Name: measuring interactions between fluorescent probes and lignin in plant sections by sflim based on native autofluorescence
Uploaded: 2020-01-02T12:00:00
Duration: 7 s
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आंकड़ों की तैयारी के लिए फैनी लॉरेंट (किराया) का गर्मजोशी से शुक्रिया अदा किया जाता है । अनुसंधान महासंघ FRABio (लील विश्वविद्यालय, CNRS) तकनीकी इस काम को प्राप्त करने के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करने के लिए स्वीकार किया है । धन फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (LIGNOPROG परियोजना ANR-14-CE05-0026) से प्राप्त किया गया था ।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

कॉर्परेज़ फ्लोरेसेंस लाइफटाइम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम माप दोनों तरीकों के फायदे को मिलाने की अनुमति देता है। दरअसल, अकेले स्पेक्ट्रल माप न होने से संवेदनशीलता की कमी होती है और गुणात्मक बने रहते हैं । दूसरी ओर, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम पारंपरिक मात्रात्मक एफआरटी मापन के लिए पसंद की विधि है, लेकिन यह प्रदर्शित किया गया था कि लिग्निन ऑटोफ्लोरेसेंस लिग्निन संरचना और पर्यावरण16के आधार पर भिन्न हो सकता है। इस प्रकार, एक स्वीकारकर्ता या लिग्निन संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ लिग्निन बातचीत में भेदभाव नहीं किया जा सकता है क्योंकि वे दोनों जीवन भर कम हो जाते हैं। जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, विकसित विधि पौधों के वर्गों में लिग्निन और स्वीकारकर्ता अणुओं के बीच बातचीत की स्पष्ट, संवेदनशील और मात्रात्मक माप प्रदान करती है। यहां तक कि अगर विधि के विभिन्न चरणों को कड़ाई से अनुकूलित किया गया था, तो निम्नलिखित बिंदुओं के लिए विशेष रूप से सावधानी बरती जानी चाहिए।
नमूनों के बारे में, संयंत्र अनुभाग की गुणवत्ता में ध्यान केंद्रित इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है । खूंटी एम्बेडिंग के लिए अलग कदम कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। अंतिम वाशिंग कदम के नमूनों में शेष खूंटी से कोई हस्तक्षेप सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, बफर एकाग्रता और पीएच को सभी मापों के लिए कड़ाई से समान रखा जाना चाहिए क्योंकि किसी भी परिवर्तन का फ्लोरेसेंस गुणों पर मजबूत प्रभाव पड़ सकता है।
लाइफटाइम मेजरमेंट भी नाजुक हो सकता है। दाता के फ्लोरेसेंस जीवनकाल अस्थिर हो सकता है, उदाहरण के लिए एक उच्च उत्तेजना की वजह से । ऐसे में लेजर पावर और जूम ट्यूनिंग से इश्यू ठीक हो सकता है। टीसीएसपीसी मापन में कलाकृतियों का एक और प्रसिद्ध स्रोत फोटॉन पल्स पाइल-अप है। दरअसल, टीसीएसपीसी एक ही दो लेजर दालों के बीच उत्सर्जित दो फोटॉनों की गति को माप नहीं सकता है। जबकि पौधों के नमूने अत्यधिक संरचित होते हैं, फ्लोरेसेंस सजातीय नहीं होता है और एक छिपी हुई नाड़ी पाइअप प्रभाव का कारण बन सकता है। जबकि प्रति सेकंड फोटॉनों की संख्या 1% उत्तेजना सीमा से नीचे बनी हुई है, यह कुछ नमूना क्षेत्रों में अधिक हो सकती है। कोई pileup प्रयोगों को सुनिश्चित करने के लिए, एक अलग फोटॉन प्रवाह पर दाता फ्लोरेसेंस जीवनकाल को मापने पर विचार किया जा सकता है । यदि प्रवाह कम होने पर जीवनकाल बढ़ता है, तो एक पाइअप प्रभाव माप में फेरबदल कर रहा है। इष्टतम फोटॉन प्रवाह दाता के जीवनकाल स्थिरता के साथ पहुंच गया है।
