Name: measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

Forfatterne takker alle nuværende og tidligere medlemmer af Cobb laboratoriet for værdifulde arbejde og diskussioner, og Dionne ware for administrativ assistance. Michael Kalwat understøttes af en juvenil diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Dette arbejde blev gjort muligt gennem NIH R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til Melanie Cobb. Tidlige dele af dette arbejde blev også støttet af en NIH F32 DK100113 til Michael Kalwat.

1. klargøring af reagenser, medier og buffere (tabel 1)
<ol><li>Forbered MIN6 komplette medier i 500 mL høj glukose (4,5 g/L) Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med følgende tilsætningsstoffer: 15% føtalt kvægserum (FBS), 100 enheder/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 292 μg/mL L-glutamin og 50 μM β-mercaptoethanol. Bemærk: den stabile cellelinje i dette tilfælde vedligeholdes i 250 μg/mL G418 antibiotikum.</li>
	<li>Forbered Krebs-ringer bicarbonat buffer (KRBH) ved at lave en opløsning, d...

<ol>
	<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways.">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li><li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function.">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li><li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes.">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li><li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide.">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li><li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence.">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li><li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo.">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li><li>Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+and+methods+for+regulating+insulin+secretion.">Compounds and methods for regulating insulin secretion.</a> World patent. , (2018).</li><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells.">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).</li><li>Ohmiya, Y., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+composition+and+stabilizing+method+of+coelenterazine+solution+for+high-throughput+measurement+of+luciferase+activity.">Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes.">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li><li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose.">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li><li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification.">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular &amp; Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li><li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins.">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation.">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).</li><li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious.">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li><li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet.">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li><li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion.">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li><li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2++Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells.">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li><li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+&amp;#34;no-wash&amp;#34;+high-throughput+alternative+to+ELISA.">AlphaLISA immunoassay platform- the &amp;#34;no-wash&amp;#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li><li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion.">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles.">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).</li><li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion.">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li><li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release.">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li></ol>

Heri præsenterer vi en metode til hurtigt at vurdere glukose-stimuleret insulinsekretion svar fra MIN6 β celler. For de bedste svar i analysen er det vigtigt at frø MIN6 celler på den rette tæthed og give dem mulighed for at blive 85-95% konflydende. Dette forbedrer β celle responser på glukose på grund af forbedrede celle celle kontakter og synkronisering, som forekommer både i primære Holme17,18,19,<sup cl...

Den metode præsenteret her tillader insulinsekretion fra en genetisk modificeret beta cellelinje, der skal analyseres hurtigt og billigt i 96-brønd-plade format. Nøglen til denne protokol er en modificeret version af insulin med den naturligt udskillede gaussia luciferase (gluc, ~ 18 kDa) indsat (Se figur 1) ind i C-peptid til at generere insulin-gaussia (insgluc)1,2. Andre større proteiner, såsom gfp (~ 25 kDa), er med succes blevet indsat i C-peptid af insulin og udstillet den forventede post-translationel behandling fra proinsulin-gfp til insulin og gfp-C-peptid3,4. For analysen i denne protokol, er gluc blevet codon-optimeret til pattedyr udtryk og to mutationer er blevet indført for at forbedre glød-lignende kinetik5,6. Flere kombinationer og replikater af behandlingsbetingelser kan let testes i 96-brønd-plade format og sekretions resultaterne kan opnås umiddelbart efter forsøget.
En stor fordel, som tidligere nævnt2, er den lave pris på denne luciferase-baserede sekretion måling (< $0,01/Well), som adskiller det fra de relativt højere omkostninger og tekniske aspekter af enzym-linked immunosorbent analyser ( > $2/Well) og homogen tids-løst fluorescens (HTRF) eller anden Förster resonans energi Transfer (FRET)-baseret antistof (> $1/Well) assays. I sammenligning med disse antistof baserede assays, som måler koncentrationen af insulin ved at referere til en standardkurve, måler InsGLuc-analysen sekretorisk aktivitet som en relativ sammenligning for at kontrollere brønde på pladen. Derfor kræver ethvert eksperiment, at der medtages passende kontrol. Denne sondring er en byttehandel for at muliggøre hurtige og billige målinger. Insgluc-sekretionen er imidlertid påvist at være stærkt korreleret med insulinsekretion målt ved ELISA1,2. Denne teknologi er blevet skaleret til høj-gennemløb screening1,2,7 og har ført til identifikation af nye modulatorer af insulinsekretion, herunder en spændings-gated kalium kanal inhibitor7 samt en naturlig produkt hæmmer af β cellefunktion, chromomycin a28. Brugen af InsGLuc er mest velegnet til forskere, der planlægger at løbende teste mange forskellige behandlingsbetingelser for deres indvirkning på insulinsekretion. I opfølgende eksperimenter er det nødvendigt at gentage de vigtigste fund i en forældre β cellelinje, og optimalt i murine eller humane Holme, og måle insulinsekretion ved hjælp af en antistof-baseret assay.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rIns-GLuc stable MIN6 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>4.5 g/L glucose media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum, heat-inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP 176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G418-10</td>
			<td>Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secretion assay reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RIA grade)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes, pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>15568414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional drugs for stimulation experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9035</td>
			<td>Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine (bitartrate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4375</td>
			<td>Stock solution: 5 mM in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (phorbol 12-myristate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Stock solution: 100 &#181;M in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guassia assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>G334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bromide</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44680-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44608-5000</td>
			<td>Stock solution: 0.5 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
			<td>Stock solution: 1 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1775922</td>
			<td>US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0505-250G</td>
			<td>US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (native)</td>
			<td>Nanolight / Prolume</td>
			<td>3035MG</td>
			<td>Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td>Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
			<td>A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 &#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4724</td>
			<td>An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel 200 &#181;L pipette</td>
			<td>Transferpette S 20-200 &#181;L</td>
			<td>2703710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate

