Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Wij danken Katie Carroll voor technische assistentie. We danken ook Dr. David cool en het Proteomics Analyselaboratorium voor instructie over en het leveren van de Cytation Imaging Plate Reader. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Wright State Foundation (aan L.E.W.).

1. detectie van EdU met fluorescerende label
<ol><li>Stock oplossingen<ol>
<li>Bereid een 5 mM EdU-stamoplossing voor door 12,5 mg EdU toe te voegen aan 10 mL dubbel gedestilleerd H2O.</li>
		<li>Bereid de etiketteringsoplossing componenten: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg in 1 ml h2o; vers maken), 10 mm Cy3 picolyl-azide (1 mg in 95,3 ml h2o , opgeslagen in 5 μL aliquots bij-20 °C) en 1 M...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+atherosclerosis+and+the+development+of+preatherosclerotic+intimal+hyperplasia.">Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia.</a> Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).</li><li>Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Techniques+to+assess+cell+proliferation.">Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li><li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+Chemistry:+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality.">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells.">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li><li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry.">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry.">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li><li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+sphingolipid+research.">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry.">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li><li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).</li><li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling.">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li><li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation:+A+Comparative+Study.">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

De integratie van EdU is een eenvoudige en ongecompliceerde manier om celproliferatie te meten; het is vooral handig voor het aanhechting van cellen13. Ons protocol maakt gebruik van gladde spiercellen, maar het is van toepassing op elke aanhandige cel (epitheliale, endotheel, enz.). Hoewel het protocol niet ingewikkeld is, is het een cruciale stap om de etiketteringsoplossing te maken-de ingrediënten moeten in de aangegeven volgorde worden toegevoegd. Bovendien, zoals chemiluminescentie Western ...

Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie1,2. Beheersing van proliferatie beïnvloedt normale processen zoals ontwikkeling en pathologische processen zoals kanker en hart-en vaatziekten. Hyperkunststof groei van vasculaire gladde spiercellen, bijvoorbeeld, wordt beschouwd als een voorloper van atherosclerose3. Veranderingen in celproliferatie worden ook gebruikt om de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen te beoordelen. Gezien de wijdverbreide impact, is het meten van de proliferatie een pijlers van veel op cel biologie gebaseerde laboratoria.
Celproliferatie kan worden gemeten door eenvoudigweg cellen te tellen als de celpopulatie van belang vrij snel verdeelt. Voor langzamere groeicellen kunnen celtellingen minder gevoelig zijn. Proliferatie wordt vaak gemeten door opneming van gelabelde nucleoside analogen. Hoewel de gouden standaard 3H-thymidine-integratie is, komen veel laboratoria weg van deze methode gezien de beschikbaarheid van nieuwere, niet-radioactieve alternatieven. Deze omvatten cytoplasmische fluorescerende kleurstoffen, detectie van celcyclus geassocieerde eiwitten, en opname van niet-radioactieve nucleoside analogen zoals 5-broom-2 ' deoxyuridine (BrdU) en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
Cytoplasmische kleurstoffen, zoals carboxyfluoresceïne DIACETAAT succinimidyl Ester (CFSE), detectie van proliferatie omdat de intensiteit van de kleurstof helften elke keer dat de cel verdeelt5. Deze techniek wordt vaak gebruikt in flow cytometrie voor niet-aanhandige cellen. Het is niet veel gebruikt voor aanhandige cellen, maar met de nieuwe generatie van beeldvormings plaat lezers kan dit veranderen. Detectie van celcyclus geassocieerde eiwitten door middel van op antilichamen gebaseerde technieken (Flowcytometrie, immunohistochemie, enz.) wordt vaak gebruikt voor weefsels of niet-aanhangend cellen. Deze cellen/weefsels moeten voorafgaand aan de kleuring worden vast en permeabiliseerd. Nucleoside analogen BrdU en EdU zijn vergelijkbaar in benadering van 3H-thymidine, maar zonder het ongemak van radioactiviteit. De opname van BrdU wordt gedetecteerd door anti-BrdU-antilichamen en daarom moeten de cellen voorafgaand aan de kleuring worden bevestigd en permeabiliseerd. Bovendien moeten de cellen met DNase worden behandeld om de BrdU epitope bloot te leggen.
De oprichting van EdU wordt gedetecteerd doorklik chemie, waarin alkyn en natriumazide groepen "Klik" samen in de aanwezigheid van katalytisch koper. Beide groepen kunnen dienen als het biosynthetisch opgenomen molecuul of detectie molecuul4. In de handel verkrijgbare nucleoside-analogen hebben de alkyn-groep bijgevoegd. Voor proliferatie assays, daarom, de alkyn Gefunctionaliseerde Nucleoside analoog wordt gedetecteerd door een natriumazide geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof of andere marker. De oprichting van EdU heeft verschillende voordelen ten opzichte van BrdU. Ten eerste, omdat alkyn-en natriumazide-groepen niet in zoogdiercellen worden aangetroffen, is deze interactie zeer specifiek met een lage achtergrond6. Omdat beide groepen klein zijn, hoeven cellen geen DNA denaturatie te ondergaan om de Nucleoside analoog bloot te leggen zoals vereist voor BrdU7. Tot slot, klik chemie is zeer veelzijdig, en kan worden gebruikt voor de metabole labeling van DNA, RNA, eiwitten, vetzuren, en koolhydraten8,9,10,11. Als het metabosch gelabelde doel van belang is op het celoppervlak, kunnen levende cellen worden gelabeld12. Bovendien kunnen cellen verder worden verwerkt voor immunofluorescentie kleuring met antilichamen.
Het volgende protocol beschrijft het gebruik van EdU-integratie en klik op chemie om proliferatie in menselijke vasculaire gladde spiercellen te meten (Figuur 1). We tonen drie verschillende manieren waarop de integratie van EdU kan worden gemeten, representatieve resultaten van elk, en hun voor-en nadelen. Het meten van proliferatie via Klik chemie is vooral handig voor aanhangend, langzamer groeiende cellen. Daarnaast is de morfologie van de cel goed onderhouden en kan ook op antilichamen gebaseerde vlekken worden uitgevoerd.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

