Name: measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00
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著者は、貴重な仕事と議論のためにコブ研究所のすべての現在および元メンバーに感謝し、行政支援のためのディオンヌウェア。マイケル・カルワットは、若年性糖尿病研究財団SRA-2019-702-Q-Rによってサポートされています。この作業は、NIH R37 DK34128とウェルチ財団グラントI1243を通じてメラニー・コブに可能になりました。この作業の初期の部分は、マイケル・カルワットにNIH F32 DK100113によってもサポートされました。

1. 試薬、媒体及びバッファーの調製(表1)
<ol><li>高グルコース(4.5g/L)ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)の500mLでMIN6完全培地を調製:15%胎児ウシ血清(FBS)、100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、29μg/mMβ-メルカプトエタノール。 注:この場合の安定した細胞株は、G418抗生物質の250 μg/mLで維持される。</li>
	<li>5mM KCl、120mM NaCl、15mM HEPES(pH 7.4)、24mM NaHCO 3、1mM MgCl2、2mM ...

<ol>
	<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways.">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li><li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function.">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li><li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes.">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li><li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide.">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li><li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence.">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li><li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo.">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li><li>Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+and+methods+for+regulating+insulin+secretion.">Compounds and methods for regulating insulin secretion.</a> World patent. , (2018).</li><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells.">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).</li><li>Ohmiya, Y., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+composition+and+stabilizing+method+of+coelenterazine+solution+for+high-throughput+measurement+of+luciferase+activity.">Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes.">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li><li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose.">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li><li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification.">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular &amp; Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li><li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins.">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation.">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).</li><li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious.">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li><li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet.">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li><li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion.">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li><li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2++Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells.">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li><li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+&amp;#34;no-wash&amp;#34;+high-throughput+alternative+to+ELISA.">AlphaLISA immunoassay platform- the &amp;#34;no-wash&amp;#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li><li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion.">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles.">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).</li><li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion.">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li><li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release.">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li></ol>

本明細損では、MIN6β細胞からのグルコース刺激インスリン分泌応答を迅速に評価する方法を提示する。アッセイで最良の応答を得るためには、MIN6細胞を適切な密度で播種し、それらが85-95%のコンフルエントになることを可能にすることが重要です。これは、一次島17、18、19、20、21およびMIN6の両方で起<sup class="xref...

ここで提示される方法は、遺伝子組み換えβ細胞株からのインスリン分泌を96ウェルプレート形式で迅速かつ手頃な価格でアッセイすることを可能にする。このプロトコルの鍵は、自然に分泌されたガウシア・ルシフェラーゼ(GLuc,~18 kDa)をCペプチドに挿入してインスリン・ガウシア(InsGLuc)1、2を生成するインスリンの改変バージョンである(図1参照)。GFP(〜25kDa)のような他のより大きなタンパク質は、インスリンのC-ペプチドに正常に挿入され、プロインスリン-GFPからインスリンおよびGFP-C-ペプチド3、4への予想される翻訳後処理を示した。このプロトコルのアッセイでは、GLucは哺乳類発現に対してコドン最適化されており、2つの変異が輝きのような運動学5、6を増強するために導入されている。治療条件の複数の組み合わせおよび複製は96ウェルプレート形式で容易にテストすることができ、分泌結果は実験の直後に得ることができる。
前述の2として、主な利点は、このルシフェラーゼベースの分泌測定(< $0.01/ウェル)の低コストであり、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)の比較的高いコストと技術的側面と区別します(> $2/well) および均質な時間分解蛍光 (HTRF) またはその他のフェルスター共鳴エネルギー伝達 (FRET) ベースの抗体 (> $1/well) アッセイ.標準曲線を参照してインスリンの濃度を測定するこれらの抗体ベースのアッセイと比較して、InsGLucアッセイは、プレート上のウェルを制御するための相対的な比較として分泌活性を測定します。そのため、すべての実験には適切なコントロールが必要です。この区別は、迅速かつ安価な測定を可能にするトレードオフです。しかしながら、InsGLuc分泌は、ELISA1,2によって測定されたインスリン分泌と高度に相関することが実証されている。この技術は、ハイスループットスクリーニング1、2、7のためにスケールアップされ、電圧ゲートカリウムチャネル阻害剤7を含むインスリン分泌の新規モジュレーターの同定につながっています7β細胞機能の天然物阻害剤と同様に、染色体A28.InsGLuc の使用は、インスリン分泌への影響について多くの異なる治療条件を継続的にテストする予定の研究者に最も適しています。フォローアップ実験では、親のβ細胞株で重要な知見を繰り返し、マウスやヒトの島で最適に、抗体ベースのアッセイを用いてインスリン分泌を測定する必要があります。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rIns-GLuc stable MIN6 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>4.5 g/L glucose media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum, heat-inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP 176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G418-10</td>
			<td>Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secretion assay reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RIA grade)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes, pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>15568414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional drugs for stimulation experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9035</td>
			<td>Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine (bitartrate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4375</td>
			<td>Stock solution: 5 mM in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (phorbol 12-myristate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Stock solution: 100 &#181;M in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guassia assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>G334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bromide</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44680-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44608-5000</td>
			<td>Stock solution: 0.5 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
			<td>Stock solution: 1 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1775922</td>
			<td>US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0505-250G</td>
			<td>US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (native)</td>
			<td>Nanolight / Prolume</td>
			<td>3035MG</td>
			<td>Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td>Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
			<td>A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 &#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4724</td>
			<td>An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel 200 &#181;L pipette</td>
			<td>Transferpette S 20-200 &#181;L</td>
			<td>2703710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate

