Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

نشكر كاتي كارول علي المساعدة الفنية. كما نشكر الدكتور ديفيد كول ومختبر تحليل البروبروتيميكس لتعليم وتوفير قارئ لوحه التصوير الخلوي. وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من مؤسسه رايت ستيت (إلى L.E.W.).

1. الكشف عن ايدو باستخدام تسميه الفلورسنت
<ol><li>حلول الأسهم<ol>
<li>اعداد الحل 5 مم ايدو الأسهم عن طريق أضافه 12.5 ملغ من ايدو إلى 10 مل من المقطر مزدوج ه2س.</li>
		<li>اعداد مكونات حل الملصقات: 200 مم تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريازيلميثيل) أمين (THPTA) (100 ملغ في 1.15 mL ح2) ، 100 مم cuso4 (15.95 mg في 1 مل h<sub...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+atherosclerosis+and+the+development+of+preatherosclerotic+intimal+hyperplasia.">Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia.</a> Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).</li><li>Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Techniques+to+assess+cell+proliferation.">Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li><li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+Chemistry:+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality.">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells.">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li><li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry.">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry.">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li><li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+sphingolipid+research.">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry.">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li><li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).</li><li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling.">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li><li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation:+A+Comparative+Study.">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

دمج التعليمية هو وسيله بسيطه ومباشره لقياس انتشار الخلايا. ومن المفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة13. بروتوكولنا يستخدم خلايا العضلات الملساء ، ولكنه ينطبق علي اي خليه ملتصقة (الظهاريه ، بطانية ، الخ). علي الرغم من ان البروتوكول ليس معقدا ، فان الخطوة الحاسمة الواحدة هي صنع حل وضع...

الانتشار هو جزء هام من الوظيفة الخلوية1،2. السيطرة علي الانتشار يؤثر علي العمليات العادية مثل التنمية ، والعمليات المرضية مثل السرطان وامراض القلب والاوعيه الدموية. فرط النمو من خلايا العضلات الملساء الاوعيه الدموية, علي سبيل المثال, ويعتقد ان تكون مقدمه لتصلب الشرايين3. وتستخدم أيضا التغيرات في انتشار الخلايا لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ونظرا لتاثيرها الواسع النطاق ، فان قياس الانتشار هو عماد العديد من المختبرات القائمة علي بيولوجيا الخلايا.
ويمكن قياس تكاثر الخلايا بمجرد عد الزنزانات إذا كان عدد سكان الخلية من الفائدة يقسم بسرعة إلى حد ما. بالنسبة للخلايا البطيءه النمو ، قد تكون عمليات عد الخلايا اقل حساسية. وغالبا ما يقاس الانتشار بإدماج النظير المسمي النيونوسايد. علي الرغم من ان معيار الذهب هو 3H-التاسيس thymidine, العديد من المختبرات الابتعاد عن هذه الطريقة نظرا لتوافر البدائل الأحدث, غير المشعة. وتشمل هذه الاصباغ الفلورية الخلوية ، والكشف عن دوره الخلايا البروتينات المرتبطة بها ، ودمج النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ' ديوكسيريدين (BrdU) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو)4.
الاصباغ الخلوية ، مثل كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات النجاح استر (cfse) ، والكشف عن انتشار لان كثافة نصفين الصبغة في كل مره يقسم الخلية5. ويشيع استخدام هذه التقنية في التدفق الخلوي للخلايا غير الملتصقة. لم يتم استخدامه كثيرا للخلايا الملتصقة ، ولكن مع الجيل الجديد من قراء لوحه التصوير قد يتغير هذا. وغالبا ما يستخدم الكشف عن البروتينات المرتبطة بدوره الخلية من خلال التقنيات القائمة علي الأجسام المضادة (قياس التدفق الخلوي ، مناعي ، الخ) للانسجه أو الخلايا غير الملتصقة. يجب ان تكون هذه الخلايا/الانسجه ثابته وتتخللها قبل تلطيخ. النظائر النيونوسيد BrdU و EdU متشابهة في النهج إلى 3H-الثيميدين ، ولكن من دون إزعاج من النشاط الإشعاعي. يتم الكشف عن دمج BrdU من قبل الأجسام المضادة BrdU ، التالي يجب ان تكون ثابته الخلايا وتتخللها قبل تلطيخ. الاضافه إلى ذلك ، يجب ان تعامل الخلايا مع DNase لفضح مرضبه BrdU.
يتم الكشف عن تاسيس EdU عن طريق النقر الكيمياء ، والتي المجموعات الالكيد وأزيد "انقر" معا في وجود النحاس الحفاز. يمكن لأي من المجموعتين ان تكون بمثابه الجزيء الحيوي المدمج أو جزيء الكشف4. النظائر النيونوسيد المتاحة تجاريا لديها مجموعه الالكاين المرفقة. بالنسبة لاختبارات الانتشار ، لذلك ، يتم الكشف عن التناظرية الوظيفية الالكالي الجانبية من قبل أزيد مترافق إلى صبغه فلورية أو علامة أخرى. دمج التعليمية له العديد من المزايا علي BrdU. أولا ، لأنه لم يتم العثور علي المجموعات الكيميه والأزيد في خلايا الثدييات ، وهذا التفاعل هو محدده للغاية مع خلفيه منخفضه6. لان كلا المجموعتين صغيره ، الخلايا لا تحتاج إلى الخضوع لمسخ الحمض النووي لفضح التناظرية النونوزيد كما هو مطلوب ل BrdU7. وأخيرا ، انقر فوق الكيمياء هو تنوعا للغاية ، ويمكن استخدامها لوضع العلامات الايضيه من الحمض النووي ، RNA ، البروتين ، الأحماض الدهنية ، والكربوهيدرات8،9،10،11. إذا كان الهدف الأيضي المسمي الفائدة علي سطح الخلية ، يمكن تسميه الخلايا الحية12. الاضافه إلى ذلك ، يمكن معالجه الخلايا لتلطيخ النيون المناعي مع الأجسام المضادة.
يصف البروتوكول التالي استخدام التاسيس EdU وانقر فوق الكيمياء لقياس الانتشار في خلايا العضلات الملساء الوعائية البشرية (الشكل 1). نعرض ثلاث طرق مختلفه لدمج ايدو يمكن قياسها ، والنتائج التمثيلية من كل منها ، ومزاياها وعيوبها. قياس الانتشار عن طريق النقر بالكيمياء مفيد بشكل خاص للخلايا الملتصقة والبطيءه النمو. الاضافه إلى ذلك ، يتم الحفاظ علي مورفولوجية الخلية بشكل جيد ويمكن أيضا تلطيخ المضادة للأجسام التي تقوم بها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

