Name: measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate
Uploaded: 2019-06-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

Yazarlar değerli iş ve tartışmalar için Cobb laboratuvarının tüm mevcut ve eski üyelerine teşekkür ve idari yardım için Dionne Ware. Michael Kalwat bir juvenil diyabet araştırma Vakfı SRA-2019-702-Q-R tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, NıH R37 DK34128 ve Welch Foundation Grant I1243 aracılığıyla Melanie Cobb 'a mümkün hale gelmiştir. Bu çalışmanın erken parçaları da Michael Kalwat için bir NıH F32 DK100113 tarafından destekleniyor.

1. reaktiflerin, medyanın ve tamponların hazırlanması (Tablo 1)
<ol><li>500 mL yüksek glikoz (4,5 g/L) Dulbecco modifiye kartal Orta (DMEM) aşağıdaki katkı maddeleri ile MIN6 komple medya hazırlayın: 15% fetal Sığır serum (FBS), 100 birimleri/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 292 μg/mL L-glutamin, ve 50 μM β-mercaptoetanol. Not: Bu durumda istikrarlı hücre hattı 250 μg/mL G418 antibiyotik korunur.</li>
	<li>5 mm KCL, 120 mm NaCl, 15 mm HEPES (pH 7,4), 24 mm NaHCO3, 1 mm MgCl...

<ol>
	<li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+promoter-driven+Gaussia+luciferase-based+insulin+secretion+biosensor+assay+for+discovery+of+beta-cell+glucose-sensing+pathways.">Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways.</a> ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).</li><li>Burns, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+luminescent+reporter+of+insulin+secretion+for+discovering+regulators+of+pancreatic+Beta-cell+function.">High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).</li><li>Rajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+processing+and+secretion+of+mutant+insulin+proteins+that+cause+permanent+neonatal+diabetes.">In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).</li><li>Watkins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Secretory+Vesicles+by+Fluorescent+Protein+Insertion+in+Propeptide+Rather+Than+Mature+Secreted+Peptide.">Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide.</a> Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).</li><li>Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiply+mutated+Gaussia+luciferases+provide+prolonged+and+intense+bioluminescence.">Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).</li><li>Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Codon-optimized+Gaussia+luciferase+cDNA+for+mammalian+gene+expression+in+culture+and+in+vivo.">Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo.</a> Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).</li><li>Burns, S. M., Wagner, B. K., Vetere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+and+methods+for+regulating+insulin+secretion.">Compounds and methods for regulating insulin secretion.</a> World patent. , (2018).</li><li>Kalwat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromomycin+A2+potently+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+from+pancreatic+beta+cells.">Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells.</a> Journal of General Physiology. , (2018).</li><li>Luft, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Gaussia+luciferase+in+bicistronic+and+non-conventional+secretion+reporter+constructs.">Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs.</a> BMC Biochemistry. 15 (1), 14 (2014).</li><li>Ohmiya, Y., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+composition+and+stabilizing+method+of+coelenterazine+solution+for+high-throughput+measurement+of+luciferase+activity.">Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+monitoring+biological+processes+in+culture+and+in+vivo.">Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).</li><li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes.">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li><li>Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triggering+and+amplifying+pathways+of+regulation+of+insulin+secretion+by+glucose.">Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose.</a> Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).</li><li>Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+insulin+secretion+by+acetylcholine+or+phorbol+ester+is+independent+of+beta-cell+microfilaments+and+distinct+from+metabolic+amplification.">Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification.</a> Molecular &amp; Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).</li><li>Straub, S. G., Sharp, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+insights+regarding+mechanisms+for+the+inhibition+of+insulin+release+by+norepinephrine+and+heterotrimeric+G+proteins.">Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).</li><li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+passage+MIN6+cells+have+impaired+insulin+secretion+with+impaired+glucose+and+lipid+oxidation.">High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation.</a> PLoS One. 7 (7), e40868 (2012).</li><li>Head, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin-36+Gap+Junctions+Regulate+In+Vivo+First-+and+Second-Phase+Insulin+Secretion+Dynamics+and+Glucose+Tolerance+in+the+Conscious.">Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious.</a> Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).</li><li>Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+and+other+mechanisms+of+cell-cell+communication+regulate+basal+insulin+secretion+in+the+pancreatic+islet.">Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet.</a> The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129 (2), 359-370 (2007).</li><li>Jaques, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+effect+of+cell-cell+contact+disruption+on+cytosolic+calcium+and+insulin+secretion.">Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion.</a> Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).</li><li>Calabrese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+36+Controls+Synchronization+of+Ca2++Oscillations+and+Insulin+Secretion+in+MIN6+Cells.">Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells.</a> Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).</li><li>Bielefeld-Sevigny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlphaLISA+immunoassay+platform-+the+&amp;#34;no-wash&amp;#34;+high-throughput+alternative+to+ELISA.">AlphaLISA immunoassay platform- the &amp;#34;no-wash&amp;#34; high-throughput alternative to ELISA.</a> Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).</li><li>Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+Time-resolved+Forster+Resonance+Energy+Transfer-based+Assay+for+Detection+of+Insulin+Secretion.">Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).</li><li>Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+colorimetric+assay+using+insulin+G-quadruplex+aptamer+arrays+on+DNA+nanotubes+coupled+with+magnetic+nanoparticles.">Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles.</a> Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835 (2018).</li><li>Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+cell-based+Gaussia+luciferase+reporter+assay+for+identifying+modulators+of+fibulin-3+secretion.">A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion.</a> Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).</li><li>Frank, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+tools+for+understanding+the+complexity+of+beta-cell+signalling+and+insulin+release.">Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release.</a> Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+C-Peptide+Storage+and+Secretion+in+Islet+beta-Cells+In+Vitro+and+In+Vivo.">Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li></ol>

