Name: measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

ويشكر المؤلفون جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كوب على العمل والمناقشات القيمة، وديون وير على المساعدة الإدارية. مايكل كالوات مدعوم من مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث SRA-2019-702-Q-R. وقد أصبح هذا العمل ممكنا من خلال المعاهد القومية للصحة R37 DK34128 ومؤسسة ويلش منحة I1243 إلى ميلاني كوب. كما تم دعم الأجزاء الأولى من هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة FK100113 لمايكل كالوات.

1 - إعداد الكواشف والوسائط والمخازن المؤقتة (الجدول 1)
<ol><li>إعداد الوسائط الكاملة MIN6 في 500 مل من ارتفاع الجلوكوز (4.5 غرام / لتر) دولبيككو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) مع الإضافات التالية: 15٪ مصل جنين يوفي (FBS)، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستريبتوميسين، 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين، و 50 ?...

<ol>
	<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways.">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li><li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function.">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li><li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes.">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li><li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide.">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li><li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence.">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li><li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo.">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li><li>Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+and+methods+for+regulating+insulin+secretion.">Compounds and methods for regulating insulin secretion.</a> World patent. , (2018).</li><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells.">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).</li><li>Ohmiya, Y., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+composition+and+stabilizing+method+of+coelenterazine+solution+for+high-throughput+measurement+of+luciferase+activity.">Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes.">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li><li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose.">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li><li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification.">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular &amp; Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li><li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins.">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation.">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).</li><li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious.">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li><li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet.">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li><li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion.">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li><li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2++Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells.">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li><li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+&amp;#34;no-wash&amp;#34;+high-throughput+alternative+to+ELISA.">AlphaLISA immunoassay platform- the &amp;#34;no-wash&amp;#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li><li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion.">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles.">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).</li><li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion.">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li><li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release.">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li></ol>

نقدم هنا طريقة لتقييم استجابات إفراز الأنسولين المحفز للجلوكوز بسرعة من خلايا MIN6 β. للحصول على أفضل الردود في القياس من المهم أن البذور الخلايا MIN6 في الكثافة المناسبة والسماح لهم أن تصبح 85-95% confluent. وهذا يحسن الاستجابات الخلية β للجلوكوز بسبب تحسن اتصالات الخلية الخلوية والتزامن، والذي يح?...