قدره الخلية علي التكاثر جزء لا يتجزا من الوظيفة العادية لمعظم الخلايا ، وخلل الانتشار هو في قلب العديد من عمليات المرض. ولهذه الأسباب ، فان قياس الانتشار أداه مشتركه تستخدم لتقييم وظيفة الخلية. ويمكن قياس تكاثر الخلايا ببساطه عن طريق العد ؛ ومع ذلك ، فان هذه وسيله غير مباشره لقياس الانتشار. أحدي الوسائل الشائعة للكشف المباشر عن الخلايا التي تستعد للتقسيم هي عن طريق دمج النظير النيونوسايد المسمي. وتشمل هذه التناظرية النيونوسايد المشعة 3ح-thymidine بالاضافه إلى النظير النيونوسايد غير المشعة مثل 5-برومو-2 ' ديوكسيريدين (brdu) و 5-ethynyl-2′-ديوكسيرادين (ايدو). يتم الكشف عن تاسيس EdU بالنقر علي الكيمياء ، والتي لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع BrdU. وفي هذا التقرير ، نقدم بروتوكولا لقياس الانتشار بدمج النظام التعليمي. ويتضمن هذا البروتوكول خيارات لمختلف القراءات ، إلى جانب مزايا ومساوئ كل منها. ونناقش أيضا الأماكن التي يمكن فيها تحسين البروتوكول أو تغييره لتلبيه الاحتياجات المحددة للتجربة المخطط لها. وأخيرا ، فاننا نلمس الطرق التي يمكن بها تعديل هذا البروتوكول الأساسي لقياس نواتج أيض الخلايا الأخرى.

في الشكل 2، ونحن نظهر نتائج ثلاث تجارب مختلفه قياس انتشار vsmc استجابه ل PDGF. بعد زراعه الخلايا في وسائل الاعلام وضعت ل SMCs ، نفذنا التجربة في المصل DMEM مجانا ، للقضاء علي اي اثار محتمله من المصل أو عوامل النمو علي الانتشار. في الشكل 2A نقارن النتائج ، من نفس التجرب?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

ويشكل الانتشار جزءا هاما من الوظيفة الخلوية ، وقراءه مشتركه تستخدم لتقييم السمية المحتملة للعقاقير الجديدة. ولذلك ، فان قياس الانتشار هو فحص يستخدم بكثرة في بيولوجيا الخلايا. نقدم هنا طريقه بسيطه ومتنوعة لقياس الانتشار يمكن استخدامها في الخلايا الملتصقة وغير الملتصقة.