Burada, MIN6 β hücrelerinden glikoz stimüle edilen insülin salgılanması yanıtlarını hızla değerlendirmek için bir yöntem sunuyoruz. Tahlil en iyi tepkiler için uygun yoğunlukta MIN6 hücreleri tohum ve onları% 85-95 confluent haline izin önemlidir. Bu, hem primer adacıklar17, 18,19,20,21 yanı sıra oluşur Gelişmiş hücre hücre kişileri ...

Burada sunulan yöntem, genetik olarak değiştirilmiş bir beta hücre hattından insülin salgılanmasını, 96-Well-Plate formatında hızla ve uygun maliyetli bir şekilde tespit edilmesine olanak tanır. Bu protokol için anahtar doğal olarak salgılanan gaussia Lusiferaz (gluc, ~ 18 kDa) eklenmiş olan insülin değiştirilmiş bir sürümüdür (bkz. Şekil 1) C-peptid içine insülin-gaussia (insgluc)1,2oluşturmak için. GFP (~ 25 kDa) gibi diğer büyük proteinler, başarılı bir şekilde C-peptid insülin içine yerleştirilen ve proinsüline-Gfp gelen beklenen post-translational işleme insülin ve Gfp-C-peptid3,4sergilenmiştir. Bu protokolde tahlil için, gluc-memeliler ifade için optimize edilmiş ve iki mutasyonlar Glow benzeri kinetik5,6geliştirmek için tanıtıldı. Çoklu kombinasyonları ve tedavi koşullarının çoğaltır kolayca 96-Well-Plate formatında test edilebilir ve salgılanması sonuçları hemen deney sonrasında elde edilebilir.
Büyük bir avantaj, daha önce de belirtildiği gibi2, bu luciferase tabanlı salgılanması ölçümü düşük maliyetidir (< $0.01/Well) nispeten daha yüksek maliyetler ve enzim bağlı İmmünosorbent teknik yönlerini ayırt (Elisas) ( > $2/Well) ve homojen zaman çözülmemiş Floresan (HTRF) veya diğer Förster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı antikor (> $1/Well) sağlar. Bu antikor tabanlı testlere kıyasla, hangi standart bir eğri başvuran tarafından insülin konsantrasyonu ölçmek, InsGLuc tahlil plaka üzerinde kontrol kuyuları göreli bir karşılaştırma olarak salgılayan aktivite ölçer. Bu nedenle, her deney uygun kontroller eklenmesi gerekir. Bu ayrım hızlı ve ucuz ölçümlere izin vermek için bir ticaret-off olduğunu. Bununla birlikte, insgluc salgısı, ELISA1,2ile ölçülen insülin salgılanması ile son derece ilişkilidir. Bu teknoloji yüksek verimlilik taraması için ölçeklendirilmiştir1,2,7 ve bir voltaj-Gated Potasyum kanal inhibitörü dahil olmak üzere insülin salgılanması yeni modülatörlerin tanımlanması için yol açmıştır7 β hücreli fonksiyonun doğal ürün inhibitörü yanı sıra, chromomicin a28. InsGLuc kullanımı, sürekli olarak insülin salgılanması üzerindeki etkileri için birçok farklı tedavi koşullarını test etmeyi planlayan araştırmacılar için uygundur. Takip deneylerinde, ebeveyn β hücre hattında anahtar bulguları tekrar etmek ve duvar veya insan izletlerinde optimum şekilde tekrarlamak ve antikor bazlı bir tahlil kullanarak insülin salgılanmasını ölçmek gereklidir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell culture materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rIns-GLuc stable MIN6 cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Parental MIN6 cell line stably expressing pcDNA3.1+rInsp-Ins-eGLuc and maintained in 250 ug/ml G418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>4.5 g/L glucose media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum, heat-inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP 176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutamine</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>BP379-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>G418-10</td>
			<td>Stock solution 250 mg/mL in water. Freeze aliquots at -20C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-202-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent reservoirs (50 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secretion assay reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (RIA grade)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-146-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes, pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>50-213-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>15568414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional drugs for stimulation experiments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diazoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9035</td>
			<td>Stock solution: 50 mM in 0.1N NaOH. Add equal amount of 0.1N HCl to any buffer where diazoxide is added.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>epinephrine (bitartrate salt)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4375</td>
			<td>Stock solution: 5 mM in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA (phorbol 12-myristate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1585</td>
			<td>Stock solution: 100 &#181;M in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guassia assay materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>G334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bromide</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44680-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>AC44608-5000</td>
			<td>Stock solution: 0.5 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>RPI</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
			<td>Stock solution: 1 M pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1775922</td>
			<td>US Patent US7718389 suggested ascorbate can increase coelenterazine stability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0505-250G</td>
			<td>US Patent US8367357 suggested sulfite may decrease background due to BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine (native)</td>
			<td>Nanolight / Prolume</td>
			<td>3035MG</td>
			<td>Stock solution: 1 mg/ml in acidified MeOH (2.36 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPlate-96, White Opaque 96-well Microplate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6005290</td>
			<td>Any opaque white 96 well plate should be sufficient. Clear bottom plates will also work, however some signal will be lost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Hybrid plate reader or equivalent</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>8041000</td>
			<td>A plate reader with luminescence detection and 96-well plate capabilities is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel VOYAGER Pipette (50-1250 &#181;L)</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4724</td>
			<td>An automated multichannel pipette is extremely useful for rapid addition of luciferase reagents and plating cells in 96 well format</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-channel 200 &#181;L pipette</td>
			<td>Transferpette S 20-200 &#181;L</td>
			<td>2703710</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring relative insulin secretion using a co-secreted luciferase surrogate