sFLIM क्षय वक्र विश्लेषण के बारे में, हम यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक व्यक्तिवक्र फिट पर निर्भर करने की सलाह देते हैं कि मॉडल माप का सही वर्णन करता है। यदि यह मामला नहीं है, तो पहले यह सुनिश्चित करें कि पहले उल्लिखित कलाकृतियों में से किसी ने भी डेटा को भ्रष्ट नहीं किया है। फिर, चरण 2.1.4 सिस्टम का इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस फंक्शन (आईआरएफ) प्रदान करता है। यदि आईआरएफ कुछ विसंगतियों को प्रस्तुत करता है, तो उन्हें कम करने के लिए ऑप्टिकल पथ का अनुकूलन करें। चरण 6.2 के दौरान फिटिंग के लिए एक मापा आईआरएफ भी इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, स्वतंत्रता के फिटिंग मॉडल की डिग्री चरण ६.२ में एक तीन घातीय क्षय करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । हालांकि, व्यक्तिगत जीवनकाल और अनुपात निर्धारण के लिए आवश्यक फोटॉनों की संख्या अधिक है और इस प्रकार केवल चरण 6.4 से अधिक स्थिर औसत जीवनकाल प्राप्त करने के लिए उनका उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। FLIM पर अधिक संपूर्ण जानकारी, इसके लक्षण वर्णन18,sFLIM और उसके आवेदन12 विशेष रूप से लिग्निन10के लिए, साहित्य में पाया जा सकता है ।
हालांकि चुनौतीपूर्ण, देशी ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके पौधों के ऊतकों में FRET माप कुछ फायदे दिखाता है। जीवित ऊतकों पर किए गए FRET माप की तुलना में, जिसमें जैव अणुओं के बीच बातचीत अध्ययन अक्सर आंतरिक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता होती है, यहां प्रस्तुत लोगों के रूप में लिग्निफाइड पौधे के ऊतकों, प्राकृतिक प्रदान करते हैं ऑटोफ्लोरेसेंस, और बाह्य साथी फ्लोरोसेंट जांच आसानी से जोड़ा जा सकता है, जिससे अधिक समय की बचत होती है। हालांकि, विश्लेषण किए गए पौधों की प्रजातियों के आधार पर और किए गए संभावित पूर्व-उपचारों के आधार पर, ऑटोफ्लोरेसेंस को संशोधित किए जाने की संभावना है, ताकि इसे सावधानीपूर्वक विशेषता और फ्लोरोफोर की आवश्यकता हो क्योंकि जांच को अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
एसएफआईएम विधि उत्प्रेरक गतिविधि (खूंटी और dextran) की कमी फ्लोरोसेंट जांच के लिए लागू किया जाना चाहिए। पौधे लिग्नोसेल्यूलोस हाइड्रोलिसिस के फ्रेम में, विभिन्न बायोमास नमूनों में एंजाइमों की बातचीत की जा सकती है, संभवतः बातचीत की ताकत पर स्थानीयकरण (कोशिकाओं और ऊतकों) के प्रभाव का निर्धारण किया जा सकता है। अगला अनुकूलन कदम विश्लेषण चरण का स्वचालन होगा। दरअसल, पर्याप्त विश्लेषण डेटा के साथ, एक मशीन लर्निंग आधारित विश्लेषण प्रक्रिया स्वचालित फेनोटाइप विश्लेषण के लिए तैनात किया जा सकता है, जो तेजी से एंजाइम-बायोमास दक्षता स्क्रीनिंग के लिए अपनी amenability में वृद्धि होगी । इसके अलावा, एसएफआईआईम को नमूने के निर्धारण की आवश्यकता नहीं है और इसे आसानी से गतिशील एंजाइम-लिग्निन इंटरैक्शन अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है। इस तरह की अनूठी विधि से लिगनोसेल्यूलोस वीरता को अनुकूलित करने के लिए एंजाइम इंजीनियरिंग रणनीति और बायोमास प्री-ट्रीटमेंट का मार्गदर्शन करने की संभावना है।