قياس انتشار خلايا العضلات الملساء الوعائية باستخدام الكيمياء فوق

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

الانتشار هو مقياس مهم لوظيفة الخلية. يسمح هذا البروتوكول للمحققين بتطوير تحليل حساس للانتشار في مختبراتهم دون التكلفة العالية للأطقم المتاحة تجاريًا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتجنب المعاملة القاسية للخلايا و / أو استخدام النشاط الإشعاعي.إثبات هذه التقنية ستكون فيكي وونغ، مديرة مختبري. إلى الانتشار المقايسة, إزالة خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية من قارورة مع وسائط خلية العضلات الملساء في مصل الأبقار الجنينية 2٪ وطبقة في 20,000 خلية لكل ملليلتر في DMEM في لوحة 96-جيدا. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.أضف 30 نانوغرام لكل مليلتر من معامل النمو المشتق من الصفائح الدموية إلى ثلاثة إلى ستة آبار كتحكم إيجابي لتحفيز الانتشار. ثم إضافة برنامج تلفزيوني إلى نفس عدد الآبار كتحكم سلبي. احتضان لمدة 72 ساعة.تم تخفيف مخزون EdU الذي سبق إعداده من خمسة ملليمولار إلى ملليمولار واحد وإضافة اثنين من ميكرولترات إلى كل بئر لآخر 24 ساعة من فترة الثقافة 72 ساعة. احتفظ بمجموعة واحدة من النسخ المتماثلة بدون EdU لتحديد الفلورية والإنارة الخلفية. بعد 24 ساعة، قم بإصلاح الخلايا عن طريق إزالة الوسائط، ثم إضافة 150 ميكرولترات لكل بئر من 4٪ شبهformaldehyde واحتضان 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.إزالة شبهformaldehyde وإضافة 150 ميكرولترات من 1٪ TX-100 في الماء في البئر الواحد واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة TX-100. للكشف عن EdU المدمج باستخدام الفلوريسنس، جعل 10 ملليلتر من وضع العلامات حل لكل لوحة 96-well فقط قبل استخدامها عن طريق إضافة الكواشف من حلول الأسهم في الترتيب الصحيح: 20 microliters THPTA، 20 microliters كبريتات النحاس، خمسة ميكرولتررز الفلوريسين بيكوليل أزيد، و 100 ميكرولترز الصوديوم اسكوربات في PBS لحجم إجمالي قدره 10 ملليلتر.الخطوة الأكثر أهمية هو جعل الحل وضع العلامات قبل الاستخدام. إزالة برنامج تلفزيوني من الآبار، إضافة 150 ميكرولترات من حل وضع العلامات إلى كل بئر واحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. للكشف عن جميع النوى، أضف DAPI إلى كل بئر وصورة على المجهر الفلوري أو قارئ لوحة التصوير.لتجنب العد اليدوي وعندما لا يتوفر قارئ لوحة تصوير، يمكن تعديل هذا البروتوكول إلى قراءة الإنارة باستخدام AZIDE HRP وركيزة ELISA. للكشف عن EdU باستخدام الإنارة، قم أولاً بإعداد محلول ملحي ثلاثي المخزن مع 0.1٪ بوليسوربات 20. ثم إضافة 150 ميكرولترات من العازلة حظر إلى كل بئر واحتضان لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد إزالة العازلة حجب، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. للكشف عن EdU المدمجة، أولا إعداد 10 ملليلتر من حل وضع العلامات لكل لوحة 96-well بإضافة الكواشف من حلول الأسهم في الترتيب الصحيح. أولا، 20 ميكرولترات THPTA، ثم 20 microliters كبريتات النحاس، وخمسة ميكروليترز بيكوليل أزيد، 100 ميكرولترات الصوديوم اسكوربات في برنامج تلفزيوني لحجم إجمالي قدره 10 ملليلتر.غسل الآبار خمس مرات ثلاث دقائق مع 200 ميكرولترات من TBST مع اهتزاز. بيروكسيداسية quench الذاتية مع 150 ميكرولترات من 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة بيروكسيد الهيدروجين، وغسل خمس مرات ثلاث دقائق مع 200 ميكرولترات من TBST مع اهتزاز.