Salgılanmış insülin sonrası numune toplama için antikor tabanlı asder gerçekleştirme genellikle test süresi bir gün için birkaç saat gerektirir ve özel tahlil bağlı olarak, pahalı olabilir. Salgılanan Lusiferaz sonuçları hızlandırmak ve örnek başına tahlil maliyeti önemli ölçüde düşük sağlar. Burada, pankreas β hücrelerinden insülin salgıya aktivitesini ölçmek için nispeten az kullanılan bir yaklaşım sunuyoruz, gaussia Lusiferaz kullanarak genetik olarak C-peptid içinde eklenmiştir. Proinsüline proteolitik işleme sırasında, C-peptid insülin salgılayan vezikül içinde Lusiferaz serbest bırakılıyor nerede birlikte-insülin ile salgılanmış. Sonuçlar, Lusiferaz aşının hızı nedeniyle örnek toplamanın ardından dakikalar içinde elde edilebilir. Tahlil bir sınırlama insülin salgılanması ve mutlak bir Nicek değil göreceli bir ölçüm olmasıdır. Ancak, bu protokol, ekonomik, ölçeklenebilir ve en standart lüminesans plaka okuyucular kullanılarak gerçekleştirilebilir. Analog ve dijital çok kanallı pipetler, testin birden fazla adımını kolaylaştırır. Birçok farklı deneysel varyasyonlar aynı anda test edilebilir. Bir kez koşullar odaklı bir dizi üzerine karar verildi, insülin konsantrasyonları doğrudan standart eğrileri ile antikor tabanlı deneyleri kullanılarak ölçülmelidir Lusiferaz tahlil sonuçlarını onaylamak için.

Kontrol koşullarında testin performansını ölçmek için, basit bir glikoz doz-yanıt eğrisi veya Diazoksit paradigmasını kullanarak bir stimülasyon tamamlanabilir. Önceki durumda, 1 h glikoz-ücretsiz koşullarda için hücreler ön-inküs 1 h için tedavi tarafından takip edilen glikoza konsantrasyonları ve altında çok az salgıcı aktivite neden olmalıdır 5 mM, artan salgılanması üzerinde gözlenen iken 8 mM glikoz (Şekil 2). 35 mM KCl i...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate at JoVE.com

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Bu protokol, bir insülin bağlantılı gaussia Lusiferaz ile Beta hücrelerinden insülin salgılanması için bir vekil olarak orta verim ile hızlı düşük maliyetli Lusiferaz nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Tahlil en lüminesans plaka okuyucular ve çok kanallı pipetler ile gerçekleştirilebilir.

Bir Co-salgılanmış luciferase Surrogate kullanarak bağıl Insülin salgılanmasını ölçme