ग्लूकोज जैसे मोनोमेरिक शर्करा में हाइड्रोलिजिंग लिग्नोसेल्यूलोज को एंजाइमों की आवश्यकता होती है। उनकी गतिविधि एंजाइमों और लिग्निन1,2के बीच गैर - विशिष्ट बातचीत की स्थापना से संयमित मानी जाती है , बाद में हाइड्रोफोबिक बहुलक और लिग्नोसेल्यूलोस3का एक प्रमुख घटक है । इस प्रकार, सेलुलर पैमाने पर सीधे इस तरह की बातचीत को मापने के लिए मात्रात्मक रूप से एक चुनौती है जिसे एंजाइम उत्प्रेरक गतिविधि और लिगनोसेल्यूलोज प्री-ट्रीटमेंट4को अनुकूलित करने के लिए संबोधित किया जाना चाहिए।
Förster (या फ्लोरेसेंस) अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) माप सीटू में गधे जैव अणुओं बातचीत के लिए पसंद की एक विधि है। यह गैर रेडिएटिव ऊर्जा हस्तांतरण एक दाता और एक स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर के बीच हो सकता है यदि वे विभिन्न शर्तों को पूरा करते हैं। दाता उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को कम से आंशिक रूप से, स्वीकारकर्ताओं को उत्तेजना स्पेक्ट्रम को ओवरलैप करना चाहिए । इस प्रकार इस तरह के प्रयोगों के लिए फ्लोरोफोरस का चुनाव महत्वपूर्ण है। फिर, स्थानांतरण दक्षता उनकी दूरी5 की छठी शक्ति के साथ कम हो जाती है और केवल तभी होती है जब दोनों अणु निकट आस में होते हैं (आमतौर पर नैनोमीटर रेंज में)। अन्य आकस्मिकता डाइपोल-डाइपोल ओरिएंटेशन जैसे हस्तांतरण दक्षता को बदल सकती है लेकिन अगर फ्लोरोफोरस में लचीलापन है तो इसे कम किया जाता है।
एफआरईटी को विभिन्न तकनीकों से मापा जा सकता है और विस्तृत विवरण साहित्य6,7में पाए जा सकते हैं । संक्षेप में, मुख्य विधियां भरोसा करती हैं: i) संवेदनशील उत्सर्जन जिसमें स्वीकार्य उत्सर्जन फ्लोरेसेंस में भिन्नता का पालन किया जाता है और मुख्य रूप से गुणात्मक परिणाम प्रदान करता है; ii) स्वीकारकर्ता फोटोब्लीचिंग जिसमें दाता उत्सर्जन फ्लोरेसेंस को स्वीकारकर्ता फोटोब्लीचिंग से पहले और बाद में मापा जाता है (इस मामले में, अधिक सटीक FRET अनुमान प्राप्त किए जा सकते हैं लेकिन निश्चित नमूनों पर लागू मजबूत लेजर शक्ति की आवश्यकता होती है); और iii) आजीवन माप जो स्वीकारकर्ता की उपस्थिति में दाता के लिए कम हो जाता है। इस विधि के लिए विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता होती है और फ्लोरोफोर्स के बीच सटीक और संवेदनशील बातचीत माप की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट जांच और लिग्नोसेल्यूलोज के बीच एफआरटी माप को ध्यान में रखते हुए, मुख्य कठिनाई यह है कि लिग्नोसेल्यूलोस एक अच्छी तरह से विशेषता फ्लोरोफोर नहीं है: इसमें एक मजबूत देशी और स्पेक्टरैली-व्यापी ऑटोफ्लोरेसेंस है, जो मुख्य रूप से लिग्निन से उत्पन्न होता है, और बायोमास प्रजातियों8,9पर निर्भर करता है।
इस पत्र में, हम लकड़ी/पौधों के नमूनों के वर्गों के अनुकूल एक नई और मूल प्रक्रिया का प्रस्ताव करते हैं । यह एसएफआईएम आधारित विधि देशी लिग्नोसेल्यूलोज नमूनों में फ्लोरोसेंट जांच और लिग्निन के बीच मात्रात्मक एफआरटी मापन का रास्ता खोलती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>LSM 710 NLO</td>
			<td>for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>to collect sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for incubations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high precision microscope cover glasses 170+/-5&#181;m n&#176;1,5#</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0107032</td>
			<td>saled by Dutscher s.a in France</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infra-red pulsed laser</td>
			<td>COHERENT</td>
			<td>CHAMELEON VISION</td>
			<td>For sample excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Research Plus monocanal 20-200&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with corresponding tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Research Plus monocanal 2-20&#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>with corresponding tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides ca. 76 x 26 mm ground edges frosted end</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LR45D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtome blades disposable (pack of 50)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T5024</td>
			<td>saled by Oxford Instruments in France</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-Rhodamine, 10 kDa</td>
			<td>Creative Peg Works</td>
			<td>PSB-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-Rhodamine, 20 kDa</td>
			<td>Creative Peg Works</td>
			<td>PSB-22642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG-Rhodamine, 5 kDa</td>
			<td>Creative Peg Works</td>
			<td>PSB-2264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter five easy plus</td>
			<td>Mettler toledo</td>
			<td>FEP20</td>
			<td>with electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly (ethylene Glycol) average mol wt 1450</td>
			<td>Merck (sigma-Aldrich)</td>
			<td>P5402-1kg</td>
			<td>for sample embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>razor blades, single edges blades, stainless steel, box of 100</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T586</td>
			<td>for fragments preparation saled by Oxford Instruments in France</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary microtome</td>
			<td>Microm Microtech</td>
			<td>HM 360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sFLim detector</td>
			<td>BECKER-HICKL</td>
			<td>SPC 150</td>
			<td>for lifetime acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH2PO4, 2H2O</td>
			<td>Merck (sigma-Aldrich)</td>
			<td>71500</td>
			<td>for buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate dibasic dihydrate Na2HPO4,2H2O</td>
			<td>Merck (sigma-Aldrich)</td>
			<td>30435-1kg</td>
			<td>for buffer solution, old reference, the new one is 71643-1kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetramethyl rhodamine isothiocyanate-dextran 10 k Da</td>
			<td>Merck (sigma-Aldrich)</td>
			<td>R8881-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring interactions between fluorescent probes and lignin in plant sections by sflim based on native autofluorescence

लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास (एलबी) में, एंजाइमों की गतिविधि हाइड्रोलिसिस प्रक्रिया के दौरान लिग्निन के साथ गैर-विशिष्ट बातचीत की उपस्थिति से सीमित होती है, जो एंजाइमों को उनके सब्सट्रेट से दूर रखता है। इन जटिल बातचीत का लक्षण वर्णन इस प्रकार पौंड जैसे जटिल सब्सट्रेट्स में एक चुनौती है। यहां विधि फ्लोरोफोर-टैग किए गए अणुओं और देशी ऑटोफ्लोरोसेंट लिग्निन के बीच आणविक बातचीत को मापता है, जो Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) द्वारा प्रकट किया जाएगा। दो एक्सोजेनस फ्लोरोफोरस का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में एफआरआई माप के विपरीत, लिग्निन का उपयोग करके पौधों में एफआरआई माप इसके जटिल ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण तुच्छ नहीं है। फ्लोरेसेंस उत्सर्जन और जीवनकाल: हमने फ्लोरेसेंस के दो पूरक गुणों के सहसंबद्ध अवलोकन के साथ एक मूल अधिग्रहण और विश्लेषण पाइपलाइन विकसित की है। एसएफआईआईम (स्पेक्ट्रल और फ्लोरोसेंट लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) उच्च संवेदनशीलता के साथ इन बातचीत की मात्रा प्रदान करता है, जिससे बायोमॉलिक्यूल्स और लिग्निन के बीच विभिन्न इंटरैक्शन स्तरों का खुलासा होता है।