Het vermogen van een cel om te vermenigvuldigen is een integraal onderdeel van de normale functie van de meeste cellen, en disregulatie van proliferatie is de kern van vele ziekteprocessen. Om deze redenen, het meten van de proliferatie is een gemeenschappelijk instrument gebruikt om te beoordelen van de functie van de cel. Celproliferatie kan eenvoudig worden gemeten door te tellen; Dit is echter een indirecte manier om de proliferatie te meten. Een veelgebruikte manier van het direct opsporen van cellen die zich voorbereiden op te splitsen is door toevoeging van gelabelde nucleoside analogen. Deze omvatten de radioactieve nucleoside analoge 3H-thymidine plus niet-radioactieve nucleoside analogen zoals 5-broom-2 ' deoxyuridine (Brdu) en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU). De integratie van EdU wordt gedetecteerd doorklik chemie, die verschillende voordelen heeft in vergelijking met BrdU. In dit verslag bieden we een protocol voor het meten van de proliferatie door de integratie van EdU. Dit protocol bevat opties voor verschillende uitlezingen, samen met de voor-en nadelen van elk. We bespreken ook plaatsen waar het protocol kan worden geoptimaliseerd of gewijzigd om te voldoen aan de specifieke behoeften van het geplande experiment. Ten slotte raken we aan de manieren waarop dit basisprotocol kan worden aangepast voor het meten van andere celmetabolieten.

In Figuur 2tonen we de uitkomsten van drie verschillende experimenten die de proliferatie van VSMC in reactie op pdgf meten. Na het kweken van de cellen in Media geformuleerd voor Smc's, hebben we het experiment uitgevoerd in serum vrije DMEM, om mogelijke effecten van serum of groeifactoren op proliferatie te elimineren. In Figuur 2a vergelijken we resultaten, van hetzelfde experiment, met behulp van een fluorescerende VS luminescente uitlezen. Om deze platen t...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie, en een gemeenschappelijke uitlezen gebruikt om te beoordelen van de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen. Het meten van de proliferatie is daarom een vaak gebruikte assay in celbiologie. Hier presenteren we een eenvoudige, veelzijdige methode voor het meten van de proliferatie die kan worden gebruikt in aanhandige en niet-aanhantende cellen.

Het meten van de proliferatie van vasculaire gladde spiercellen met behulp van klik chemie

