Name: measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

De auteurs bedanken alle huidige en voormalige leden van het Cobb Laboratory voor waardevolle werk en discussies, en Dionne ware voor administratieve bijstand. Michael Kalwat wordt ondersteund door een juveniele diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Dit werk werd mogelijk gemaakt door NIH R37 DK34128 en Welch Foundation Grant I1243 aan Melanie Cobb. De vroege delen van dit werk werden ook gesteund door een NIH F32 DK100113 aan Michael Kalwat.

1. bereiding van reagentia, media en buffers (tabel 1)
<ol><li>Bereid MIN6 complete media in 500 mL van hoge-glucose (4,5 g/L) Dulbecco gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met de volgende additieven: 15% foetale boviene serum (FBS), 100 eenheden/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, 292 μg/mL L-glutamine, en 50 μM β-mercaptoethanol. Nota: de stabiele cel lijn in dit geval wordt gehandhaafd in 250 µ g/mL van G418 antibioticum.</li>
	<li>Bereid Krebs-ring bicarbonaat buffer (KRBH) voor door een oplossing te mak...

<ol>
	<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways.">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li><li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function.">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li><li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes.">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li><li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide.">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li><li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence.">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li><li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo.">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li><li>Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+and+methods+for+regulating+insulin+secretion.">Compounds and methods for regulating insulin secretion.</a> World patent. , (2018).</li><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells.">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).</li><li>Ohmiya, Y., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+composition+and+stabilizing+method+of+coelenterazine+solution+for+high-throughput+measurement+of+luciferase+activity.">Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes.">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li><li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose.">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li><li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification.">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular &amp; Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li><li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins.">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation.">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).</li><li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious.">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li><li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet.">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li><li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion.">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li><li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2++Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells.">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li><li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+&amp;#34;no-wash&amp;#34;+high-throughput+alternative+to+ELISA.">AlphaLISA immunoassay platform- the &amp;#34;no-wash&amp;#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li><li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion.">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles.">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).</li><li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion.">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li><li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release.">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li></ol>

Hierin presenteren we een methode om snel te beoordelen glucose-gestimuleerd insuline secretie reacties van MIN6 β cellen. Voor de beste reacties in de assay is het belangrijk om de MIN6 cellen zaad op de juiste dichtheid en hen in staat stellen te worden 85-95% Confluent. Dit verbetert β cel reacties op glucose wegens betere cel-cel contacten en synchronisatie, die zowel in primaire eilandjes17, 18,19,<sup class="x...

De hier gepresenteerde methode maakt insuline secretie van een genetisch gemodificeerde Beta Cell line te worden getest snel en betaalbaar in 96-well-plate formaat. De sleutel tot dit protocol is een gewijzigde versie van insuline met de natuurlijk-afgescheiden Gaussia Luciferase (GLuc, ~ 18 kDa) ingevoegd ( Zie figuur 1) in het C-peptide te genereren insuline-Gaussia (InsGLuc)1,2. Andere grotere proteïnen, zoals GFP (~ 25 kDa), zijn met succes opgenomen in C-peptide van insuline en tentoongesteld de verwachte post-translationele verwerking van proinsuline-GFP aan insuline en GFP-C-peptide3,4. Voor de bepaling in dit protocol, GLuc is codon-geoptimaliseerd voor zoogdier expressie en twee mutaties zijn ingevoerd om te verbeteren Glow-like kinetica5,6. Meerdere combinaties en replicatie van de behandeling voorwaarden kunnen gemakkelijk worden getest in 96-goed-plaat formaat en de secretie resultaten kunnen onmiddellijk na het experiment worden verkregen.
Een groot voordeel, zoals eerder opgemerkt2, is de lage kosten van deze Luciferase-based secretie meting (< $0.01/well), die onderscheidt het van de relatief hogere kosten en technische aspecten van enzym-gebonden immunosorbent assays (Elisa) ( > $2/well) en homogene tijd-opgeloste fluorescentie (HTRF) of andere Förster resonantie energieoverdracht (FRET)-gebaseerd antilichaam (> $1/well) assays. In vergelijking met deze antilichaam-gebaseerde analyses, die de concentratie van insuline meten door naar een standaardkromme te verwijzen, meet de InsGLuc analyse secretoire activiteit als relatieve vergelijking aan controleputten op de plaat. Om die reden, elk experiment vereist de opneming van de juiste controles. Dit onderscheid is een trade-off om snelle en goedkope metingen mogelijk te maken. Echter, InsGLuc secretie is aangetoond dat sterk gecorreleerd met insuline secretie zoals gemeten door Elisa1,2. Deze technologie is opgeschaald voor high-throughput screening1,2,7 en heeft geleid tot de identificatie van nieuwe modulatoren van insuline secretie met inbegrip van een voltage-gated kaliumkanaal remmer7 evenals een natuurlijke product Inhibitor van β cel functie, Chromomycin a28. Het gebruik van InsGLuc is het meest geschikt voor onderzoekers die van plan zijn om voortdurend te testen veel verschillende behandelingsvoorwaarden voor hun impact op insuline secretie. In vervolgexperimenten is het noodzakelijk om zeer belangrijke bevindingen in een ouderlijke β cel lijn, en optimaal in muizen of menselijke eilandjes te herhalen, en insulineafscheiding te meten gebruikend een op antilichaam-gebaseerde analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rIns-GLuc stable MIN6 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>4.5 g/L glucose media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum, heat-inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP 176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G418-10</td>
			<td>Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secretion assay reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RIA grade)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes, pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>15568414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional drugs for stimulation experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9035</td>
			<td>Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine (bitartrate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4375</td>
			<td>Stock solution: 5 mM in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (phorbol 12-myristate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Stock solution: 100 &#181;M in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guassia assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>G334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bromide</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44680-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44608-5000</td>
			<td>Stock solution: 0.5 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
			<td>Stock solution: 1 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1775922</td>
			<td>US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0505-250G</td>
			<td>US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (native)</td>
			<td>Nanolight / Prolume</td>
			<td>3035MG</td>
			<td>Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td>Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
			<td>A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 &#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4724</td>
			<td>An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel 200 &#181;L pipette</td>
			<td>Transferpette S 20-200 &#181;L</td>
			<td>2703710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate

Het uitvoeren van antilichaam-gebaseerde analyses voor afgescheiden insuline post-sample collectie vereist meestal een paar uur tot een dag van de assay tijd en kan duur zijn, afhankelijk van de specifieke assay. De afgescheiden Luciferase analyses versnellen resultaten en verminderen wezenlijk de analyse kosten per steekproef. Hier presenteren we een relatief onderbenut benadering van insuline secretoire activiteit van de pancreas β cellen meten met behulp van Gaussia Luciferase genetisch ingevoegd binnen de C-peptide. Tijdens Proteolytische verwerking van proinsuline, het C-peptide is het vrijgeven van de Luciferase binnen de insuline secretoire blaasje waar het wordt co-afgescheiden met insuline. De resultaten kunnen binnen minuten na steekproef inzameling wegens de snelheid van Luciferase analyses worden verkregen. Een beperking van de assay is dat het een relatieve meting van de insuline secretie en niet een absolute kwantificatie. Echter, dit protocol is zuinig, schaalbaar, en kan worden uitgevoerd met behulp van de meeste standaard luminescentie plaat lezers. Analoge en digitale MultiChannel pipetten vergemakkelijken meerdere stappen van de assay. Veel verschillende experimentele variaties kunnen gelijktijdig worden getest. Zodra een geconcentreerde reeks voorwaarden wordt beslist op, zouden de insuline concentraties direct moeten worden gemeten gebruikend op antilichaam-gebaseerde analyses met standaard krommen om de Luciferase testresultaten te bevestigen.

Om de prestaties van de test onder controle omstandigheden te meten, kan een eenvoudige glucose dosis-reactiekromme of een stimulatie gebruikend het diazoxide paradigma worden voltooid. In het geval van de voormalige, pre-incubatie van de cellen voor 1 h in glucose-vrije omstandigheden, gevolgd door de behandeling voor 1 h met toenemende glucose concentraties moet leiden tot zeer weinig secretoire activiteit op en onder de 5 mM, terwijl de toegenomen secretie wordt waargenomen boven de 8 ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

In dit protocol wordt beschreven hoe u snelle Low-cost Luciferase-analyses uitvoeren bij medium-throughput met behulp van een insuline-linked Gaussia Luciferase als proxy voor insuline secretie van beta-cellen. De assay kan uitgevoerd worden met de meeste luminescentie plaat lezers en multichannel pipetten.

Meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden Luciferase surrogaat

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Dit protocol beschrijft een alternatieve snelle aanpak voor het testen van insulineafscheiding uit bètacellijnen om de ontdekking en karakterisering van geneesmiddelen te versnellen. Deze aanpak is handig omdat meerdere behandelingen tegelijkertijd kunnen worden getest, de resultaten zijn direct na het experiment beschikbaar en deze test is betaalbaarder dan andere. De toepassing van deze methode op screening voor nieuwe kleine molecuul modulatoren van insuline secretie kan identificeren loodverbindingen voor toekomstige diabetes therapieën.Verhoogde kennis van bètacelfunctie kan bijdragen aan een beter begrip van eiwit of neurotransmitter secretie in het algemeen. Deze insuline afscheiding verslaggever is opgericht om te werken in een lentiviral systeem in andere bètacellen lijnen en in menselijke eilandjes. Deze test moet zeer eenvoudig zijn voor individuen die bekend zijn met de celcultuur en het bedienen van multichannel pipetten.Controleer voordat u experimenten plant of uw ouderlijke of stabiele bètacellijnen correct reageren op glucose met behulp van een insuline-ELISA. Begin met het voorbereiden van Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer of KRBH en gaussia luciferase werkoplossing volgens de handschrift richtingen. Kweek MIN6 cellen in T75 kolven met behulp van standaard celkweektechnieken.Bereid de InsGLuc MIN6 cellen voor beplating door het wassen van een confluent fles cellen tweemaal met PBS en het toevoegen van twee milliliter trypsine. Incubeer de cellen op 37 graden celsius gedurende ongeveer vijf minuten, of totdat de cellen scheiden van de kolf. Bepaal de celconcentratie en verdun de cellen in volledige media tot een miljoen cellen per milliliter, wat neerkomt op 100.000 cellen per 100 microliter in elke put van een 96 putplaat.De cellen moeten voldoende samenvloeien voor de test na drie tot vier dagen. Bereid op de dag van de test voldoende glucosevrije KRBH voor het experiment en stel een reservoir op. Decanteer het medium van de 96 put plaat door het snel om te keren over een laboratorium gootsteen en vervolgens blotting stevig op een stapel papieren handdoeken om overtollig medium te verwijderen.Was de plaat twee keer met 100 microliters glucosevrije KRBH per put, en voeg bij het uitvoeren van medicamenteuze behandelingen medicijnen toe aan de KRBH volgens de handschriftaanwijzing. Voeg vervolgens 100 microliter glucosevrije KRBH toe aan elke put en broed gedurende een uur in op 37 graden Celsius. Na de incubatie decanteren de buffer en dep de plaat op een papieren handdoek.Voeg 100 microliter glucosevrije KRBH per put toe om een geaccumuleerde achtergrond weg te wassen en de plaat vervolgens te decanteren. Voeg controle en stimulerende omstandigheden met of zonder medicamenteuze behandelingen toe bij 100 microliter per put en broed de plaat een uur lang uit met 37 graden Celsius. Het is belangrijk om basale en gestimuleerde controles op elke plaat op te nemen om de responsiviteit van de cellen in een bepaald experiment te bepalen.Als de cellen hun reactie na verloop van tijd hebben verloren, herbouwen ze uit een verse vloeibare stikstofvoorraad. Verzamel voorzichtig 50 microliter supernatant met behulp van een multichannel pipet, breng het naar een ondoorzichtige witte 96 goed testplaat en houd het monster op kamertemperatuur op de bank tot ze klaar zijn voor de luciferase-test. Bereid de gaussia luciferase werkoplossing voor door de vereiste hoeveelheid CTZ-oplossing in de GLuc-testbuffer te spuiten, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de CTZ niet opwarmt.Gebruik een multichannel pipet om snel de GLuc test werkoplossing toe te voegen aan de plaat met de KRBH supernatants. Als er druppels aan de zijkanten van de putten, kort draai de plaat in een tafelblad, swing emmer centrifuge. Zet vervolgens de plaat in de plaatlezer en lees de luminescentie met een integratietijd van 0,1 seconde.Deze test is getest onder controleomstandigheden door het meten van insuline secretie als een reactie op de toenemende glucoseconcentraties. Zeer weinig secretoire activiteit wordt waargenomen onder vijf millimolar glucose, en verhoogde afscheiding wordt waargenomen boven acht millimolar. De cellen vertonen de verwachte secretoire reactie wanneer uitgedaagd met de diazoxide paradigma.Diazoxide behandeling blokkeert insuline afscheiding als er geen extracellulaire kaliumchloride. Wanneer kaliumchloride aanwezig is, kan de afscheiding worden versterkt met verdere toevoeging van glucose. Het is ook aangetoond dat de InsGLuc MIN6 cellen reageren zoals verwacht aan de afscheiding modulerende verbindingen zoals kaliumchloride, diazoxide, PMA, en epinephrin.Na deze procedure moeten kritische resultaten worden bevestigd door krbh-supernatants te analyseren in elisa- of HTRF-tests op basis van antilichamen die het mogelijk maken insulineconcentraties te bepalen. Veel pionierswerk is gedaan door een groep van het Broad Institute, die de weg vrijgemaakt voor mij om steeds meer gebruik van deze test in mijn onderzoek. Meerdere onderzoeksgroepen, waaronder wij en de groep van de Broad, gebruiken deze aanpak bij het ontdekken van geneesmiddelen op het gebied van diabetes.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Het meten van exocytose in Neuronen FM-ontvanger voor Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Het meten van de buigstijfheid van de bacteriële cellen Met behulp van een optische val

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insuline-injectie en hemolymfe Extraction om de gevoeligheid voor insuline meten in het volwassenenonderwijs Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Monitoring Cell-autonome circadiane klok Rhythms of genexpressie met behulp van Luciferase Bioluminescentie Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

High-throughput Functionele Screening met behulp van een zelfgemaakte Dual-gloed Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Transfecteren RAW264.7 cellen met een luciferasereportergen

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring endoplasmatisch reticulum calciumhomeostase Met behulp van een<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...