लिग्निन और फ्लोरोसेंटी टैग किए गए अणुओं के बीच आणविक बातचीत को विच्छेदन करने के लिए sFLIM क्षमता प्रदर्शित करने के लिए, हमने पहले तीन अलग-अलग नमूनों का उपयोग किया(चित्रा 3):देशी गेहूं भूसे (WS), देशी गेहूं के भूसे को रोडामिन (PR10) के साथ टैग किए गए खूंटी के साथ इनक्यूबेटकिया गया, और रोडामिन (DR10) के साथ टैग किए गए dextran के साथ देशी गेहूं भूसे। PR10 को लिग्निन के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है जबकि DR10 को निष्क्रिय13,14,15माना जाता है । sFLIM घटता(चित्रा 3,शीर्ष) कुछ संशोधनों कि संदर्भ नमूना (WS) और दो बातचीत के मामलों (DR10 और PR10) के बीच प्राप्त किया जा सकता है दिखाते हैं । दरअसल, एक पहले आसानी से रोडामिन उत्सर्जन रेंज के अनुरूप स्पेक्ट्रल क्षेत्रों में फ्लोरेसेंस वृद्धि नोटिस कर सकते हैं । तीन पहले चैनल फोटॉन क्षय घटता के सावधान अवलोकन भी PR10 के लिए की तुलना में DR10 के लिए एक मजबूत मोड़ से पता चलता है । फोटॉन क्षय घटता फिटिंग और प्रत्येक चैनल की गणना के बाद फ्लोरेसेंस जीवनकाल का मतलब है, FRET हस्ताक्षर अधिक स्पष्ट हो जाता है(चित्रा 3,नीचे) । दरअसल, जबकि फ्लोरेसेंस लाइफटाइम वैकल्पिक रूप से डब्ल्यूएस नमूने के लिए फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम के साथ बढ़ता और घटता है, एक स्पष्ट FRET हस्ताक्षर दोनों PR10 और DR10 के साथ के लिए मनाया जाता है: 1) दाता में एक निरंतर जीवन भर का मूल्य केवल उत्सर्जन चैनल (3 पहले चैनल, नीले रंग में); और 2) उच्च आजीवन दाता फ्लोरोफोर के बढ़ते योगदान के अनुरूप स्पेक्ट्रल चैनल में एक बढ़ती फ्लोरेसेंस जीवनकाल।
एक बार स्पष्ट FRET निर्धारित किया गया है, लिग्निन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम (चैनल 2) की तुलना WS (०.४७ ns), DR10 (०.४२ ns) और PR10 (०.३६ ns) के बीच आजीवन कमी की मात्रा की अनुमति देता है और इस तरह, लिग्निन और के बीच आणविक बातचीत का पता चलता है PR10 के लिए एक मजबूत आत्मीयता के साथ PR10 और DR10 दोनों।
विभिन्न बातचीत के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस विधि की प्रासंगिकता को समझाने के लिए, हम तीन अन्य नमूनों का चयन करते हैं, इलाज संयंत्र के नमूनों पर एंजाइम पहुंच की नकल करते हैं: एसिड-इलाज डब्ल्यूएस (एडब्ल्यूएस), 5 केडीए और 20 केडीए (पीआर 5 और पीआर20) के दो विपरीत आणविक वजन के पीआर के संयोजन में। sFLIM हस्ताक्षर के सावधानीपूर्वक निरीक्षण के बाद, लिग्निन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम निकाला जाता है(चित्रा 4)। जैसा कि पहले कहा गया है, लिग्निन फ्लोरेसेंस जीवनकाल को इसके पर्यावरण16,17से बदला जा सकता है। एसिड उपचार के बाद, एडब्ल्यूएस (0.28 एनएस) में फ्लोरेसेंस आजीवन उपाय डब्ल्यूएस (0.47 एनएस) के लिए पहले से मापा जाता है, जो आजीवन कमी की स्पष्ट व्याख्या के लिए एसएफआईएम प्रक्रिया की आवश्यकता और प्रत्येक परीक्षण स्थिति के लिए नकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता की पुष्टि करता है। जैसा कि उम्मीद थी, एडब्ल्यूएस में पीआर जोड़ते समय एक मजबूत जीवनकाल में कमी देखी जाती है, जबकि यह लिग्निन के साथ बातचीत करता है। इसके अलावा, बातचीत PR20 (0.16 ns) की तुलना में PR5 (0.14 एनएस) के साथ मजबूत है, जो उनके हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या माप (2.3 एनएम और पीआर 5 और पीआर 20 के लिए 4.8 एनएम, क्रमशः, विभिन्न स्ट्रिक बाधाओं को प्रेरित करता है और इस प्रकार लिग्निन के लिए पीआर 5 की उच्च पहुंच है।