الطريقة المعروضة هنا يسمح إفراز الأنسولين من خط خلية بيتا المعدلة وراثيا أن يتم فحصها بسرعة وبأسعار معقولة في شكل 96 لوحة جيدا. المفتاح لهذا البروتوكول هو نسخة معدلة من الأنسولين مع لوسيفيراز غوسيا بطبيعة الحال (GLuc, ~ 18 كدا) إدراجها (انظر الشكل1) في C-الببتيد لتوليد الأنسولين-غاوسيا (InsGLuc)1,2. البروتينات الأخرى الكبيرة، مثل GFP (~25 kDa)، تم إدخالها بنجاح في الببتيد C من الأنسولين وعرضت المعالجة المتوقعة بعد الترجمة من proinsulin-GFP إلى الأنسولين وGFP-C-الببتيد3،4. للكشف عن الشبهات في هذا البروتوكول، وقد تم CoLuc الأمثل للتعبير الثدييات واثنين من الطفرات قد أدخلت لتعزيز الحركية مثل توهج5،6. يمكن بسهولة اختبار تركيبات متعددة وتكرار من ظروف العلاج في شكل 96 جيدا لوحة ويمكن الحصول على نتائج إفراز مباشرة بعد التجربة.
وهناك ميزة رئيسية، كمالوحظ سابقا 2، هو انخفاض تكلفة هذا القياس إفراز القائم على لوسيفيراز (< 0.01 دولار/جيد) الذي يميزه عن التكاليف الأعلى نسبيا والجوانب التقنية للاختبارات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) ( > $2/well) ومتجانسة الوقت حل فلوري (HTRF) أو غيرها من Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) الأجسام المضادة القائمة (> $1/well) الاختبارات. بالمقارنة مع هذه الاختبارات القائمة على الأجسام المضادة، والتي تقيس تركيز الأنسولين من خلال الرجوع إلى منحنى قياسي، يقيس اختبار InsGLuc النشاط الإفرازي كمقارنة نسبية للسيطرة على الآبار على اللوحة. ولهذا السبب، تتطلب كل تجربة إدراج ضوابط مناسبة. وهذا التمييز هو مقايضة تسمح بإجراء قياسات سريعة وغير مكلفة. ومع ذلك، تم إثبات إفراز InsGLuc أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا مع إفراز الأنسولين كما يقاس ELISA1،2. وقد تم توسيع نطاق هذه التكنولوجيا لفحص عالية الإنتاجية1،2،7 ، وأدى إلى تحديد المغيرات الجديدة لإفراز الأنسولين بما في ذلك مثبط قناة البوتاسيوم بوابة الجهد7 فضلا عن مثبط المنتج الطبيعي من وظيفة الخلية بيتا، الكرومومايوسين A28. استخدام InsGLuc هو الأكثر ملاءمة للباحثين الذين يخططون لاختبار باستمرار العديد من ظروف العلاج المختلفة لتأثيرها على إفراز الأنسولين. في تجارب المتابعة من الضروري تكرار النتائج الرئيسية في خط الخلية بيتا الأبوية، وعلى النحو الأمثل في المورين أو الجزر البشرية، وقياس إفراز الأنسولين باستخدام فحص الأجسام المضادة القائمة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rIns-GLuc stable MIN6 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>4.5 g/L glucose media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum, heat-inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP 176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G418-10</td>
			<td>Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secretion assay reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RIA grade)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes, pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>15568414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional drugs for stimulation experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9035</td>
			<td>Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine (bitartrate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4375</td>
			<td>Stock solution: 5 mM in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (phorbol 12-myristate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Stock solution: 100 &#181;M in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guassia assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>G334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bromide</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44680-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44608-5000</td>
			<td>Stock solution: 0.5 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
			<td>Stock solution: 1 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1775922</td>
			<td>US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0505-250G</td>
			<td>US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (native)</td>
			<td>Nanolight / Prolume</td>
			<td>3035MG</td>
			<td>Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td>Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
			<td>A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 &#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4724</td>
			<td>An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel 200 &#181;L pipette</td>
			<td>Transferpette S 20-200 &#181;L</td>
			<td>2703710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate

إجراء الفحوصات المستندة إلى الأجسام المضادة لجمع الأنسولين المفرزة بعد العينة عادة ما يتطلب بضع ساعات إلى يوم من وقت الفحص ويمكن أن تكون مكلفة، اعتمادا على الفحص المحدد. فحوصات لوسيفيراز المفرزة تعجل النتائج وتخفض تكلفة التذوق لكل عينة بشكل كبير. هنا نقدم نهج غير المستخدمة نسبيا لقياس النشاط إفراز الأنسولين من خلايا البنكرياس بيتا باستخدام غوسيا لوسيفيراز إدراجها وراثيا داخل الببتيد C. أثناء المعالجة بروتيوليك من بروسولين, يتم استئصال الببتيد C الإفراج عن لوسيفيراز داخل الحويصلات إفراز الأنسولين حيث يتم تفرزه مع الأنسولين. يمكن الحصول على النتائج في غضون دقائق بعد جمع عينة بسبب سرعة الاختبارات لوسيفيراز. وهناك قيد من المقاييس هو أنه هو قياس نسبي لإفراز الأنسولين وليس كمية مطلقة. ومع ذلك، هذا البروتوكول هو اقتصادي، قابلة للتحجيم، ويمكن تنفيذها باستخدام معظم قارئات لوحة الإضاءة القياسية. تسهل الماصات التناظرية والرقمية متعددة القنوات خطوات متعددة من القياس. العديد من الاختلافات التجريبية المختلفة يمكن اختبارها في وقت واحد. بمجرد أن يتم تحديد مجموعة مركزة من الشروط، ينبغي قياس تركيزات الأنسولين مباشرة باستخدام الاختبارات المستندة إلى الأجسام المضادة مع منحنيات قياسية لتأكيد نتائج اختبار لوسيفيراز.

