Name: measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00
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저자는 귀중한 일과 토론에 대한 Cobb 실험실의 모든 현재 및 전 회원, 행정 지원을 위한 Dionne Ware에 감사드립니다. 마이클 칼왓은 청소년 당뇨병 연구 재단 SRA-2019-702-Q-R에 의해 지원됩니다. 이 작품은 NIH R37 DK34128과 웰치 재단 보조금 I1243을 통해 멜라니 콥에 가능하게되었다. 이 작업의 초기 부분은 또한 마이클 칼왓에 NIH F32 DK100113에 의해 지원되었다.

1. 시약, 매개체 및 완충제 의 준비 (표 1)
<ol><li>다음 첨가제와 함께 500 mL의 고포도당 (4.5 g / L) 덜베코의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)에서 MIN6 완전한 매체를 준비하십시오 : 15 % 태아 소 혈청 (FBS), 100 단위 / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙 토마이신, 292 μl/ ll β-메르카포에탄올. 참고: 이 경우 안정된 세포주 G418 항생제의 250 μg/mL에서 유지된다.</li>
	<li>Krebs-링거 중탄산염 완충제(KRBH)를 5 mM KCl, 120 mM Na...

<ol>
	<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways.">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li><li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function.">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li><li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes.">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li><li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide.">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li><li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence.">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li><li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo.">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li><li>Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+and+methods+for+regulating+insulin+secretion.">Compounds and methods for regulating insulin secretion.</a> World patent. , (2018).</li><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells.">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).</li><li>Ohmiya, Y., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+composition+and+stabilizing+method+of+coelenterazine+solution+for+high-throughput+measurement+of+luciferase+activity.">Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes.">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li><li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose.">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li><li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification.">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular &amp; Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li><li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins.">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation.">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).</li><li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious.">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li><li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet.">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li><li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion.">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li><li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2++Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells.">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li><li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+&amp;#34;no-wash&amp;#34;+high-throughput+alternative+to+ELISA.">AlphaLISA immunoassay platform- the &amp;#34;no-wash&amp;#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li><li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion.">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles.">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).</li><li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion.">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li><li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release.">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li></ol>

여기서 우리는 MIN6 β 세포로부터의 포도당 자극 인슐린 분비 반응을 신속하게 평가하는 방법을 제시한다. 분석에서 최상의 응답을 위해 적절한 밀도로 MIN6 세포를 시드하고 85-95 % 동시성으로 하는 것이 중요합니다. 이는 1차 섬17,18,19,20,21뿐만 아니라 MIN6에서 모두 발생하는 향상된 ?...

여기에 제시된 방법은 유전자 변형 베타 세포주에서 인슐린 분비가 96 웰 플레이트 형식으로 신속하고 저렴하게 분석될 수 있게 한다. 이 프로토콜의 핵심은 인슐린-가우시아(InsGLuc) 1,2를생성하기 위해 C-펩티드내로 삽입된 자연분비 가우시아 루시퍼라제(GLuc, ~18 kDa)를 삽입한 인슐린의 변형된 버전이다. GFP (~25 kDa)와 같은 다른 더 큰 단백질은 성공적으로 인슐린의 C-펩티드에 삽입되고 인슐린과 GFP-C-펩타이드3,4에대한 프로인슐린-GFP로부터 예상되는 번역 후 처리를 나타냈다. 본 프로토콜의 분석의 경우, GLuc는 포유류 발현에 최적화된 코돈및 2개의 돌연변이가 도입되어광과 같은 역학을 향상시키고 5,6. 치료 조건의 다중 조합 및 복제는 96 웰 플레이트 형식으로 용이하게 테스트할 수 있으며 실험 직후 분비 결과를 얻을 수 있다.
앞서 언급한 바와같이 2의 주요 장점은 효소 연계 면역흡착 분석(ELISAs)의 상대적으로 높은 비용과 기술적 측면과 차별화되는 이 루시퍼라제 기반 분비 측정(&$0.01/well)의 저렴한 비용입니다. > $2/well) 및 균일한 시간 해결 형광 (HTRF) 또는 다른 Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 항체 (> $1/well) 분석. 표준 곡선을 참조하여 인슐린의 농도를 측정하는 이러한 항체 기반 분석과 비교하여 InsGLuc 분석은 플레이트상에서 웰을 제어하는 상대적 비교로 분비 활성을 측정합니다. 이러한 이유로 모든 실험에는 적절한 컨트롤이 포함되어야 합니다. 이러한 구분은 신속하고 저렴한 측정을 허용하는 절충안입니다. 그러나, InsGLuc 분비는 ELISA1,2에의해 측정된 바와 같이 인슐린 분비와 높은 상관관계가 있는 것으로 입증되었다. 이 기술은 고처리량 스크리닝 1,2,7을 위해 확장되었으며 전압 게이트 칼륨 채널 억제제 7을 포함한 인슐린 분비물의 새로운 변조기의 식별을 주도하고 있다7 뿐만 아니라 β 세포 기능의 천연 생성억제제, 크로모마이신 A28. InsGLuc의 사용은 지속적으로 인슐린 분 비에 미치는 영향에 대 한 많은 다른 치료 조건을 테스트 하려는 연구원에 대 한 가장 적합. 후속 실험에서 부모 β 세포주에서 주요 발견을 반복하고, 뮤린 또는 인간 아일에서 최적으로, 항체 기반 분석을 사용하여 인슐린 분비를 측정할 필요가 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rIns-GLuc stable MIN6 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>4.5 g/L glucose media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum, heat-inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP 176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G418-10</td>
			<td>Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secretion assay reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RIA grade)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes, pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>15568414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional drugs for stimulation experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9035</td>
			<td>Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine (bitartrate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4375</td>
			<td>Stock solution: 5 mM in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (phorbol 12-myristate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Stock solution: 100 &#181;M in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guassia assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>G334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bromide</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44680-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44608-5000</td>
			<td>Stock solution: 0.5 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
			<td>Stock solution: 1 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1775922</td>
			<td>US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0505-250G</td>
			<td>US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (native)</td>
			<td>Nanolight / Prolume</td>
			<td>3035MG</td>
			<td>Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td>Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
			<td>A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 &#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4724</td>
			<td>An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel 200 &#181;L pipette</td>
			<td>Transferpette S 20-200 &#181;L</td>
			<td>2703710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate

분비된 인슐린 후 샘플 수집을 위한 항체 기반 분석은 일반적으로 분석 시간의 하루에 몇 시간을 필요로 하며, 특정 분석법에 따라 비쌀 수 있다. 분비된 루시페라아제 분석제는 결과를 신속히 하고 샘플당 분석 비용을 실질적으로 낮춥시한다. 여기에서 우리는 C-펩티드 내의 유전으로 삽입된 Gaussia luciferase를 사용하여 췌장 β 세포에서 인슐린 분비 활동을 측정하기 위하여 상대적으로 과소 이용된 접근을 제시합니다. 프로 인슐린의 프로테올리처리 동안, C-펩타이드는 인슐린과 병용비되는 인슐린 분비 소포 내에서 루시페라제를 방출하는 절제된다. 결과는 luciferase assays의 속도 때문에 견본 수집 후에 분 안에 장악될 수 있습니다. 분석의 한계는 인슐린 분비의 상대적인 측정이지 절대 정량이 아니라는 것입니다. 그러나 이 프로토콜은 경제적이고 확장 가능하며 대부분의 표준 발광 플레이트 판독기를 사용하여 수행할 수 있습니다. 아날로그 및 디지털 멀티채널 파이펫은 분석의 여러 단계를 용이하게 합니다. 많은 다른 실험 적 변형을 동시에 테스트 할 수 있습니다. 조건의 집중된 세트가 결정되면, 인슐린 사격량은 luciferase 분석 결과를 확인하기 위하여 표준 곡선을 가진 항체 기지를 둔 분석제를 사용하여 직접 측정되어야 합니다.

대조군 조건하에서 분석의 성능을 측정하기 위해, 디아옥사이드 패러다임을 이용한 간단한 포도당 투여량-반응 곡선 또는 자극을 완료할 수 있다. 전자의 경우, 포도당 없는 조건에서 1시간 동안 세포를 미리 배양한 다음 포도당 농도가 증가하여 1시간 동안 치료하면 5mM 이하에서 분비 활동이 거의 발생하지 않아야 하며, 분비는 8이상으로 관찰됩니다. mM 포도당<strong class="...

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Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

이 프로토콜은 베타 세포에서 인슐린 분비를 위한 프록시로 인슐린 연결된 Gaussia luciferase를 사용하여 중간 처리량에서 급속한 저비용 luciferase 분석기를 능력을 발휘하는 방법을 기술합니다. 이 분석은 대부분의 발광 플레이트 판독기 및 다중 채널 파이펫으로 수행될 수 있습니다.

