chaque condition examinée. Comme prévu, une forte diminution de la durée de vie est observée lors de l'ajout de PR à l'AWS alors qu'il interagit avec la lignine. En outre, l'interaction est plus forte avec PR5 (0,14 ns) par rapport à PR20 (0,16 ns), ce qui est compatible avec leur mesure du rayon hydrodynamique (2,3 nm et 4,8 nm pour PR5 et PR20, respectivement), induisant différentes contraintes stéririques et donc une plus grande accessibilité de PR5 à la lignine.
Les deux expériences démontrent la pertinence de cette méthode pour évaluer finement les interactions de lignine avec les enzymes, en fonction de leur taille et sur les échantillons de plantes pré-traitement.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig01.jpg"> Figure 1 : Différentes étapes de préparation des échantillons. La paille de blé (WS) (A) est d'abord réduite en taille (B) pour être incorporée dans le milieu PEG (C). Le bloc est coupé à l'aide d'un microtome équipé de lames jetables (D). Après le lavage, les sections résultantes (E) sont placées pour l'incubation dans la solution PEG ou dextran tagged-rhodamine (F). Les sections étiquetées sont montées pour les mesures sFLIM (G). Les barres d'échelle sont de 2 cm (A), 1 cm (B et C), 200 m (E et G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig02.jpg"> Figure 2 : Flux de travail complet des mesures d'interactions spectrales basées sur FRET. La figure présente la configuration combinant l'intensité de fluorescence spectrale et les mesures de durée de vie. Les images de fluorescence spectrale sont acquises avec un microscope confocal, et les durées de vie de fluorescence séquentielle pour chaque gamme spectrale sont mesurées avec le détecteur sFLIM. L'analyse des courbes de désintégration du photon permet de déterminer avec précision les interactions entre l'échantillon et les molécules d'intérêt. Les calibrations doivent être traitées pour éviter les artefacts. Tout d'abord, le détecteur sFLIM doit être étalonné de façon spectrale et sa fonction de réponse instrumentale doit être vérifiée. Deuxièmement, le signal complexe d'autofluorescence doit être calibré avec précision pour chaque échantillon afin de déterminer la durée de vie de la fluorescence dans chaque canal avant l'ajout d'une molécule d'accepteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig03.jpg"> Figure 3 : Mesures sFLIM représentatives. les courbes sFLIM (panneau supérieur) ont été acquises sur la paille de blé indigène (WS), WS incubé avec PEG marqué avec de la rhodamine (WS-PEG) et de la paille de blé indigène avec dextran marqué avec de la rhodamine (WS-DEX). Pour chaque échantillon, les courbes sFLIM ont été équipées d'un modèle de désintégration bi-exponentielle et la durée de vie moyenne de la fluorescence a été calculée pour chaque canal (panneau inférieur). Les échantillons de WS-PEG et de WS-DEX présentent une diminution de la durée de vie de fluorescence dans le canal correspondant à l'autofluorescence seulement (trois premières barres) associée à une augmentation à vie du canal correspondant à une émission mixte d'autofluorescence et de rhodamine. Ce comportement est caractéristique d'un événement FRET entre la lignine et les molécules taguées de rhodamine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse à vie de fluorescence du canal correspondant à l'autofluorescence de lignine. Après validation d'un événement FRET basé sur la signature sFLIM, la durée de vie moyenne de fluorescence a été mesurée sur WS acid-traité (AWS), en combination avec PR5 ou PR20 (5 kDa et 20 kDa, respectivement). Tandis que les deux échantillons de PR présentent une diminution de vie, le plus petit est caractérisé par une réduction plus forte de vie, révélant une interaction moléculaire plus forte avec la lignine. La méthode est donc suffisamment sensible pour faire la distinction entre les deux (la valeur moyenne et l'erreur standard sont représentées, n 'gt;10 par condition). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Ce protocole décrit une configuration originale combinant des mesures spectrales et fluorescence à vie pour évaluer le transfert d'énergie de résonance (FRET) entre les sondes fluorescentes à base de rhodamine et le polymère de lignine directement dans d'épaisses sections végétales.

Mesurer les interactions entre les sondes fluorescentes et la lignine dans les sections végétales par sFLIM Basé sur l'autofluorescence indigène