إضافة 50 ميكرولترات من بيروكسيديز streptavidin-الفجل المخفف في TBST إلى كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. غسل خمس مرات ثلاث دقائق مع 200 ميكرولترات من TBST مع اهتزاز. إضافة 50 ميكرولترات من الركيزة ELISA chemiluminescent إلى كل بئر وقراءة على الفور في قارئ لوحة قادرة على الكشف عن الإنارة.على الرغم من أنه يمكن الكشف عن النوى الفلورية من قبل قارئ لوحة الفلوريسين القياسية، وذلك باستخدام بروتوكول الإنارة، يتم تحويل المسح الفلوري إلى قراءات سائلة متجانسة تم اكتشافها مع بيروكسيديز streptavidin-horseradish وركيزة ELISA القياسية. وميزة هذه الطريقة مقارنة مع قراءات الفلورسنت هو قراءات أكثر تجانسا ويمكن قراءة لوحة في ثوان كما رأينا هنا عندما تم قياس انتشار VSMC استجابة لPGF. العيب هو أن الخلفية هي أعلى من مع fluorescence ، وبالتالي الضوابط السلبية تميل إلى أن تكون أعلى.في محاولة لتقليل التباين، تم تطبيع النتائج إلى عدد الخلايا الأولية. ومع ذلك، في مجموعة منفصلة من التجارب، فقد تبين أن هذا الأسلوب غير حساس بما يكفي للكشف عن اختلافات صغيرة في أرقام الخلايا. الطريقة الأكثر كفاءة ودقة لحساب الخلايا الإيجابية والإجمالية EdU هي باستخدام قارئ لوحة التصوير.إذا لم يتوفر هذا النوع من قارئ اللوحة، فإن العد اليدوي سيؤدي أيضًا إلى نتائج دقيقة. عند مقارنة هاتين الطريقتين، كان العد اليدوي الموجب لـ EdU مطابقًا للعد الآلي كما كان إجمالي عدد المجاميع غير المُحَرَّة. وميزة هاتين الطريقتين هي رؤية الخلايا التي يتعين عدها، وتحسين الدقة، وأنه يمكن رؤية التلطيخ غير النوعي للحطام وتجنبه.العيب الرئيسي مع طريقة العد اليدوي هو الوقت. تذكر لجعل حل وضع العلامات الطازجة فقط قبل استخدامها وإضافة المكونات في النظام المنصوص عليها في بروتوكول مكتوب. إذا كانت شدة تلطيخ خافتة، حاول ضبط نسبة الشُل إلى النحاس.تذكر أن ما قبل الفورمالدلديهايد هو السامة. وينبغي استخدامه في غطاء الدخان أثناء ارتداء القفازات. الإجراء في حد ذاته ليس من الصعب ولكن قد تحتاج إلى أن تكون الأمثل عن طريق ضبط chelator إلى نسب النحاس في حل وضع العلامات.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل أوقات الحضانة وطول علاج EdU اعتمادًا على نوع الخلية والسؤال المحدد الذي يتم طرحه. هذه التقنية متوافقة مع سطح الخلية والتلطيخ داخل الخلايا بحيث يمكن تحديد خصائص الخلايا المقسمة وغير المقسمة. على الرغم من أن تستخدم عادة لقياس الانتشار، انقر على الكيمياء يمكن أيضا أن تستخدم لوضع العلامات الأيضية من الحمض النووي الريبي والبروتينات والأحماض الدهنية والكربوهيدرات.إذا كان الهدف الأيضي من الفائدة على سطح الخلية، يمكن تسمية الخلايا الحية.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Glycans التصوير في الأجنة التي وصفها اسماك الزرد الاستقلابية والكيمياء Bioorthogonal انقر

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

استكشاف الشرياني العضلات الملساء قناة البوتاسيوم Kv7 الدالة باستخدام المشبك التصحيح الكهربية وتخطيط العضل الضغط

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

التصوير متحد البؤر قياس التقلبات الكالسيوم داخل الهيولى العضلية شبكية من مثقف خلايا العضلات الملساء عن طريق الحنق المستندة إلى

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

الفئران الأرواح سحق إصابة: كفاءة<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج من انتشار الخلايا العضلية السلس والوظيفة البطانية

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...