दोनों प्रयोग एंजाइमों के साथ लिग्निन इंटरैक्शन का बारीक आकलन करने के लिए इस विधि की प्रासंगिकता को प्रदर्शित करते हैं, जो उनके आकार और पौधों के नमूनों पर पूर्व-उपचार पर निर्भर करता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig01.jpg"> चित्रा 1: नमूनों के विभिन्न तैयारी कदम। गेहूं के भूसे (डब्ल्यूएस)(ए)को पहले आकार(बी)में कम किया जाता है जो खूंटी माध्यम(सी)में एम्बेडेड होता है । ब्लॉक डिस्पोजेबल ब्लेड(डी)से लैस माइक्रोटोम का उपयोग करके काटा जाता है। धोने के बाद, परिणामस्वरूप वर्गों(ई)खूंटी या dextran टैग-rhodamine समाधान(एफ)में ऊष्मायन के लिए रखा जाता है । लेबल किए गए अनुभागों को एसएफलिम मापन(जी)के लिए रखा गया है। स्केल बार 2 सेमी(ए),1 सेमी(बी और सी),200 माइक्रोन(ई और जी)हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig02.jpg"> चित्रा 2: स्पेक्ट्रल FRET-आधारित इंटरैक्शन माप न का पूरा कार्यप्रवाह। आंकड़ा स्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस तीव्रता और आजीवन माप के संयोजन सेटअप प्रस्तुत करता है । स्पेक्ट्रल फ्लोरेसेंस छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया जाता है, और प्रत्येक स्पेक्ट्रल रेंज के लिए क्रमिक रूप से फ्लोरेसेंस जीवनकाल को एसएफआईआईएन डिटेक्टर के साथ मापा जाता है। फोटॉन क्षय घटता का विश्लेषण नमूना और ब्याज के अणुओं के बीच बातचीत के सटीक निर्धारण की अनुमति देता है। कलाकृतियों से बचने के लिए कैलिब्रेशन पर कार्रवाई करनी होगी। सबसे पहले, एसएफआईएम डिटेक्टर को स्पेक्ट्रैली कैलिब्रेटेड करने की आवश्यकता है और इसके वाद्य प्रतिक्रिया समारोह की जांच की जानी चाहिए। दूसरा, एक स्वीकारकर्ता अणु के अलावा से पहले प्रत्येक चैनल में फ्लोरेसेंस जीवनकाल निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए जटिल ऑटोफ्लोरेसेंस सिग्नल को ठीक से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig03.jpg"> चित्रा 3: प्रतिनिधि sFLIM माप। sFLIM घटता (शीर्ष पैनल) देशी गेहूं भूसे (WS) पर अधिग्रहीत किया गया, WS खूंटी के साथ टैग रोडामिन (WS + खूंटी) और देशी गेहूं भूसे के साथ रोडामिन (WS + DEX) के साथ टैग किया गया । प्रत्येक नमूने के लिए, sFLIM घटता एक द्वि-घातीय क्षय मॉडल के साथ फिट किया गया था और मतलब फ्लोरेसेंस जीवनकाल प्रत्येक चैनल (नीचे पैनल) के लिए गणना की गई थी । डब्ल्यूएस + खूंटी और डब्ल्यूएस + डेक्स नमूने ऑटोफ्लोरेसेंस और रोडामिन के मिश्रित उत्सर्जन के अनुरूप चैनल में आजीवन वृद्धि के साथ जुड़े केवल (तीन पहले बार) ऑटोफ्लोरेसेंस के अनुरूप चैनल में फ्लोरेसेंस जीवनकाल में कमी पेश करते हैं। यह व्यवहार लिग्निन और रोडामिन-टैग किए गए अणुओं के बीच एक एफआरटी घटना की विशेषता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59925/59925fig04.jpg"> चित्रा 4: लिग्निन ऑटोफ्लोरेसेंस के अनुरूप चैनल का फ्लोरेसेंस लाइफटाइम विश्लेषण। SFLIM हस्ताक्षर के आधार पर एक FRET घटना को मान्य करने के बाद, मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम एसिड-इलाज डब्ल्यूएस (एडब्ल्यूएस) पर मापा गया था, PR5 या PR20 (5 kDa और 20 केडीए, क्रमशः) के साथ संयोजन में । जबकि दोनों पीआर नमूने एक जीवन भर की कमी मौजूद है, छोटे एक मजबूत जीवन भर में कमी की विशेषता है, लिग्निन के साथ एक मजबूत आणविक बातचीत का खुलासा । विधि इस प्रकार दोनों के बीच भेदभाव करने के लिए काफी संवेदनशील है (मतलब मूल्य और मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, n>10 प्रति शर्त) । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59925/59925fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