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Bu protokol, ilaç keşfini ve karakterizasyonunu hızlandırmak için beta hücre hatlarından insülin salgısını tespit etmek için alternatif bir hızlı yaklaşım tanımlar. Birden fazla tedavi aynı anda test edilebilir, çünkü bu yaklaşım yararlıdır, sonuçlar denemehemen ardından kullanılabilir, ve bu taht diğerlerinden daha uygun fiyatlı. İnsülin salgılayıcılarının yeni küçük molekül modülatörlerinin taranmasına yönelik bu yöntemin uygulanması gelecekteki diyabet tedavileri için kurşun bileşikleri belirleyebilir.Beta hücre fonksiyonunun artan bilgi genel olarak protein veya nörotransmitter salgısını daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir. Bu insülin salgı muhabiri diğer beta hücreleri hatları nda ve insan adacıklarında lentiviral bir sistemde çalışmak üzere kurulmuştur. Bu tsay hücre kültürü ve işletim çok kanallı pipetler aşina bireyler için çok basit olmalıdır.Herhangi bir deney planlamadan önce, ebeveyn veya istikrarlı beta hücre hatları bir insülin ELISA kullanarak glikoz düzgün yanıt olduğunu doğrulayın. Krebs-Ringer Bikarbonat Tampon veya KRBH ve gaussia luciferase çalışma çözümlerini el yazması talimatlara göre hazırlayarak başlayın. Standart hücre kültürü tekniklerini kullanarak T75 şişelerinde MIN6 hücrelerini büyütün.InsGLuc MIN6 hücrelerini PBS ile iki kez hücre bir confluent şişe yıkama ve trypsin iki mililitre ekleyerek kaplama için hazırlayın. Hücreleri yaklaşık beş dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın, ya da hücreler şişeden ayrışana kadar. Hücre konsantrasyonu belirlemek ve mililitre başına bir milyon hücreye tam ortamda hücreleri seyreltmek, hangi eşittir 100 mikrolitre başına 100 mikrolitre bir 96 iyi plaka.Hücreler üç ila dört gün sonra yeterli teşp için confluent olmalıdır. Deneme günü, deney için yeterli glikozsuz KRBH hazırlamak ve bir rezervuar kurmak. 96 kuyu plakasından ortayı hızlı bir şekilde bir laboratuvar lavabosu üzerinde ters çevirerek ve sonra fazla ortamı çıkarmak için kağıt havlu yığını üzerinde sıkıca lekeleyerek çıkarın.Plakayı her kuyuda 100 mikrolitre glikozsuz KRBH ile iki kez yıkayın ve ilaç tedavisi yapıyorsanız, el yazması talimatlara göre KRBH'ye ilaç ekleyin. Daha sonra, her kuyuya 100 mikrolitre glikozsuz KRBH ekleyin ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra tamponu dekant edin ve tabağı kağıt havlunun üzerine dökün.Herhangi bir birikmiş arka plan yıkamak ve daha sonra plaka decant iyi başına glikoz ücretsiz