لقياس أداء الفحص تحت ظروف التحكم، يمكن الانتهاء من منحنى جرعة استجابة الجلوكوز بسيطة أو التحفيز باستخدام نموذج ديازوكسيد. في حالة الأولى، قبل الاحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في ظروف خالية من الجلوكوز تليها علاج ل1 ح مع زيادة تركيزات الجلوكوز ينبغي أن يؤدي إلى نشاط إفرازي قل?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء فحوصات لوسيفيراز سريعة منخفضة التكلفة في متوسطة الإنتاجية باستخدام غوسيا لوسيفيراز المرتبطة بالأنسولين كوكيل لإفراز الأنسولين من خلايا بيتا. يمكن إجراء الفحص مع معظم قارئات لوحة الانارة والماصات متعددة القنوات.

قياس إفراز الأنسولين النسبي باستخدام بديل لوسيفيراز المفرز

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

يصف هذا البروتوكول نهجًا سريعًا بديلًا لفرز إفراز الأنسولين من خطوط خلايا بيتا لتسريع اكتشاف الأدوية وتوصيفها. هذا النهج مفيد لأنه يمكن اختبار علاجات متعددة في وقت واحد ، والنتائج متوفرة مباشرة بعد التجربة ، وهذا الفحص أكثر بأسعار معقولة من غيرها. تطبيق هذه الطريقة نحو فحص لتعديلات جزيء صغيرة جديدة من إفراز الأنسولين قد تحدد مركبات الرصاص لعلاجات مرض السكري في المستقبل.زيادة المعرفة من وظيفة الخلية بيتا يمكن أن تسهم في فهم أكبر للبروتين أو إفراز العصبي بشكل عام. وقد أنشئت هذه المراسل إفراز الأنسولين للعمل في نظام العدين في خطوط خلايا بيتا الأخرى والجزر في الإنسان. وينبغي أن يكون هذا الفحص مباشرة جدا للأفراد على دراية بثقافة الخلية وتشغيل ماصات متعددة القنوات.قبل التخطيط لأي تجارب، تحقق من أن خطوط خلايا بيتا الأبوية أو المستقرة تستجيب بشكل صحيح للجلوكوز باستخدام الأنسولين ELISA. تبدأ من خلال إعداد كريبس رينجر Bicarbonate العازلة أو KRBH وgassia لوسيفيراز حل العمل وفقا لاتجاهات المخطوطة. يمكنك زراعة خلايا MIN6 في قارورة T75 باستخدام تقنيات ثقافة الخلايا القياسية.إعداد خلايا INSGLuc MIN6 للطلاء عن طريق غسل قارورة 1 من الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة مليلترين من التربسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا، أو حتى الخلايا تنفصل عن القارورة. تحديد تركيز الخلايا وتمييع الخلايا في وسائل الإعلام الكاملة إلى مليون خلية لكل ملليلتر، وهو ما يعادل 100،000 خلية لكل 100 ميكرولترات في كل بئر من 96 بئر.الخلايا ينبغي أن تكون التقاء بما فيه الكفاية للم مقايسة بعد ثلاثة إلى أربعة أيام. في يوم الفحص ، أعد ما يكفي من الجلوكوز مجانا KRBH للتجربة واقامة خزان. Decant المتوسطة من لوحة 96 جيدا عن طريق عكس بسرعة على بالوعة المختبر ومن ثم النشاف بحزم على كومة من المناشف الورقية لإزالة المتوسطة الزائدة.اغسل الطبق مرتين مع 100 ميكرولترات من الجلوكوز مجانا KRBH في كل بئر، وإذا كان أداء العلاجات المخدرات، إضافة الأدوية إلى KRBH وفقا لاتجاهات المخطوطة. ثم، إضافة 100 ميكرولترات من الجلوكوز KRBH الحرة إلى كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، وتخرق العازلة ولطخة لوحة على منشفة ورقية.إضافة 100 ميكرولترات من الجلوكوز KRBH الحرة في بئر لغسل أي خلفية المتراكمة ومن ثم decant لوحة. إضافة السيطرة والظروف المحفزة مع أو بدون العلاجات الدوائية في 100 ميكرولترس في البئر واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. من المهم تضمين عناصر تحكم أساسية ومحفزة على كل لوحة من أجل تحديد استجابة الخلايا في تجربة معينة.