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Dans la biomasse lignocellulosique, l’activité des enzymes analysant les polysaccharides est limitée par l’existence d’interactions non spécifiques avec la lignine. L’analyse fret est une approche pertinente pour l’évolution à l’échelle nanométrique. L’obtention de toutes les sections après peut être un défi selon la biomasse.Prenez votre temps à faire la section avec le microtome et effectuer des lavages doux. La collision des mesures fluorescentes de la durée de vie et du spectre permet une détermination quantitative sensible et sans ambiguïté du FRET entre les molécules de lignine et tag in situ. Cette méthode utilise des techniques délicates, comme la section d’échantillons sur l’acquisition et l’analyse de microscopie multidimensionnelle qui peuvent être faciles à apprendre avec une démonstration visuelle.Pour préparer des échantillons de plantes à partir de bois, de blé, de fibres ou de fragments, utilisez des lames de rasoir pour couper des échantillons d’un centimètre de long sans endommager la structure du matériau et placer les échantillons sous vide pour éliminer tout air. Submerger les échantillons pendant 24 heures en concentrations successives de 30 % et de 50 % de PEG diluées dans l’eau à température ambiante en remuant doucement. Suivi de 24 heures immergées dans une concentration de 100% de PEG à 70 degrés Celsius.Après l’immersion de 100 % PEG, placez les échantillons dans des capsules sur une plaque chauffante de 70 degrés Celsius et diminuez progressivement la température de la plaque par incréments de cinq degrés Celsius jusqu’à ce que la plaque atteigne la température ambiante. Lorsque les échantillons se sont refroidis, utilisez une microtome et des lames jetables pour obtenir soigneusement des sections plates de 30 à 60 micromètres d’épaisseur de chaque bloc PEG. Retirez le PEG des sections avec trois lavages d’eau doux de cinq minutes.Après le dernier lavage, incuber jusqu’à trois sections par tube avec 500 microlitres de sonde fluorescente fraîchement préparée pendant 72 heures à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation de coloration, utilisez une brosse pour transférer les sections sur une glissière avant de monter les sections entre une glissière en verre et un glissement de couvercle numéroté de 1,5 H. Pour déterminer la largeur spectrale de la fenêtre du détecteur sFLIM, placez les cristaux d’urée dans une boîte de culture avec un fond en verre de 0,17 micromètre et placez la boîte sur un porte-échantillon de microscope.Sélectionnez l’objectif 20X et un laser saphir dopé en titane avec une longueur d’onde de 900 nanomètres et une puissance de 2% et allumez la numérisation. Pour effectuer des mesures sFLIM, passez le système en mode sFLIM. Pour recueillir le deuxième signal harmonique sur le détecteur sFLIM, ajustez graduellement la longueur d’onde d’excitation laser de 900 à 980 nanomètres jusqu’à ce que le deuxième signal harmonique soit recueilli dans le deuxième canal spectral.Déterminez ensuite la longueur de la fenêtre spectrale. Passez au mode numérisé non D pour envoyer des photons fluorescents au détecteur sFLIM. Réglez l’acquisition sFLIM au mode Activer pour permettre au photon de compter sur le compteur photon unique.Lorsque l’instrument est prêt, placez une section de plante de paille de blé indigène de contrôle seule entre la glissière et le glissement de couverture sur le stade du microscope et réglez le système en mode continu pour permettre le balayage laser. Définissez une collection de 30 secondes et vérifiez que la fraction constante discriminante se situe entre une fois 10 à la quatrième et une fois de 10 à la sixième. Sélectionnez ensuite la zone de mesure sur l’échantillon et cliquez sur Démarrer.À la fin de la mesure, enregistrez le fichier sdt et répétez la mesure pour au moins neuf autres échantillons. Un équilibre doit être trouvé entre la réalisation d’un nombre suffisant de photons collectés pour le photon tout en évitant l’achat d’impulsions et les effets induits par la photo qui peuvent modifier la durée de vie de la florescence. Top analyser les données sFLIM acquises, importer la paille de blé indigène seul fichiers de données dans le logiciel de compteur photon unique et option ouverte et le mode pour sélectionner incomplète multi exponentielle 12,5 nanosecondes.Sous Options et Préférences, sélectionnez Calculer automatiquement la réponse instrumentale et sélectionnez le modèle To Exponential Fit. Pour chaque canal, appliquez le modèle d’ajustement et enregistrez les paramètres d’ajustement sur une feuille de calcul. Pour une comparaison entre les canaux et les expériences calculer la durée de vie principale de fluorescence dans une feuille de calcul.Pour calculer la durée de vie moyenne d’au moins 10 échantillons dans tous les canaux, analyser la durée de vie fluorescente principale sur les canaux donneurs afin de déterminer la valeur du canal dédié qui a choisi le nombre de photons le plus élevé et correspond à l’émission maximale de lignine. Pour comparer les valeurs du SFLIM et de l’EFRET entre l’échantillon de paille de blé indigène de contrôle et un échantillon expérimental, considérez un EFRET positif associé à une diminution homogène de la durée de vie entre le contrôle et les échantillons expérimentaux à analyser comme un événement FRET. Dans cette expérience représentative, les courbes sFLIM montrent certaines des modifications qui peuvent être réalisées entre l’échantillon de référence et les deux cas d’interaction.En effet, l’augmentation de la fluorescence dans les régions spectrales correspondant à la gamme d’émissions de rhodamine est facilement visualisée. L’observation attentive des trois premières courbes de désintégration des photons de canal révèle également une inflexion plus forte pour la paille de blé indigène avec de la dextrine étiquetée avec de la rhodamine, que pour la paille de blé indigène incubée avec du PEG marqué avec de la rhodamine. Après avoir ajusté les courbes de désintégration des photons et calculé la durée de vie principale de chaque canal de fluorescence, la signature FRET devient plus évidente.Par exemple, alors que la durée de vie de fluorescence augmente et diminue alternativement le long du spectre de fluorescence pour l’échantillon de paille de blé indigène, une signature fret claire est observée pour les deux sections indigènes de paille de blé incubées avec peg marqué avec de la rhodamine et de la paille de blé indigène avec de la dextrine étiquetée avec des échantillons de Rhodamine. Dans le contexte de l’hydrolyse de biomasse lignocellulosique, cette méthode peut facilement être transférée à des études d’interaction enzymatique dans divers échantillons de biomasse nécessitant une caractérisation rigoureuse de chaque nouvelle biomasse. Comme le SFLIM n’exige pas la fixation de l’échantillon, il ouvre la voie à des études dynamiques sur l’interaction de la lignine enzymatique et est susceptible de guider les stratégies d’ingénierie enzymatique et les pré-traitements de la biomasse.Comme la plupart du temps, les mesures du temps de vie nécessitent l’utilisation de sources laser infrarouges pulsantes. Les précautions de sécurité appropriées doivent être prises en conséquence.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

Simple-molécule Super-résolution Imaging de phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate dans la membrane plasmique avec nouveaux Fluorescent Probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Recherche

Biochimie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

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Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Combinaison d&#39;imagerie Raman et analyse multivariée pour visualiser la lignine, la cellulose et l&#39;hémicellulose dans le mur de cellules végétales

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