Name: measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

Forfatterne takker alle nåværende og tidligere medlemmer av Cobb laboratoriet for verdifullt arbeid og diskusjoner, og Dionne ware for administrativ bistand. Michael Kalwat er støttet av en juvenil diabetes Research Foundation SRA-2019-702-Q-R. Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom NIH R37 DK34128 og Welch Foundation Grant I1243 til Melanie Cobb. Tidlige deler av dette arbeidet ble også støttet av en NIH F32 DK100113 til Michael Kalwat.

1. utarbeidelse av reagenser, medier og buffere (tabell 1)
<ol><li>Forbered MIN6 komplette medier i 500 mL høy glukose (4,5 g/L) Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium (DMEM) med følgende tilsetningsstoffer: 15% fosterets storfe serum (FBS), 100 enheter/mL penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 292 μg/mL L-glutamin, og 50 μM β-mercaptoethanol. Merk: den stabile cellelinjen i dette tilfellet opprettholdes i 250 mikrogram/mL G418 antibiotika.</li>
	<li>Forbered Krebs-ringer bikarbonat buffer (KRBH) ved å lage en l?...

<ol>
	<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways.">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li><li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function.">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li><li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes.">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li><li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide.">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li><li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence.">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li><li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo.">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li><li>Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+and+methods+for+regulating+insulin+secretion.">Compounds and methods for regulating insulin secretion.</a> World patent. , (2018).</li><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells.">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).</li><li>Ohmiya, Y., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+composition+and+stabilizing+method+of+coelenterazine+solution+for+high-throughput+measurement+of+luciferase+activity.">Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes.">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li><li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose.">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li><li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification.">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular &amp; Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li><li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins.">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation.">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).</li><li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious.">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li><li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet.">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li><li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion.">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li><li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2++Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells.">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li><li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+&amp;#34;no-wash&amp;#34;+high-throughput+alternative+to+ELISA.">AlphaLISA immunoassay platform- the &amp;#34;no-wash&amp;#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li><li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion.">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles.">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).</li><li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion.">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li><li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release.">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li></ol>

Heri presenterer vi en metode for å raskt vurdere glukose-stimulert insulin sekresjon reaksjoner fra MIN6 β celler. For de beste svarene i analysen er det viktig å frø MIN6 cellene på riktig tetthet og tillate dem å bli 85-95% confluent. Dette forbedrer β Cell responser til glukose på grunn av forbedrede celle-celle-kontakter og synkronisering, som forekommer både iprimær holmer17,18,19,20<...

Metoden som presenteres her kan insulin sekresjon fra en genetisk modifisert beta cellelinje som skal analyseres raskt og rimelig i 96-brønn-plate-format. Nøkkelen til denne protokollen er en modifisert versjon av insulin med naturlig utskilt Gaussia luciferase (GLuc, ~ 18 KDA) innsatt (se figur 1) i C-peptid for å generere insulin-Gaussia (InsGLuc)1,2. Andre større proteiner, slik som GFP (~ 25 KDA), har blitt satt inn i C-peptid av insulin og utstilt den forventede post-translational behandling fra proinsulin-GFP til insulin og GFP-C-peptid3,4. For analysen i denne protokollen, GLuc har blitt Codon-optimalisert for pattedyr uttrykk og to mutasjoner har blitt innført for å forbedre glød-lignende Kinetics5,6. Flere kombinasjoner og replikerer av behandlings forhold kan lett testes i 96-brønn-plateformat og utskillelsen resultatene kan oppnås umiddelbart etter eksperimentet.
En stor fordel, som tidligere nevnt2, er den lave kostnaden for denne luciferase-baserte sekresjon måling (< $0.01/Well) som skiller den fra de relativt høyere kostnader og tekniske aspektene ved enzym-knyttet immunosorbentanalyse analyser (ELISAs) ( > $2/Well) og homogen tids løst fluorescens (HTRF) eller andre Förster resonans energi overføring (bånd)-basert antistoff (> $1/Well) analyser. I forhold til disse antistoff-baserte analysene, som måler konsentrasjonen av insulin ved å henvise til en standard kurve, måler InsGLuc-analysen sekretoriske aktivitet som en relativ sammenligning for å kontrollere brønner på tallerkenen. Derfor krever hvert eksperiment inkludering av riktige kontroller. Dette skillet er en trade-off for å tillate raske og rimelige målinger. Men, InsGLuc sekresjon har vist å være svært korrelert med insulin sekresjon målt ved Elisa1,2. Denne teknologien har blitt skalert opp for høy gjennomstrømming screening1,2,7 og har ført til identifisering av romanen modulatorer av insulin sekresjon inkludert en spenning-gated kalium kanal inhibitor7 i tillegg til en naturlig produkt hemmer av β-celle funksjon, Chromomycin a28. Bruken av InsGLuc er mest hensiktsmessig for forskere som planlegger å kontinuerlig teste mange forskjellige behandlings forhold for deres innvirkning på insulin sekresjon. I oppfølgingseksperimenter er det nødvendig å gjenta viktige funn i en Parental β-linje, og optimalt i murine eller menneskelige holmer, og måle insulin sekresjon ved hjelp av en antistoff-basert analyse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rIns-GLuc stable MIN6 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>4.5 g/L glucose media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum, heat-inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP 176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G418-10</td>
			<td>Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secretion assay reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RIA grade)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes, pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>15568414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional drugs for stimulation experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9035</td>
			<td>Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine (bitartrate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4375</td>
			<td>Stock solution: 5 mM in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (phorbol 12-myristate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Stock solution: 100 &#181;M in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guassia assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>G334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bromide</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44680-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44608-5000</td>
			<td>Stock solution: 0.5 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
			<td>Stock solution: 1 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1775922</td>
			<td>US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0505-250G</td>
			<td>US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (native)</td>
			<td>Nanolight / Prolume</td>
			<td>3035MG</td>
			<td>Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td>Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
			<td>A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 &#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4724</td>
			<td>An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel 200 &#181;L pipette</td>
			<td>Transferpette S 20-200 &#181;L</td>
			<td>2703710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate

Utføre antistoff-baserte analyser for utskilles insulin post-sample samling krever vanligvis et par timer til en dag med analysen tid og kan være dyrt, avhengig av den spesifikke analysen. Utskilt luciferase analyser fremskynde resultater og lavere analysen kostnaden per prøve betydelig. Her presenterer vi en relativt underutnyttet tilnærming for å måle insulin sekretoriske aktivitet fra bukspyttkjertel β celler ved hjelp av Gaussia luciferase genetisk inn i C-peptid. Under proteolytiske behandling av proinsulin, C-peptid er excised slippe luciferase innenfor insulin sekretoriske vesicle hvor det er co-utskilt med insulin. Resultatene kan fås i løpet av få minutter etter prøvetaking samling på grunn av hastigheten på luciferase analyser. En begrensning av analysen er at det er en relativ måling av insulin sekresjon og ikke en absolutt kvantifisering. Denne protokollen er imidlertid økonomisk, skalerbar og kan utføres ved hjelp av de fleste standard luminescence plate lesere. Analoge og digitale flerkanals Pipetter forenkler flere trinn av analysen. Mange forskjellige eksperimentelle variasjoner kan testes samtidig. Når et fokusert sett med betingelser avgjøres, bør insulin konsentrasjonen måles direkte ved hjelp av antistoff-baserte analyser med standard kurver for å bekrefte luciferase analyseresultater.

For å måle ytelsen til analysen under kontroll forhold, en enkel glukose dose-respons kurve eller en stimulering ved hjelp av diazoksid paradigmet kan gjennomføres. I tilfelle av det tidligere, pre-incubating cellene for 1 t i glukose-frie forhold etterfulgt av behandling for 1 t med økende glukose konsentrasjoner bør resultere i svært lite sekretoriske aktivitet på og under 5 mM, mens økt sekresjon er observert over 8 mM glukose (figur 2). Stimulerin...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Denne protokollen beskriver hvordan du utfører raske lave kostnader luciferase analyser på middels gjennomstrømning ved hjelp av en insulin-koblet Gaussia luciferase som en proxy for insulin sekresjon fra beta celler. Analysen kan utføres med de fleste luminescence plate lesere og flerkanals pipetter.