إذا كانت الخلايا قد فقدت استجابتها مع مرور الوقت، وإعادة استزراعها من مخزون النيتروجين السائل الطازج. جمع بعناية 50 ميكرولترات من السوبر باستخدام ماصة متعددة القنوات، ونقلها إلى لوحة 96 مُعَسَن أبيض مبهم، والحفاظ على العينة في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء حتى تصبح جاهزة لم مقايسة لوسيفراز. إعداد حل عمل الشاشية لوسيفراز من خلال الأنابيب الكمية المطلوبة من حل CTZ في العازلة جلوك المقايسة، مع الحرص على منع CTZ من الاحترار.استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة بسرعة محلول عمل GLuc إلى لوحة مع KRBH supernatants. إذا كان هناك أي قطرات على جانبي الآبار، تدور لفترة وجيزة لوحة في سطح الطاولة، سوينغ دلو الطرد المركزي. ثم وضع لوحة في قارئ لوحة وقراءة الإنارة مع وقت التكامل 0.1 ثانية.وقد تم اختبار هذا الفحص في ظل ظروف التحكم عن طريق قياس إفراز الأنسولين كاستجابة لزيادة تركيزات الجلوكوز. لوحظ القليل جدا من النشاط السري أقل من خمسة الجلوكوز ميليمولار, ويلاحظ زيادة إفراز فوق ثمانية ملليمتر. تظهر الخلايا استجابة إفرازية المتوقعة عندما تحدى مع نموذج الديازوكسيد.يمنع علاج الديازوكسي إفراز الأنسولين إذا لم يكن هناك كلوريد البوتاسيوم خارج الخلية. عندما كلوريد البوتاسيوم موجود، يمكن تضخيم إفراز مع إضافة مزيد من الجلوكوز. وقد ثبت أيضا أن الخلايا MIN6 InsGLuc تستجيب كما هو متوقع لإفراز مركبات تحوير مثل كلوريد البوتاسيوم, الديازوكسيد, PMA, وإبينفرين.بعد هذا الإجراء، ينبغي تأكيد النتائج الحرجة عن طريق تحليل KRBH supernatants في الأجسام المضادة القائمة ELISA أو HTRF المقايسات التي تسمح لتحديد تركيزات الأنسولين. وقد قامت مجموعة في المعهد العريض بالكثير من الأعمال الرائدة، مما مهد الطريق لي لاستخدام هذا الفحص بشكل متزايد في بحثي. العديد من المجموعات البحثية بما في ذلك لنا والمجموعة في برود، وتستخدم هذا النهج في جهود اكتشاف المخدرات في مجال مرض السكري.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

قياس إيماس في الخلايا العصبية عن طريق وصفها وزير الخارجية

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

قياس صلابة انحناء الخلايا البكتيرية باستخدام فخ البصرية

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

حقن الانسولين واستخراج الدملمف لقياس حساسية الانسولين في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

والفحص الكمية للأنسولين ، معربا عن الأسلاف لتشكيل مستعمرة

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

قياس إزفاء الببتيد في الحويصلات الكبيرة Unilamellar

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

رصد الخلية التي تتمتع بحكم ذاتي إيقاعات الساعة اليومية في التعبير الجيني باستخدام مراسلون ضوء بارد وسيفيراز

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

بنقل العدوى إلى خلايا RAW264.7 مع luciferase المراسل مراسل جين

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

رصد الباطنة شبكية الكالسيوم باستخدام<em&gt; Gaussia</em&gt; luciferase المراسل SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...