Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
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我们感谢凯蒂·卡罗尔的技术援助。我们还感谢 David Cool 博士和蛋白质组学分析实验室对 Cytation 成像板阅读器的指导并提供。这项工作得到了赖特州基金会（L.E.W.）赠款的支持。

1. 使用荧光标签检测 EDU
<ol><li>库存解决方案<ol>
<li>通过将 12.5 mg EdU 添加到 10 mL 的双蒸馏 H2O 中，准备 5 mM EdU 库存溶液。</li>
		<li>准备标签溶液组分：200 mM tris（3-羟基苯甲酸酯）胺（THPTA）（100毫克，1.15 mL H2O），100 mM CuSO 4（15.95毫克，1 mL H2O;制作新鲜），10mM Cy3 picolyl-azide（1毫克，在95.3 mL H2O中），储存在-20°C下5μL等分，和1M抗坏血酸钠（200毫克在1mL H<s...

<ol>
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纳入EdU是测量细胞增殖的一种简单、直接的方法;它特别适用于附着细胞13。我们的协议使用平滑肌肉细胞，但它适用于任何粘附细胞（上皮，内皮等）。尽管协议并不复杂，但关键的一步是制作标签解决方案 - 成分必须按列出的顺序添加。此外，像化学发光的西方印迹，如果使用发光读出板必须立即读取。
可以根据需要修改或优化协议的几个部分。其中一?...

增殖是细胞功能1，2的关键部分。控制扩散会影响正常过程，如发育和病理过程，如癌症和心血管疾病。例如，血管平滑肌细胞的超塑性生长被认为是动脉粥样硬化3的前兆。细胞增殖的变化也被用来评估新药的潜在毒性。鉴于其广泛影响，测量增殖是许多基于细胞生物学的实验室的支柱。
如果感兴趣的细胞群分裂得相当快，只需计算细胞，即可测量细胞增殖。对于生长较慢的细胞，细胞计数可能不太敏感。扩散通常通过加入标记的核苷模拟物来衡量。虽然金本标准是3个H-硫酰胺结合，许多实验室正在摆脱这种方法，因为有更新的，非放射性替代品。其中包括细胞质荧光染料，检测细胞周期相关蛋白质，并纳入非放射性核苷类物，如5-bromo-2'脱氧尿碱（BrdU）和5-乙酰-2+-脱氧尿碱（EdU）4。
细胞质染料，如卡博氟西林二乙酸二乙酰乙酯（CFSE），检测增殖，因为染料的强度减半，每次细胞分裂5。此技术通常用于非粘附细胞的流式细胞测定。它并没有被大量用于粘附细胞，但随着新一代成像板读取器，这种情况可能会改变。通过基于抗体的技术（流细胞测定、免疫组织化学等）检测细胞周期相关蛋白，通常用于组织或非粘附细胞。这些细胞/组织在染色前必须固定和渗透。核苷模拟BrdU和EdU在接近3个H-硫酰胺的方法上相似，但没有放射性的不便。BrdU的加入通过抗BrdU抗体检测，因此细胞在染色前必须固定和渗透。此外，细胞必须用DNase处理，以暴露BrdU表位。
EdU的加入通过点击化学检测，其中烷基和阿齐德组在催化铜的存在下"点击"在一起。任一组都可以作为生物合成结合的分子或检测分子4。商业上可用的核苷类物附加了烷基组。因此，对于增殖测定，烷基可功能化核苷模拟被与荧光染料或其他标记物结合的阿齐德检测。与 BrdU 公司多，EdU 的合并有几个优势。首先，由于烷基和阿齐德组在哺乳动物细胞中找不到，这种相互作用在低背景6下是高度特异性的。由于两组都很小，细胞不需要进行DNA变性，以暴露核苷模拟，如BrdU7要求。最后，点击化学是高度通用的，可用于DNA，RNA，蛋白质，脂肪酸和碳水化合物8，9，10，11的代谢标记。如果代谢标记感兴趣的目标在细胞表面，活细胞可以标记为12。此外，细胞可以进一步处理免疫荧光染色与抗体。
以下协议描述了使用EdU合并和点击化学测量人类血管平滑肌细胞的增殖（图1）。我们展示了三种不同的方法，可以衡量EdU的合并，每个方法具有代表性的结果，以及它们的优缺点。通过点击化学测量增殖对于粘附性、生长较慢的细胞特别有用。此外，细胞的形态得到了很好的维护，并且也可以进行基于抗体的染色。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

细胞增殖能力是大多数细胞正常功能的组成部分，增殖障碍是许多疾病过程的核心。由于这些原因，测量增殖是评估细胞功能的常用工具。细胞增殖只需计数即可测量;然而，这是衡量扩散的间接手段。直接检测准备分裂的细胞的一种常见方法就是加入标记的核苷模拟物。其中包括放射性核苷模拟3H-硫酰胺加非放射性核苷模拟物，如5-溴-2'脱氧尿碱（BrdU）和5-乙酰-2+-脱氧尿碱（EdU）。EdU 的加入通过点击化学检测，与 BrdU 相比，它具有几个优点。在本报告中，我们提供了一个协议，用于通过纳入EdU来测量扩散。该协议包括各种读出选项，以及每种读出的优缺点。我们还讨论了可以优化或更改协议以满足计划实验的特定需求的地方。最后，我们来谈谈如何修改这个基本协议来测量其他细胞代谢物。

在图2中，我们演示了三个不同实验的结果，它们测量VSMC在PDGF下的激增。在培养为SMC配制的培养细胞后，我们进行了无血清DMEM实验，以消除血清或生长因子对增殖的任何潜在影响。在图2A中，我们使用荧光与发光读出比较了同一实验的结果。为了读取这些板，我们使用多模微板读取器，可以读取吸光度、荧光和发光（参见材料表）。
<p ...

