Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Vi takker Katie Carroll for teknisk assistance. Vi takker også Dr. David cool og proteomics analyselaboratorium for instruktion om og tilvejebringelse af Cytation Imaging Plate Reader. Dette arbejde blev støttet af en Wright State Foundation Grant (til L.E.W.).

1. påvisning af EdU ved hjælp af fluorescerende label
<ol><li>Stam løsninger<ol>
<li>Forbered en 5 mM EdU-stamopløsning ved at tilsætte 12,5 mg EdU til 10 mL dobbeltdestilleret H2O.</li>
		<li>Klargør komponenterne til mærknings løsningen: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) (100 mg i 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg i 1 ml h2o; Lav frisk), 10 mm Cy3 picolyl-azid (1 mg i 95,3 ml h2o , opbevaret i 5 μL aliquoter ved-20 °C) og 1 M ...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+atherosclerosis+and+the+development+of+preatherosclerotic+intimal+hyperplasia.">Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia.</a> Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).</li><li>Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Techniques+to+assess+cell+proliferation.">Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li><li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+Chemistry:+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality.">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells.">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li><li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry.">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry.">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li><li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+sphingolipid+research.">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry.">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li><li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).</li><li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling.">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li><li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation:+A+Comparative+Study.">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

Inkorporering af EdU er en enkel og ligetil måde at målecelle spredning på; Det er især nyttigt for vedsiddende celler13. Vores protokol bruger glatte muskelceller, men det gælder for enhver overholder celle (epitelial, endotelal, etc.). Selv om protokollen ikke er kompliceret, det ene kritiske skridt er at gøre mærkningen løsning-ingredienserne skal tilføjes i den anførte rækkefølge. Hertil kommer, ligesom kemiluminescens Western blots, hvis du bruger luminescens udlæsning pladen ska...

Spredning er en kritisk del af cellulære funktion1,2. Kontrol af spredning påvirker normale processer såsom udvikling, og patologiske processer såsom kræft og hjerte-kar-sygdom. Hyperplastisk vækst af vaskulære glatte muskelceller, for eksempel, menes at være en forløber for åreforkalkning3. Ændringer i celle spredning anvendes også til at vurdere potentiel toksicitet af nye lægemidler. I betragtning af dens udbredte virkning er måling af spredning en grundpille i mange cellebiologi-baserede laboratorier.
Celle spredning kan måles ved blot at tælle celler, hvis celle populationen af interesse dividerer ret hurtigt. For langsommere vækst celler kan celletal være mindre følsomt. Spredning måles ofte ved inkorporering af mærkede nukleosid analover. Selv om guldstandarden er 3H-thymidin inkorporering, mange laboratorier er at komme væk fra denne metode i betragtning af tilgængeligheden af nyere, ikke-radioaktive alternativer. Disse omfatter cytoplasmiske fluorescerende farvestoffer, påvisning af celle cyklus associerede proteiner, og inkorporering af ikke-radioaktive nukleosid analoner såsom 5-brom-2 ' og (brdu) og 5-ethynyl-2′-og (EdU)4.
Cytoplasmiske farvestoffer, såsom carboxyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFSE), detektere spredning, fordi intensiteten af farvestoffet halvdele hver gang cellen deler5. Denne teknik er almindeligt anvendt i flow cytometri for ikke-vedlige celler. Det har ikke været brugt meget for vedlige celler, men med den nye generation af billedplade læsere dette kan ændre sig. Påvisning af celle cyklus associerede proteiner gennem antistof-baserede teknikker (flow cytometri, immun histokemi, etc.) bruges ofte til væv eller ikke-vedhørende celler. Disse celler/væv skal fastgøres og permeabiliseres før farvning. Nukleosid analover BrdU og EdU er ens i tilgang til 3H-thymidin, men uden besværet med radioaktivitet. Inkorporering af BrdU påvises ved anti-BrdU antistoffer, og derfor skal cellerne fastgøres og permeabilized før farvning. Desuden skal cellerne behandles med DNase for at afsløre BrdU epitope.
Inkorporering af EdU detekteres ved at klikke kemi, hvor eller og Azid grupper "Klik" sammen i nærværelse af katalytisk kobber. Begge grupper kan fungere som det biosynthetisk indarbejdet molekyle eller detekterings molekyle4. Kommercielt tilgængelige nukleosid analoner har eller gruppen vedhæftet. For sprednings assays detekteres eller-funktionaliserede nukleosid analog ved en Azid, der er konjugeret til et fluorescerende farvestof eller en anden markør. Inkorporering af EdU har flere fordele i forhold til BrdU. For det første, fordi eller-og Azid-grupper ikke findes i pattedyrsceller, er denne interaktion meget specifik med en lav baggrund6. Da begge grupper er små, behøver cellerne ikke at gennemgå DNA-denaturering for at udsætte nukleosid-analog som krævet for BrdU7. Endelig, klik kemi er meget alsidig, og kan bruges til metabolisk mærkning af DNA, RNA, protein, fedtsyrer, og kulhydrater8,9,10,11. Hvis det metabolisk mærkede mål af interesse er på cellens overflade, kan levende celler mærkes12. Derudover kan cellerne forarbejdes yderligere til immunfluorescent farvning med antistoffer.
Følgende protokol beskriver brugen af EdU inkorporering og klik kemi at måle spredning i humane vaskulære glatte muskelceller (figur 1). Vi viser tre forskellige måder inkorporering af EdU kan måles, repræsentative resultater fra hver, og deres fordele og ulemper. Måling af spredning via Klik kemi er især nyttig for klædige, langsommere voksende celler. Desuden er den morfologi af cellen velholdt og antistof-baseret farvning kan også udføres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