分泌されたインスリンサンプルコレクションに対する抗体ベースのアッセイを行うには、通常、アッセイ時間の1日に数時間を要し、特定のアッセイに応じて高価になる可能性があります。分泌されたルシフェラーゼアッセイは、結果を促進し、サンプルあたりのアッセイコストを大幅に下げる。ここでは、C-ペプチド内に遺伝的に挿入されたガウシア・ルシフェラーゼを用いて膵β細胞からのインスリン分泌活性を測定する比較的使用されていないアプローチを提示する。プロインスリンのタンパク化処理中に、C-ペプチドは、インスリンと共分泌されるインスリン分泌性小胞内のルシフェラーゼを放出して取り除く。結果はルシフェラーゼアッセイの速度のためにサンプル収集後数分以内に得ることができる。アッセイの限界は、インスリン分泌の相対測定であり、絶対定量ではないことです。しかし、このプロトコルは経済的でスケーラブルであり、ほとんどの標準的な発光板リーダーを使用して実行することができます。アナログおよびデジタルマルチチャンネルピペットは、アッセイの複数のステップを容易にします。多くの異なる実験バリエーションを同時にテストすることができます。焦点を絞った条件が決定されたら、標準曲線を用いた抗体ベースのアッセイを使用してインスリン濃度を直接測定し、ルシフェラーゼアッセイ結果を確認する必要があります。

制御条件下でのアッセイの性能を測定するために、単純なグルコース用量応答曲線またはジアゾキシドパラダイムを用いる刺激を完了することができる。前者の場合、グルコースフリー条件で1時間の細胞を事前にインキュベートし、その後、グルコース濃度を増加させた状態で1時間の治療を行う場合、5mM以下での分泌活性はごくわずかで、分泌の増加は8以上に観察?...

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Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

このプロトコルは、β細胞からのインスリン分泌のプロキシとしてインスリン連結ガウシアルシフェラーゼを使用して中程度のスループットで迅速な低コストルシフェラーゼアッセイを行う方法について説明する。アッセイは、ほとんどの発光プレートリーダーおよびマルチチャンネルピペットで行うことができる。