यह प्रोटोकॉल एक मूल सेटअप का वर्णन करता है जो सीधे मोटी पौधे के वर्गों में रोडामिन-आधारित फ्लोरोसेंट जांच और लिगिन बहुलक के बीच Förster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) का मूल्यांकन करने के लिए स्पेक्ट्रल और फ्लोरेसेंस आजीवन मापन का संयोजन करता है।

देशी ऑटोफ्लोरेसेंस के आधार पर एसएफआईएम द्वारा संयंत्र अनुभागों में फ्लोरोसेंट जांच और लिग्निन के बीच बातचीत को मापना

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास में पॉलीसैकराइड्स का विश्लेषण करने वाले एंजाइमों की गतिविधि लिग्निन के साथ गैर-विशिष्ट बातचीत के अस्तित्व से सीमित है। FRET विश्लेषण नैनो पैमाने पर विकास के लिए एक प्रासंगिक दृष्टिकोण है। बायोमास के आधार पर सभी वर्गों को प्राप्त करना एक चुनौती हो सकती है।अपना समय माइक्रोटोम के साथ सेक्शनिंग कर लें और कोमल धोने का प्रदर्शन करें। फ्लोरोसेंट लाइफटाइम और स्पेक्ट्रम मापन का मिलान सीटू में लिग्निन और टैग अणुओं के बीच मात्रात्मक संवेदनशील और स्पष्ट FRET दृढ़ संकल्प की अनुमति देता है। यह विधि मुश्किल तकनीकों के उपयोग को नियोजित करती है, जैसे बहुआयामी माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण और विश्लेषण पर नमूना अनुभागन जो दृश्य प्रदर्शन के साथ सीखना आसान हो सकता है।लकड़ी, गेहूं, फाइबर, या टुकड़े से पौधे के नमूने तैयार करने के लिए सामग्री की संरचना को नुकसान पहुंचाए बिना एक सेंटीमीटर लंबे नमूनों को काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें और किसी भी हवा को हटाने के लिए नमूनों को वैक्यूम के नीचे रखें। लगातार 30% में 24 घंटे के लिए नमूनों को जलमग्न और खूंटी की ५०% सांद्रता कोमल सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर पानी में पतला । इसके बाद 24 घंटे खूंटी की १००% एकाग्रता में ७० डिग्री सेल्सियस पर जलमग्न हो गए ।100% खूंटी विसर्जन के बाद, कैप्सूल में नमूनों को 70 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर रखें और प्लेट के कमरे के तापमान तक पहुंचने तक पांच डिग्री सेल्सियस वेतन वृद्धि में प्लेट के तापमान को उत्तरोत्तर कम कर दें। जब नमूने ठंडा हो जाते हैं, तो प्रत्येक खूंटी ब्लॉक से फ्लैट 30 से 60 माइक्रोमीटर मोटी धाराओं को ध्यान से प्राप्त करने के लिए माइक्रोटोम और डिस्पोजेबल ब्लेड का उपयोग करें। तीन पांच मिनट कोमल पानी धोता के साथ वर्गों से खूंटी निकालें।अंतिम धोने के बाद, प्रकाश से संरक्षित 72 घंटे के लिए हौसले से तैयार फ्लोरोसेंट जांच के 500 माइक्रोलीटर के साथ प्रति ट्यूब तीन वर्गों तक इनक्यूबेट करें। धुंधला इनक्यूबेशन के अंत में, एक ग्लास स्लाइड और एक नंबर 1.5H कवर पर्ची के बीच वर्गों बढ़ते से पहले एक स्लाइड करने के लिए वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए एक ब्रश का उपयोग करें । एसएफलिम डिटेक्टर की स्पेक्ट्रल विंडो चौड़ाई निर्धारित करने के लिए, 0.17 माइक्रोमीटर ग्लास बॉटम के साथ एक संस्कृति बॉक्स में यूरिया क्रिस्टल रखें और बॉक्स को माइक्रोस्कोप नमूना धारक पर रखें।900 नैनोमीटर तरंगदैर्ध्य और 2% शक्ति के साथ 20X उद्देश्य और टाइटेनियम डॉप्ड नीलम लेजर का चयन करें और स्कैनिंग चालू करें। एसएफलिम माप करने के लिए, सिस्टम को एसएफलिम मोड पर स्विच करें। एसएफलिम डिटेक्टर पर दूसरा हार्मोनिक सिग्नल एकत्र करने के लिए, धीरे-धीरे लेजर उत्तेजन तरंगदैर्ध्य को 900 से 980 नैनोमीटर तक समायोजित करें जब तक कि दूसरा हार्मोनिक सिग्नल दूसरे स्पेक्ट्रल चैनल में एकत्र न हो जाए।फिर स्पेक्ट्रल विंडो की लंबाई निर्धारित करें। एसएफलिम डिटेक्टर को फ्लोरोसेंट फोटॉन भेजने के लिए नॉनडी स्कैन मोड पर स्विच करें। एकल फोटॉन काउंटर पर फोटॉन गिनती की अनुमति देने के लिए सक्षम मोड के लिए एसएफलिम अधिग्रहण सेट करें।जब साधन तैयार हो जाता है, तो स्लाइड और कवर स्लिप के बीच एक नियंत्रण देशी गेहूं स्ट्रॉ अकेले प्लांट सेक्शन को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें और लेजर स्कैन की अनुमति देने के लिए सिस्टम को निरंतर मोड में सेट करें। एक 30 दूसरी बार संग्रह सेट करें और जांच करें कि निरंतर अंश विवेचक एक बार 10 से चौथे और एक बार 10 से छठे के बीच है। इसके बाद सैंपल पर मेजरमेंट एरिया चुनें और स्टार्ट पर क्लिक करें।