Evnen af en celle til at formere sig er en integrerende del af den normale funktion af de fleste celler, og dysregulering af spredning er kernen i mange sygdomsprocesser. Af disse grunde er måling af spredning et fælles værktøj, der anvendes til at vurdere celle funktionen. Celle proliferation kan måles ved blot at tælle; Dette er imidlertid et indirekte middel til at måle spredning. Et almindeligt middel til direkte påvisning af celler, der forbereder sig på at opdele, er ved inkorporering af mærkede nukleosid-analoner. Disse omfatter den radioaktive nukleosid analog 3H-thymidin plus ikke-radioaktive nukleosid analoner såsom 5-brom-2 ' og (brdu) og 5-ethynyl-2′-og (EdU). Inkorporering af EdU opdages ved at klikke kemi, som har flere fordele i forhold til BrdU. I denne betænkning fremlægger vi en protokol til måling af spredning ved inkorporering af EdU. Denne protokol indeholder muligheder for forskellige udlæsninger, sammen med fordele og ulemper ved hver. Vi diskuterer også steder, hvor protokollen kan optimeres eller ændres for at imødekomme de specifikke behov i det planlagte eksperiment. Endelig, vi rører på de måder, at denne grundlæggende protokol kan ændres til måling af andre celle metabolitter.

I figur 2viser vi resultaterne af tre forskellige eksperimenter, som måler udbredelsen af VSMC som svar på PDGF. Efter dyrkning af cellerne i medierne formuleret til SMCs, vi udførte forsøget i serum fri DMEM, at eliminere eventuelle virkninger af serum eller vækstfaktorer på spredning. I figur 2a sammenligner vi resultater, fra det samme eksperiment, ved hjælp af en fluorescerende vs lysende viser udlæser. For at læse disse plader brugte vi en mikropla...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Spredning er en kritisk del af cellulær funktion, og en fælles udlæser bruges til at vurdere potentielle toksicitet af nye lægemidler. Måling af spredning er derfor en hyppigt anvendt analyse i cellebiologi. Her præsenterer vi en enkel, alsidig metode til måling af spredning, der kan anvendes i vedlige og ikke-vedlige celler.