공동 분비 된 루시퍼라제 대리를 사용하여 상대 인슐린 분비 측정

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

이 프로토콜은 베타 세포주에서 인슐린 분비를 속이기 위한 대체적인 신속한 접근법을 설명하여 약물 발견 및 특성화를 가속화합니다. 이 접근법은 여러 치료법을 동시에 테스트할 수 있고, 실험 직후에 결과를 사용할 수 있으며, 이 분석이 다른 치료법보다 더 저렴하기 때문에 유용합니다. 인슐린 분비의 새로운 작은 분자 변조기에 대한 스크리닝을 향해이 방법의 응용 프로그램은 미래의 당뇨병 치료에 대한 납 화합물을 식별 할 수 있습니다.베타 세포 기능에 대한 지식이 증가하면 일반적으로 단백질 이나 신경 전달 물질 분비의 더 큰 이해에 기여할 수 있습니다. 이 인슐린 분비 기자는 다른 베타 세포 라인과 인간 섬에서 렌티 바이러스 시스템에서 작동하도록 설립되었습니다. 이 분석체는 세포 배양 및 다중 채널 파이펫 을 작동하는 데 익숙한 개인에게 매우 간단해야합니다.실험을 계획하기 전에, 당신의 부모 또는 안정적인 베타 세포주 인슐린 ELISA를 사용하여 포도 당에 제대로 반응 하는 확인. 설명서 방향에 따라 크렙스 링거 중탄산완충또는 KRBH 및 가우시아 루시파라제 작업 솔루션을 준비하는 것으로 시작합니다. 표준 세포 배양 기술을 사용하여 T75 플라스크에서 MIN6 세포를 성장시하십시오.PBS로 두 번 세포의 물풍 플라스크를 세척하고 트립신의 두 밀리리터를 추가하여 도금에 대한 InsGLuc MIN6 세포를 준비합니다. 약 5 분 동안 37섭씨또는 세포가 플라스크에서 해리 될 때까지 세포를 배양합니다. 세포 농도를 결정하고 밀리리터 당 1백만 개의 세포로 전체 매체의 세포를 희석시키는데, 이는 96웰 플레이트의 각 웰에서 100 마이크로리터 당 100, 000 세포에 해당한다.세포는 3~4일 후에 분석에 충분히 수렴되어야 한다. 분석 당일, 실험을 위해 충분한 포도당 무료 KRBH를 준비하고 저수지를 설정합니다. 실험실 싱크대에 빠르게 반역한 다음 종이 타월 더미에 단단히 얼룩져 과도한 매체를 제거하여 96 웰 플레이트에서 배지를 데킹합니다.잘 당 포도당 무료 KRBH의 100 마이크로 리터로 접시를 두 번 세척하고, 약물 치료를 수행하는 경우, 원고 지침에 따라 KRBH에 약물을 추가합니다. 그런 다음, 포도당 무료 KRBH의 100 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 인큐베이션 후 버퍼를 데수늘하고 접시를 종이 타월에 블롯합니다.100 마이크로리터의 포도당 무료 KRBH를 잘 추가하여 축적된 배경을 씻어낸 다음 접시를 데치합니다. 잘 100 마이크로 리터에서 약물 치료유무에 관계없이 제어 및 자극 조건을 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양하십시오. 주어진 실험에서 세포의 반응성을 결정하기 위해 각 플레이트에 기저 및 자극 된 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다.세포가 시간이 지남에 따라 응답을 잃은 경우, 신선한 액체 질소 육수에서 그들을 다시 배양. 신중하게 멀티 채널 파이펫을 사용하여 50 마이크로 리터의 마이크로 리터를 수집, 불투명 흰색 96 및 분석 플레이트로 전송하고, 루시파라제 분석에 대한 준비가 될 때까지 벤치에 실온에서 샘플을 유지합니다. CTZ가 온난화되는 것을 방지하기 위해 필요한 양의 CTZ 용액을 GLuc 분석 버퍼에 파이프하여 가우시아 루시파라제 분석 작업 솔루션을 준비합니다.멀티채널 파이펫을 사용하여 KRBH 수퍼나티를 사용하여 GLuc 분석 작업 솔루션을 플레이트에 빠르게 추가합니다. 우물 측면에 액적이 있으면 테이블 탑에서 플레이트를 잠시 회전하고 버킷 원심분리기를 스윙합니다. 그런 다음 플레이트 판독기에 플레이트를 넣고 0.1초의 통합 시간으로 발광을 읽습니다.이 분석은 증가 된 포도당 농도에 대한 응답으로 인슐린 분비를 측정하여 제어 조건하에서 테스트되었습니다. 아주 작은 분비 활동은 5 밀리몰라 포도당 의 밑에 관찰되고, 증가한 분비는 8 밀리몰라 위에 관찰됩니다. 세포는 diazoxide 패러다임에 도전할 때 예상되는 분비 반응을 전시합니다.디아산화화물 치료는 염화칼륨 외세포 칼륨이 없는 경우 인슐린 분비를 차단합니다. 염화칼륨이 존재할 때, 분비액은 포도당을 추가하여 증폭될 수 있다. 또한 InsGLuc MIN6 세포가 염화칼륨, 다이아산화물산화물, PMA 및 에피네프린과 같은 변조 화합물을 분비할 것으로 예상되는 것으로 입증되었습니다.이 절차에 따라, 인슐린 농도의 측정을 허용하는 항체 기반 ELISA 또는 HTRF 분석에서 KRBH 초월제를 분석하여 중요한 결과를 확인해야합니다. 선구적인 작업의 많은 브로드 연구소에서 그룹에 의해 수행되었습니다, 이는 점점 내 연구에서이 분석기를 사용하는 나를위한 길을 포장. 우리와 브로드의 그룹을 포함한 여러 연구 그룹은 당뇨병 분야에서 약물 발견 노력에이 접근 방식을 사용하고 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

연구

생물학

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

광학 트랩을 사용하여 박테리아 세포의 굽힘 강성을 측정

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

인슐린 주입 및 성인에서 인슐린 민감도를 측정하는 Hemolymph 추출 Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

대형 Unilamellar Vesicles로 펩타이드의 Translocation 측정

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

루시퍼 라제 리포터 유전자 RAW264.7 세포를 형질

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

사용 소포체 칼슘 항상성 모니터링<em&gt; Gaussia</em&gt; 루시 페라 제 SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...