Udførelse af antistof baserede analyser for udskilt insulin post-prøve samling kræver normalt et par timer til en dag af assay tid og kan være dyrt, afhængigt af den specifikke analyse. Udskilles luciferase analyser fremskynde resultater og sænke assay cost per prøve betydeligt. Her præsenterer vi en relativt underudnyttet tilgang til at måle insulin sekretoriske aktivitet fra bugspytkirtel β celler ved hjælp af Gaussia luciferase genetisk indsat i C-peptid. Under proteolytisk behandling af proinsulin, er C-peptid exciteret frigive luciferase i insulin sekretorisk vesikel, hvor det er co-udskilles med insulin. Resultaterne kan opnås inden for få minutter efterprøve udtagning på grund af hastigheden af luciferase assays. En begrænsning af analysen er, at det er en relativ måling af insulinsekretion og ikke en absolut kvantitation. Men denne protokol er økonomisk, skalerbar, og kan udføres ved hjælp af de fleste standard luminescens plade læsere. Analoge og digitale multikanalpipetter letter flere trin i analysen. Mange forskellige eksperimentelle variationer kan testes samtidigt. Når en fokuseret sæt betingelser er besluttet, bør insulinkoncentrationer måles direkte ved hjælp af antistof-baserede analyser med standard kurver for at bekræfte luciferase assay resultater.

For at måle resultaterne af analysen under kontrolbetingelser, en simpel glukose dosis-respons kurve eller en stimulation ved hjælp af diazoxid paradigme kan fuldføres. I tilfælde af førstnævnte bør præ-inkuering af cellerne i 1 time i glukose frie tilstande efterfulgt af behandling i 1 time med stigende glukose koncentrationer resultere i meget lidt sekretions aktivitet ved og under 5 mM, mens øget sekretion observeres over 8 mM glucose (figur 2). S...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Denne protokol beskriver, hvordan man udfører hurtige lave omkostninger luciferase analyser på medium-gennemløb ved hjælp af en insulin-linked gaussia luciferase som en proxy for insulinsekretion fra beta celler. Analysen kan udføres med de fleste luminescens plade læsere og multikanalspipetter.

Måling af relativ insulin sekretion ved hjælp af en co-udskilt luciferase surrogat