Måle relativ insulin sekresjon ved hjelp av en co-utskilt luciferase surrogat

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Denne protokollen beskriver en alternativ rask tilnærming for analyse av insulinsekresjon fra betacellelinjer for å fremskynde narkotikaoppdagelse og karakterisering. Denne tilnærmingen er nyttig fordi flere behandlinger kan testes samtidig, resultatene er tilgjengelige umiddelbart etter eksperimentet, og denne analysen er rimeligere enn andre. Anvendelsen av denne metoden mot screening for nye små molekylmodulatorer av insulinsekresjon kan identifisere blyforbindelser for fremtidig diabetesbehandling.Økt kunnskap om betacellefunksjon kan bidra til større forståelse av protein eller nevrotransmittersekresjon generelt. Denne insulinsekresjonsreporteren er etablert for å fungere i et lentiviralsystem i andre betaceller linjer og i menneskelige holmer. Denne analysen bør være veldig grei for personer kjent med cellekultur og drift av flerkanals pipetter.Før du planlegger eksperimenter, må du kontrollere at foreldre- eller stabile betacellelinjer reagerer riktig på glukose ved hjelp av en insulin ELISA. Begynn med å forberede Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer eller KRBH og gaussia luciferase arbeidsløsning i henhold til manuskriptets retninger. Vokse MIN6 celler i T75 flasker ved hjelp av standard celle kultur teknikker.Forbered InsGLuc MIN6-cellene for plating ved å vaske en sammenføyd flaske celler to ganger med PBS og legge til to milliliter trypsin. Inkuber cellene ved 37 grader celsius i omtrent fem minutter, eller til cellene dissosierer fra kolben. Bestem cellekonsentrasjonen og fortynne cellene i komplette medier til en million celler per milliliter, noe som tilsvarer 100 000 celler per 100 mikroliter i hver brønn på en 96 brønnplate.Cellene skal være tilstrekkelig samløpet for analysen etter tre til fire dager. På analysedagen forbereder du nok glukosefri KRBH til eksperimentet og setter opp et reservoar. Dekanter mediet fra 96-brønnplaten ved raskt å snu det over en laboratorievask og deretter blotting fast på en bunke papirhåndklær for å fjerne overflødig medium.Vask platen to ganger med 100 mikroliter glukosefri KRBH per brønn, og hvis du utfører medikamentbehandlinger, legg til medisiner til KRBH i henhold til manuskriptets retninger. Deretter legger du til 100 mikroliter glukosefri KRBH til hver brønn og inkuberer ved 37 grader celsius i en time. Etter inkubasjonen dekanterer du bufferen og blot platen på et papirhåndkle.Tilsett 100 mikroliter glukosefri KRBH per brønn for å vaske bort akkumulert bakgrunn og deretter dekantere platen. Legg til kontroll og stimulerende forhold med eller uten medikamentell behandling ved 100 mikroliter per brønn og inkuber platen ved 37 grader celsius i en time. Det er viktig å inkludere basale og stimulerte kontroller på hver plate for å bestemme responsen til cellene i et gitt eksperiment.Hvis cellene har mistet sin respons over tid, rekultur dem fra en frisk flytende nitrogen lager. Samle forsiktig 50 mikroliter overnatur med en flerkanals pipette, overfør den til en ugjennomsiktig hvit 96-brønnanalyseplate, og hold prøven ved romtemperatur på benken til den er klar for luciferase-analysen. Forbered gaussia luciferase analysens arbeidsløsning ved å pipe den nødvendige mengden CTZ-løsning i GLuc-analysebufferen, og ta vare på å forhindre at CTZ varmes opp.Bruk en flerkanals pipette til raskt å legge til GLuc-analysearbeidsløsningen på platen med KRBH-supernativane. Hvis det er noen dråper på sidene av brønnene, kort spinne platen i en bordplate, swing bøtte sentrifuge. Sett deretter platen i plateleseren og les luminescence med en 0,1 sekunders integrasjonstid.Denne analysen har blitt testet under kontrollforhold ved å måle insulinsekresjon som en respons på økende glukosekonsentrasjoner. Svært lite sekretorisk aktivitet observeres under fem millimolar glukose, og økt sekresjon observeres over åtte millimolar. Cellene viser den forventede sekretoriske responsen når de utfordres med diazoksidparadigmet.Diazoksidbehandling blokkerer insulinsekresjon hvis det ikke er ekstracellulær kaliumklorid. Når kaliumklorid er tilstede, kan sekresjon forsterkes med ytterligere tilsetning av glukose. Det har også blitt vist at InsGLuc MIN6-cellene reagerer som forventet på sekresjonsmodulerende forbindelser som kaliumklorid, diazoksid, PMA og epinephrin.Etter denne prosedyren bør kritiske resultater bekreftes ved å analysere KRBH-supernativa i antistoffbaserte ELISA- eller HTRF-analyser som tillater bestemmelse av insulinkonsentrasjoner. Mye banebrytende arbeid har blitt gjort av en gruppe ved Broad Institute, som banet vei for meg å i økende grad bruke denne analysen i min forskning. Flere forskningsgrupper, inkludert oss og gruppen på Broad, bruker denne tilnærmingen i narkotikaoppdagelsesarbeidet innen diabetes.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

En kvantitativ analyse for Insulin-uttrykke Colony-forming stamfedre

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Måling Peptide translokasjon inn Large Unilamellar Blemmer

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Overvåking Cell-autonome biologiske klokke Rhythms of Gene Expression Bruke luciferase Bioluminescens Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Høy gjennomstrømming Funksjonell Screening ved hjelp av en hjemmelaget Dual-glød Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

RAW264.7 transfektere celler med en luciferasereportergenet

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Overvåking endoplasmic nettet kalsiumhomeostase Ved hjelp av en<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...