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Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

增殖是细胞功能的关键部分，也是用于评估新药潜在毒性的常见读物。因此，测量增殖是细胞生物学中常用的测定方法。在这里，我们提出了一种简单、通用的测量增殖方法，可用于附着细胞和非粘附细胞。

使用点击化学测量血管平滑肌细胞增殖

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

增殖是细胞功能的重要指标。该协议允许调查人员在实验室中开发敏感的增殖检测，而无需支付商业上可用的试剂盒的高成本。这种技术的主要优点是避免了对细胞的严厉处理和/或使用放射性。展示这种技术将是VickyWong，我的实验室经理。为了检测增殖，在96井板内DMEM中，以每毫升20，000个细胞取出具有平滑肌肉细胞介质的烧瓶中血管平滑肌肉细胞。一夜之间在37摄氏度下生长细胞。将每毫升血小板30毫微克衍生生长因子添加到三至六孔，作为刺激增殖的正控制。然后将 PBS 添加到与负控相同的井数。孵育72小时。稀释先前准备的五毫摩尔EdU库存到一毫摩尔，并在72小时培养期的最后24小时向每井添加两微升。保持一组没有 EdU 的复制，以确定背景荧光和发光。24小时后，通过去除介质修复细胞，然后每井添加150微升4%对甲醛，并在室温下孵育10分钟。去除甲醛，每井在水中加入150微升1%TX-100，在室温下孵育30分钟。用 PBS 清洗三次以卸下 TX-100。要使用荧光检测合并的 EdU， 在使用前，通过按正确的顺序添加库存溶液中的试剂，每96井板生产10毫升标签溶液：20微升THPTA、20微升铜硫酸盐、5微升氟化丝丙烯酸酯和100微升磷酸钠，总体积为10毫升。最关键的一步是在使用前制定标签解决方案。从井中去除PBS，在每口井中加入150微升标签溶液，并在37摄氏度下孵育30分钟。要检测所有核，请在每个井中添加 DAPI，并在荧光显微镜或成像板读卡器上添加图像。为了避免手动计数，当成像板读取器不可用时，可以使用 HRP azide 和 ELISA 基板将该协议修改为发光读出。要使用亮度检测 EdU，首先准备三聚盐水与 0.1% 多糖酸 20。然后向每井添加150微升的阻尼缓冲液，并在室温下孵育90分钟。取出阻塞缓冲液后，用200微升PBS清洗细胞三次。要检测整合的 EdU，首先通过按正确的顺序添加库存溶液中的试剂，准备每 96 井板 10 毫升标签解决方案。首先，20微升THPTA，然后20微升硫酸铜，5微升生物素皮二醇-二氧化氮，100微升钠抗坏血胶到PBS的总体积为10毫升。用200微升的TBST用震动洗井五次三分钟。在室温下用150微升0.3%过氧化氢淬火内源性过氧化物20分钟。去除过氧化氢后，用200微升的TBST用震动洗涤5次，3分钟。在每孔中加入50微升稀释的链球菌素-马萝卜过氧化物酶，并在室温下孵育一小时。用 200 微升的 TBST 用震动洗五次三分钟。将 50 微升的化学发光 ELISA 基板添加到每个井中，并立即在能够检测发光的板读卡器中读取。虽然荧光核可以通过标准荧光板读取器检测，但使用发光方案，荧光扫描被转换为用链球菌素-马萝卜过氧化物酶和标准ELISA基质检测出的均匀液体读出。与荧光读出相比，此方法的优点是更均匀的读出，当测量 VSMC 响应 PDGF 的增殖时，可以在几秒钟内读取该板。缺点是背景高于荧光，因此负控制往往更高。为了减少变异性，结果被规范化为初始细胞计数。然而，在一组单独的实验中，它表明这种方法不够敏感，无法检测细胞数的小差异。计算EdU阳性和总细胞的最有效和最准确的方法是使用成像板读卡器。如果没有这种类型的板读卡器，手动计数也将产生准确的结果。比较这两种方法时，EdU 正手动计数与自动计数相同，未加速计数的总计数相同。这两种方法的优点是可计数的细胞的可见性，提高了精度，并可以看到和避免了碎片的非特异性染色。手动计数方法的主要缺点是时间。请记住，在使用前使标签解决方案新鲜，并按书面协议中提供的顺序添加成分。如果染色强度暗淡，请尝试调整切合器与铜的比例。请记住，甲醛是有毒的。戴手套时应用在烟罩中。该过程本身并不难，但可能需要通过调整贴标溶液中的溷合器与铜比来优化。此外，EdU 治疗的孵化时间和长度可以根据细胞类型和所问的具体问题进行调整。该技术与细胞表面和细胞内染色兼容，因此可以确定分裂和非分裂细胞的特性。虽然通常用于测量增殖，但点击化学也可用于RNA、蛋白质、脂肪酸和碳水化合物的代谢标记。如果感兴趣的代谢靶点在细胞表面，活细胞可以标记。

Research

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Biology

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在斑马鱼胚胎的代谢标记和Bioorthogonal点击化学成像聚糖

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Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

探讨动脉平滑肌的KV7钾离子通道功能使用膜片钳电生理和压力Myography

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