共分泌ルシフェラーゼサロゲートを用いた相対インスリン分泌の測定

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

このプロトコルは、創薬と特性評価を促進するためにベータ細胞株からのインスリン分泌をアッセリンするための代替迅速なアプローチを記述する。このアプローチは、複数の治療法を同時にテストすることができ、実験の直後に結果が得られ、このアッセイは他のものよりも手頃な価格であるため、有用です。インスリン分泌の新しい小分子モジュレーターのスクリーニングに向けてこの方法を適用すると、将来の糖尿病治療のための鉛化合物を同定することができる。β細胞機能の知識の増加は、一般的にタンパク質または神経伝達物質の分泌の理解を深めるに貢献することができます。.このインスリン分泌レポーターは、他のβ細胞株およびヒト小島においてレンチウイルス系で働くように確立された。このアッセイは、細胞培養およびマルチチャネルピペットの操作に精通している個人にとって非常に簡単であるべきです。実験を計画する前に、あなたの親または安定したベータ細胞株がインスリンELISAを使用してグルコースに適切に反応していることを確認してください。まず、クレブスリンガー重炭酸塩バッファーまたはKRBHとガウシアルシフラーゼの作業溶液を原稿の指示に従って調製します。標準的な細胞培養技術を用いてT75フラスコでMIN6細胞を増殖させる。PBSで2回細胞のコンフルエントフラスコを洗浄し、トリプシンの2ミリリットルを追加することにより、メッキのためのInsGLuc MIN6細胞を準備します。約5分間、またはフラスコから解離するまで、37°Cで細胞をインキュベートします。細胞濃度を決定し、完全な培地中の細胞を1ミリリットル当たり100万個の細胞に希釈し、96ウェルプレートの各ウェルで100マイクロリットル当たり100,000細胞に相当します。細胞は、3〜4日後にアッセイのために十分にコンフルエントでなければなりません。アッセイの日に、実験のために十分なグルコースフリーKRBHを準備し、貯蔵所を設置する。96ウェルプレートから培地をデスキャンするには、実験室のシンクの上で素早く反転し、余分な媒体を取り除くためにペーパータオルの積み重ねにしっかりと吸い込みます。ウェルあたり100マイクロリットルのグルコースフリーKRBHでプレートを2回洗浄し、薬物治療を行う場合は、原稿の指示に従ってKRBHに薬物を追加します。その後、各ウェルにグルコースフリーKRBHの100マイクロリットルを追加し、1時間摂氏37度でインキュベートします。インキュベーションの後、バッファーをデカンにし、ペーパータオルの上にプレートをブロットします。蓄積された背景を洗い流すためにウェルあたり100マイクロリットルのグルコースフリーKRBHを加え、プレートをデカントします。1ウェルあたり100マイクロリットルで薬物治療の有無にかかわらず制御と刺激条件を追加し、1時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。特定の実験で細胞の応答性を決定するために、各プレートに基底および刺激されたコントロールを含めることが重要です。細胞が時間の経過とともに応答を失った場合は、新鮮な液体窒素ストックからそれらを再培養します。マルチチャンネルピペットを使用して50マイクロリットルの上澄み物を慎重に収集し、不透明な白96ウェルアッセイプレートに移し、ルシファーゼアッセイの準備ができるまでベンチの室温でサンプルを保管してください。GLucアッセイバッファーに必要量のCTZ溶液をピペット処理して、GLucアッセイバッファーにガウシアルシファーゼアッセイの作動液を調製し、CTZの温暖化を防止するよう注意を払います。マルチチャンネルピペットを使用して、GLucアッセイの作業溶液をKRBH上清を使用してプレートに素早く添加します。ウェルの側面に液滴がある場合は、テーブルトップでプレートを簡単に回転し、バケット遠心分離機を振ります。その後、プレートをプレートリーダーに入れ、0.1秒の積分時間で発光を読み取ります。このアッセイは、グルコース濃度の上昇に対する応答としてインスリン分泌を測定することによって制御条件下で試験されている。5ミリモルグルコース未満では分泌活性が非常に少なく、8ミリモル以上の分泌量の増加が観察される。この細胞は、ジアゾキシドパラダイムに挑戦した場合に予想される分泌応答を示す。ジアゾキシド治療は、細胞外の塩化カリウムがない場合、インスリン分泌をブロックします。塩化カリウムが存在する場合、さらにグルコースを添加して分泌を増幅することができる。また、InsGLuc MIN6細胞が、塩化カリウム、ジアゾキシド、PMA、エピネフリンなどの化合物を分泌する際に期待どおりに反応することが実証されています。この手順に従って、重要な結果は、インスリン濃度の決定を可能にする抗体ベースELISAまたはHTRFアッセイ中のKRBH上清を分析することによって確認されるべきである。ブロード・インスティテュートのグループによって多くの先駆的な仕事が行われ、私はこのアッセイを研究にますます使う道を開きました。私たちやブロードのグループを含む複数の研究グループは、糖尿病の分野での創薬活動にこのアプローチを使用しています。

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

光トラップを用いた細菌細胞の曲げ剛性の測定

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

インスリン注射と成人のインスリン感受性を測定する血リンパの抽出キイロショウジョウバエ</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

インスリン発現コロニーを形成する前駆細胞の定量アッセイ

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

ルシフェラーゼレポーター遺伝子でRAW264.7細胞をトランスフェクト

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...