Måling af spredning af vaskulære glatte muskelceller ved hjælp af Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Spredning er et vigtigt mål for cellefunktionen. Denne protokol giver efterforskere mulighed for at udvikle en følsom spredning assay i deres laboratorier uden de høje omkostninger ved kommercielt tilgængelige kits. Den største fordel ved denne teknik er, at den undgår hård behandling af celler og/eller brug af radioaktivitet.Demonstration af denne teknik vil være Vicky Wong, lederen af mit laboratorium. Til analyseprolifererende spredning fjernes vaskulære glatte muskelceller fra en kolbe med glatte muskelcellemedier i 2% føtalt kvægserum og plade ved 20.000 celler pr. milliliter i DMEM i en 96-brøndplade. Dyrk cellerne ved 37 grader Celsius natten over.Tilføj 30 nanogram pr. milliliter trombocyt afledt vækstfaktor til tre til seks brønde som en positiv kontrol for at stimulere spredning. Tilføj derefter PBS til det samme antal brønde som et negativt kontrolelement. Inkuber i 72 timer.Fortynd tidligere forberedt fem millimolar EdU lager til en millimolar og tilsæt to mikroliter til hver brønd for de sidste 24 timer af 72 timers kultur periode. Hold et sæt replikater uden EdU for at bestemme baggrundsfluorescens og luminescens. Fireogtyve timer senere, fastsætte cellerne ved at fjerne medier, derefter tilføje 150 mikroliter pr brønd på 4% paraformaldehyd og inkubere 10 minutter ved stuetemperatur.Fjern paraformaldehyd og tilsæt 150 mikroliter på 1% TX-100 i vand pr brønd og inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter. Vask tre gange med PBS for at fjerne TX-100. For at detektere indarbejdet EdU ved hjælp af fluorescens lave 10 milliliter mærkningsopløsning pr. 96-brøndplade lige før brug ved at tilføje reagenser fra lageropløsninger i den rigtige rækkefølge:20 mikroliter THPTA, 20 mikroliters kobbersulfat, fem mikroliters fluorecein picolyl-azid og 100 mikroliters natriumscorbat i PBS for et samlet volumen på 10 milliliter.Det mest kritiske skridt er at gøre mærkning løsning lige før brug. Fjern PBS fra brønde, tilsæt 150 mikroliter mærkningsopløsning til hver brønd og inkuber 30 minutter ved 37 grader Celsius. Hvis du vil registrere alle kerner, skal du tilføje DAPI til hver brønd og et billede på et fluorescerende mikroskop eller billedpladelæser.For at undgå manuel optælling, og når en billedpladelæser ikke er tilgængelig, kan denne protokol ændres til en luminescensudlæsning ved hjælp af HRP azide og et ELISA-substrat. Hvis du vil registrere EdU ved hjælp af luminscens, skal du først forberede saltvand med tris-buffer med 0,1 % polysorbat 20. Derefter tilsættes 150 mikroliter af blokerende buffer til hver brønd og inkuberes i 90 minutter ved stuetemperatur.Efter fjernelse af blokeringsbufferen vaskes cellerne tre gange med 200 mikroliter PBS. For at detektere indarbejdet EdU skal du først forberede 10 milliliter mærkningsopløsning pr. 96-brøndplade ved at tilsætte reagenser fra lagerløsninger i den rigtige rækkefølge. Først 20 mikroliter THPTA, derefter 20 mikroliters kobbersulfat, fem mikroliter biotin picolyl-azide, 100 mikroliters natrium ascorbat i PBS for et samlet volumen på 10 milliliter.Vaskes godt fem gange tre minutter med 200 mikroliter TBST med omrystning. Dæmpning endogene peroxidaser med 150 mikroliter på 0,3% hydrogenperoxid i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter fjernelse af hydrogenperoxid vaskes fem gange tre minutter med 200 mikroliter TBST med omrystning.Der tilsættes 50 mikroliter fortyndet streptavidin-peberrodsperoxidase i TBST til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i en time. Vask fem gange tre minutter med 200 mikroliter TBST med omrystning. Tilsæt 50 mikroliter af chemiluminescerende ELISA underlag til hver brønd og læs straks i en pladelæser, der er i stand til at detektere luminescens.Selv om fluorescerende kerner kan detekteres af en standard fluorescens pladelæser, ved hjælp af luminescens protokol, fluorescerende scanning omdannes til en homogen flydende udlæsning opdaget med streptavidin-peberrod peroxidase og en standard ELISA substrat. Fordelen ved denne metode i forhold til en fluorescerende udlæsning er en mere homogen udlæsning, og pladen kan aflæses på få sekunder, som det ses her, da spredning af VSMC som svar på PDGF blev målt. Ulempen er, at baggrunden er højere end med fluorescens, således negative kontroller tendens til at være højere.I et forsøg på at reducere variabiliteten blev resultaterne normaliseret til indledende celletal. I et separat sæt af eksperimenter blev det imidlertid påvist, at denne metode ikke er følsom nok til at opdage små forskelle i celletal. Den mest effektive og præcise måde at tælle EdU-positive og samlede celler på er ved hjælp af en billedpladelæser.Hvis denne type pladelæser ikke er tilgængelig, vil manuel optælling også give nøjagtige resultater. Når man sammenligner disse to metoder, var EdU-positive manuelle tal identisk med det automatiske antal, og det samme var de samlede ustimulerede optællinger. Fordelen ved disse to metoder er synligheden af de celler, der skal tælles, forbedret nøjagtighed, og at uspecifik farvning af snavs kan ses og undgås.Den største ulempe ved den manuelle optællingsmetode er tid. Husk at gøre mærkningsopløsningen frisk lige før brug, og tilsæt ingredienserne i den rækkefølge, der er angivet i den skriftlige protokol. Hvis intensiteten af farvning er svag, kan du prøve at justere chelatoren til kobberforholdet.Husk, at paraformaldehyd er giftigt. Det bør anvendes i en røghætte, mens iført handsker. Selve proceduren er ikke vanskelig, men skal muligvis optimeres ved at justere chelator-til-kobberforholdet i mærkningsopløsningen.Desuden kan inkubationstider og længden af EdU-behandling justeres afhængigt af celletypen og det specifikke spørgsmål, der stilles. Denne teknik er kompatibel med celleoverfladen og den intracellulære farvning, således at egenskaberne ved at dividere og ikke-dividere celler kan bestemmes. Selv om almindeligt anvendt til at måle spredning, klik kemi kan også bruges til metabolisk mærkning af RNA, proteiner, fedtsyrer og kulhydrater.Hvis det metaboliske mål af interesse er på celleoverfladen, levende celler kan mærkes.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Udforskning arteriernes glatte muskulatur Kv7 kaliumkanal Funktion hjælp Patch Clamp Elektrofysiologi og Pressure Myography

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering af pulmonal glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Måling af Glat muskel funktion i den isolerede vævsbad-ansøgninger til Farmakologi Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

To-foton Imaging af intracellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Håndtering og nitrogenoxid Produktion i Endothelial og glatte muskelceller af en isoleret rotteaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Måling af calcium Udsving Inden for reticulum af dyrkede glatte muskelceller Brug FRET-baserede Konfokal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering af murint koronar vaskulær glat muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Skade: En Effektiv<em&gt; In vivo</em&gt; Model af smidig muskelcelle proliferation og endotelfunktion

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...