माप के अंत में, एसडीटी फ़ाइल को सहेजें और कम से कम नौ और नमूनों के लिए माप दोहराएं। फोटॉन के लिए पर्याप्त एकत्र फोटॉन प्राप्त करने के बीच एक संतुलन पाया जाना चाहिए, जबकि पल्स खरीदने से परहेज करते हुए और फोटो प्रेरित प्रभाव जो फ्लोरेसेंस जीवनकाल को बदल सकते हैं। शीर्ष अधिग्रहीत एसएफलिम डेटा का विश्लेषण करें, देशी गेहूं के भूसे को अकेले डेटा फाइलों को एकल फोटॉन काउंटर सॉफ्टवेयर में आयात करें और अधूरे मल्टी एक्सपोनेंरियल 12.5 नैनोसेकंड का चयन करने के लिए ओपन ऑप्शन और मोड करें।विकल्पों और वरीयताओं के तहत, इंस्ट्रूमेंटल रिस्पांस की गणना स्वचालित रूप से चुनें और टू एक्सपोनेंशियल फिट मॉडल का चयन करें। प्रत्येक चैनल के लिए, फिटिंग मॉडल लागू करें और फिट मापदंडों को स्प्रेडशीट पर सेव करें। चैनलों और प्रयोगों के बीच तुलना के लिए एक स्प्रेडशीट में मुख्य फ्लोरेसेंस लाइफटाइम की गणना करें।सभी चैनलों में कम से कम 10 नमूनों के लिए औसत जीवनकाल की गणना करने के लिए, समर्पित चैनल मूल्य निर्धारित करने के लिए दाता चैनलों पर मुख्य फ्लोरोसेंट जीवनकाल का विश्लेषण करें जिसने उच्चतम फोटॉन संख्या चुनी और लिग्निन अधिकतम उत्सर्जन से मेल खाती है। नियंत्रण देशी गेहूं भूसे के नमूने और एक प्रयोगात्मक नमूने के बीच SFLIM और EFRET मूल्यों की तुलना करने के लिए, नियंत्रण और प्रयोगात्मक नमूनों के बीच एक समरूप जीवन काल की कमी के साथ जुड़े एक सकारात्मक EFRET पर विचार करने के लिए एक FRET घटना के रूप में विश्लेषण किया जाएगा । इस प्रतिनिधि प्रयोग में, एसएफलिम घटता संदर्भ नमूने और दो इंटरैक्शन मामलों के बीच प्राप्त किए जा सकने वाले कुछ संशोधनों को दिखाता है।दरअसल, रोडामाइन उत्सर्जन रेंज के अनुरूप स्पेक्ट्रल क्षेत्रों में फ्लोरेसेंस वृद्धि आसानी से कल्पना की जाती है। तीन पहले चैनल फोटॉन क्षय घटता के सावधान अवलोकन, यह भी डेक्सट्रिन के साथ देशी गेहूं भूसे के लिए एक मजबूत मोड़ से पता चलता है रोडामाइन के साथ टैग, देशी गेहूं भूसे के लिए की तुलना में, खूंटी के साथ इनक्यूबेटेड रोडामाइन के साथ टैग किया । फोटॉन क्षय घटता फिटिंग और प्रत्येक चैनल मुख्य फ्लोरेसेंस जीवन समय की गणना के बाद, FRET हस्ताक्षर और अधिक स्पष्ट हो जाता है ।उदाहरण के लिए, जबकि फ्लोरेसेंस जीवन समय वैकल्पिक रूप से बढ़ जाता है और देशी गेहूं भूसे के नमूने के लिए फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम के साथ कम हो जाता है, एक स्पष्ट FRET हस्ताक्षर दोनों देशी गेहूं भूसे के साथ इनक्यूबेटेड खूंटी के साथ इनक्यूबेटेड वर्गों के लिए मनाया जाता है रोडामाइन नमूनों के साथ टैग डेक्सट्रिन के साथ टैग किया गया । लिग्नोसेल्यूलोसिक बायोमास हाइड्रोलिसिस के संदर्भ में, इस विधि को आसानी से विभिन्न बायोमास नमूनों में एंजाइम इंटरैक्शन अध्ययन में स्थानांतरित किया जा सकता है जिसमें प्रत्येक नए बायोमास के कठोर लक्षण वर्णन की आवश्यकता होती है। चूंकि एसएफलिम को नमूने के निर्धारण की आवश्यकता नहीं होती है, इसलिए यह गतिशील एंजाइम लिग्निन इंटरैक्शन अध्ययनों का मार्ग प्रशस्त करता है और एंजाइम इंजीनियरिंग रणनीतियों और बायोमास पूर्व-उपचारों का मार्गदर्शन करने की संभावना है।सबसे अधिक समय के रूप में, जीवन समय माप पल्स अवरक्त लेजर स्रोतों के उपयोग की आवश्यकता है। उचित सुरक्षा सावधानियों के अनुसार लिया जाना चाहिए ।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

उपन्यास फ्लोरोसेंट जांच के साथ प्लाज्मा झिल्ली में Phosphatidylinositol 4,5-बाइफोस्फेट की एकल अणु सुपर संकल्प इमेजिंग

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

प्लांट सेल की दीवार में लिग्निन, सेलूलोज़ और हेमिसलेलोस को विज़ुअलाइज़ करने के लिए रमन इमेजिंग और मल्टीवीयेट विश्लेषण का संयोजन

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

झिल्ली प्रोटीन के बीच डिटर्जेंट-संवेदनशील बातचीत का पता लगाने

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

विद्युत डिटेक्शन ऑफ ड्यूटेरियम काइनेटिक आइसोटोप प्रभाव में Extracellular इलेक्ट्रॉन परिवहन पर Shewanella oneidensis एमआर-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

नाभिक और Cytoskeleton के बीच यांत्रिक एकीकरण को मापने के लिए एक सीधा बल जांच

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ब्लू देशी जेल ट्रो द्वारा Thylakoid झिल्ली प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एनएमआर) और अतिसूक्ष्म Thermophoresis (MST) द्वारा गोलाकार और रेशा प्रोटीन की बातचीत को मापने

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...