KRBH 100 mikrolitre ekleyin. Kuyu başına 100 mikrolitre de ilaç tedavileri ile veya olmadan kontrol ve uyarıcı koşulları ekleyin ve bir saat boyunca 37 derece santigrat plaka kuluçka. Belirli bir deneydeki hücrelerin yanıt verme yeteneğini belirlemek için her plakaya bazal ve uyarılmış kontroller eklemek önemlidir.Hücreler zaman içinde tepkilerini kaybettiyse, onları taze sıvı nitrojen stoğundan yeniden yetiştirin. Çok kanallı pipet kullanarak 50 mikrolitre süpernatant toplayın, opak beyaz 96 iyi bir test tabağına aktarın ve numuneyi luciferase tsay'ı hazır olana kadar tezgahta oda sıcaklığında tutun. Gerekli miktarda CTZ çözeltisini GLuc istif arabelleğine boru layarak, CTZ'nin ısınmasını önlemeye özen tutarak gaussia luciferase çalışma çözümünün hazırlanın.KRBH süpernatantları ile plakaya GLuc tsay çalışma çözümlerini hızlı bir şekilde eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Kuyuların yanlarında damlacıklar varsa, kısaca bir masa, salıncak kova santrifüj plaka spin. Sonra plaka okuyucu koymak ve 0.1 saniye entegrasyon süresi ile parlaklık okuyun.Bu test, artan glikoz konsantrasyonlarına yanıt olarak insülin salgısını ölçerek kontrol koşulları altında test edilmiştir. Çok az salgı aktivitesi beş milimolar glukozun altında gözlenir ve salgı sekiz milimolar üzerinde artmıştır. Hücreler diazoksit paradigması ile meydan zaman beklenen salgı yanıtı sergiler.Diazoksit tedavisi ekstrasellüler potasyum klorür yoksa insülin salgıını engeller. Potasyum klorür mevcut olduğunda, salgı glikoz daha ilavesi ile güçlendirilebilir. Ayrıca InsGLuc MIN6 hücrelerinin potasyum klorür, diazoksit, PMA ve epinefrin gibi modüle edici bileşiklerin salgılandığı gibi tepki verdiği gösterilmiştir.Bu prosedürü takiben, kritik sonuçlar insülin konsantrasyonlarının belirlenmesine olanak sağlayan antikor bazlı ELISA veya HTRF tahlillerinde KRBH süpernatanları analiz edilerek doğrulanmalıdır. Broad Enstitüsü'ndeki bir grup tarafından bir çok öncü çalışma yapıldı, bu da araştırmamda bu titreyi giderek daha fazla kullanmamın önünü açtı. Biz ve Broad'daki grup da dahil olmak üzere birçok araştırma grubu, bu yaklaşımı diyabet alanında ilaç keşif çalışmalarında kullanmaktadır.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

Membran Biyogenez bir Lusiferaz Tabanlı Reporter Gen Testi ile incelenmesi

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Transfecting RAW264.7 Cells with a Luciferase Reporter Gene

Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...