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Denne protokol beskriver en alternativ hurtig tilgang til analyse af insulinsplyd fra betacellelinjer for at fremskynde opdagelse af lægemidler og karakterisering. Denne fremgangsmåde er nyttig, fordi flere behandlinger kan testes samtidigt, resultaterne er tilgængelige umiddelbart efter eksperimentet, og denne analyse er mere overkommelig end andre. Anvendelsen af denne metode til screening for nye små molekyle modulatorer af insulin sekretion kan identificere blyforbindelser for fremtidige diabetes behandlinger.Øget viden om betacellefunktion kan bidrage til større forståelse af protein eller neurotransmitter sekretion i almindelighed. Denne insulin sekretion reporter er blevet etableret til at arbejde i et lentiviralt system i andre betaceller linjer og i menneskelige øer. Denne analyse bør være meget ligetil til personer bekendt med celle kultur og drift multichannel pipetter.Før du planlægger forsøg, skal du kontrollere, at dine forældre- eller stabile betacellelinjer reagerer korrekt på glukose ved hjælp af en insulin-ELISA. Begynd med at forberede Krebs-Ringer Bicarbonat Buffer eller KRBH og gaussia luciferase arbejdsløsning i henhold til manuskriptet retninger. Dyrk MIN6 celler i T75 kolber ved hjælp af standard cellekultur teknikker.InsGLuc MIN6-cellerne klargørs til plettering ved at vaske en sammenløbet kolbe af celler to gange med PBS og tilsættes to milliliter trypsin. Inkuber cellerne ved 37 grader celsius i ca. fem minutter, eller indtil cellerne tager afstand fra kolben. Cellerne bestemmes og cellerne fortyndes i komplette medier til en million celler pr. milliliter, hvilket svarer til 100.000 celler pr. 100 mikroliter i hver brønd af en 96 brøndplade.Cellerne skal være tilstrækkeligt sammenløbet til analysen efter tre til fire dage. På analysedagen forberedes nok glukosefri KRBH til eksperimentet og oprettes et reservoir. Dekantere mediet fra 96 godt plade ved hurtigt at vende det over et laboratorium vask og derefter blotting fast på en stak papirhåndklæder til at fjerne overskydende medium.Vask pladen to gange med 100 mikroliter glukosefri KRBH per brønd, og hvis du udfører lægemiddelbehandlinger, skal du tilføje lægemidler til KRBH i henhold til manuskriptanvisningerne. Derefter tilsættes 100 mikroliter glukosefri KRBH til hver brønd og inkuberes ved 37 grader celsius i en time. Efter inkubationen dekanteres bufferen, og pladen afstudses på en køkkenrulle.Tilføj 100 mikroliter glukosefri KRBH pr. brønd for at vaske enhver akkumuleret baggrund væk og derefter dekantere pladen. Tilføj kontrol og stimulerende betingelser med eller uden lægemiddelbehandlinger ved 100 mikroliter pr. brønd og inkuber pladen ved 37 grader celsius i en time. Det er vigtigt at medtage basale og stimulerede kontroller på hver plade for at bestemme cellernes reaktionsevne i et givet eksperiment.Hvis cellerne har mistet deres respons over tid, rekultur dem fra en frisk flydende kvælstof bestand. Opsam omhyggeligt 50 mikroliter supernatant ved hjælp af en multikanalpipette, overfør den til en uigennemsigtig hvid 96 brøndanalyseplade, og hold prøven ved stuetemperatur på bænken, indtil den er klar til luciferase-analysen. Forbered gaussia luciferase assay arbejdsopløsning ved pipettering den nødvendige mængde CTZ løsning i GLuc assay buffer, idet du skal passe på at forhindre CTZ fra opvarmning.Brug en multikanalpipette til hurtigt at tilsætte GLuc-analyseopløsningen til pladen med KRBH-supernatanterne. Hvis der er dråber på siderne af brøndene, drej kort pladen i en bordplade, svingspand centrifuge. Sæt derefter pladen i pladelæseren og læs luminescensen med en integrationstid på 0,1 sekunder.Denne analyse er blevet testet under kontrolbetingelser ved at måle insulins sekretion som en reaktion på stigende glukosekoncentrationer. Meget lidt sekretorisk aktivitet er observeret under fem millimolar glukose, og øget sekretion er observeret over otte millimolar. Cellerne udviser den forventede sekretoriske reaktion, når udfordret med diazoxid paradigme.Diazoxidbehandling blokerer insulinsekretion, hvis der ikke er ekstracellulær kaliumchlorid. Når kaliumchlorid er til stede, kan sekretionen forstærkes med yderligere tilsætning af glukose. Det er også blevet påvist, at InsGLuc MIN6 celler reagerer som forventet til sekretion modulerende forbindelser såsom kaliumchlorid, diazoxid, PMA, og adrenalin.Efter denne procedure skal kritiske resultater bekræftes ved at analysere KRBH-supernatanter i antistofbaserede ELISA- eller HTRF-analyser, som gør det muligt at bestemme insulinkoncentrationerne. En masse banebrydende arbejde er blevet udført af en gruppe på Broad Institute, som banede vejen for mig til i stigende grad at bruge denne analyse i min forskning. Flere forskergrupper, herunder os og gruppen på Broad, bruger denne tilgang i drug discovery indsats inden for diabetes.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

En kvantitativ analyse til Insulin-udtrykkende kolonidannende stamceller

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Måling peptid translokation i store Unilamellar Vesikler

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Overvågning Cell-selvstændige døgnrytmen ur Rhythms of Gene Expression Brug Luciferase bioluminescens Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Funktionel Screening ved hjælp af en hjemmelavet Dual-glød Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfektion RAW264.7 Celler med en luciferasereportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Overvågning endoplasmatisk reticulum Calcium Homeostase Ved hjælp af en<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...