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Proliferatie is een belangrijke maat voor de celfunctie. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om een gevoelige proliferatietest in hun laboratoria te ontwikkelen zonder de hoge kosten van commercieel beschikbare kits. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een harde behandeling van cellen en/of het gebruik van radioactiviteit vermijdt.Het aantonen van deze techniek zal Vicky Wong zijn, de manager van mijn laboratorium. Om proliferatie te testen, verwijder vasculaire gladde spiercellen uit een kolf met gladde spiercelmedia in 2%foetaal runderserum en plaat bij 20.000 cellen per milliliter in DMEM in een 96-putplaat. Laat de cellen 's nachts groeien op 37 graden Celsius.Voeg 30 nanogram per milliliter bloedplaatjes afgeleide groeifactor aan drie tot zes putten als een positieve controle om proliferatie te stimuleren. Voeg vervolgens PBS toe aan hetzelfde aantal putten als een negatieve controle. 72 uur lang incubeer.Verdun eerder bereide vijf millimolar EdU voorraad tot een millimolar en voeg twee microliters aan elke put voor de laatste 24 uur van de 72 uur cultuur periode. Houd een set van replica's zonder EdU om achtergrond fluorescentie en luminescentie te bepalen. Vierentwintig uur later, fix de cellen door het verwijderen van media, dan het toevoegen van 150 microliters per put van 4% paraformaldehyde en incubaat 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder de paraformaldehyde en voeg 150 microliter van 1%TX-100 toe in water per put en incubeer 30 minuten op kamertemperatuur. Was drie keer met PBS om de TX-100 te verwijderen. Om opgenomen EdU op te sporen met behulp van fluorescentie, maken 10 milliliter etikettering oplossing per 96-well plaat net voor gebruik door het toevoegen van reagentia uit voorraad oplossingen in de juiste volgorde:20 microliter THPTA, 20 microliter kopersulfaat, vijf microliter fluoresceïne picolyl-azide, en 100 microliter natrium ascorbate in PBS voor een totaal volume van 10 milliliter.De meest kritieke stap is om de etiketteringsoplossing vlak voor gebruik te maken. Verwijder PBS uit putten, voeg 150 microliter etiketteringsoplossing toe aan elke put en broed 30 minuten uit bij 37 graden Celsius. Om alle kernen te detecteren, voeg DAPI toe aan elke put en afbeelding op een fluorescerende microscoop of beeldplaatlezer.Om handmatig tellen te voorkomen en wanneer een beeldplaatlezer niet beschikbaar is, kan dit protocol worden aangepast aan een luminescentieuitlezing met behulp van HRP-azide en een ELISA-substraat. Om EdU te detecteren met behulp van luminscence, eerst voorbereiden tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% polysorbate 20. Voeg vervolgens 150 microliter blokkeerbuffer toe aan elke put en broed gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.Na het verwijderen van de blokbuffer, was de cellen drie keer met 200 microliter PBS. Om de ingebouwde EdU op te sporen, moet u eerst 10 milliliter etiketteringsoplossing per 96-putplaat voorbereiden door reagentia uit voorraadoplossingen in de juiste volgorde toe te voegen. Eerst 20 microliters THPTA, dan 20 microliter kopersulfaat, vijf microliters biotine picolyl-azide, 100 microliters natrium ascorbaat in PBS voor een totaal volume van 10 milliliter.Was putten vijf keer drie minuten met 200 microliters van TBST met schudden. Doof endogene peroxidases met 150 microliter van 0,3% waterstofperoxide gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van waterstofperoxide, was vijf keer drie minuten met 200 microliter van TBST met schudden.Voeg 50 microliters verdunde streptavidin-mierikswortelperoxidase in tbst toe aan elke put en broed een uur bij kamertemperatuur in. Was vijf keer drie minuten met 200 microliters van TBST met schudden. Voeg 50 microliter van chemiluminescent ELISA substraat toe aan elke put en lees onmiddellijk in een plaatlezer die luminescentie kan detecteren.Hoewel fluorescerende kernen kunnen worden gedetecteerd door een standaard fluorescentieplaatlezer, wordt de fluorescerende scan met behulp van het luminescentieprotocol omgezet in een homogene vloeistofuitlezing die wordt gedetecteerd met streptavidin-mierikswortel peroxidase en een standaard ELISA-substraat. Het voordeel van deze methode in vergelijking met een fluorescerende uitlezing is een meer homogene uitlezing en de plaat kan worden gelezen in seconden zoals hier te zien wanneer de proliferatie van VSMC in reactie op PDGF werd gemeten. Het nadeel is dat de achtergrond hoger is dan bij fluorescentie, dus negatieve controles zijn meestal hoger.In een poging om de variabiliteit te verminderen, werden de resultaten genormaliseerd tot de eerste celtellingen. In een aparte reeks experimenten werd echter aangetoond dat deze methode niet gevoelig genoeg is om kleine verschillen in celnummers op te sporen. De meest efficiënte en nauwkeurige manier om EdU positieve en totale cellen te tellen is met behulp van een imaging plaatlezer.Als dit type plaatlezer niet beschikbaar is, zal handmatig tellen ook nauwkeurige resultaten opleveren. Bij het vergelijken van deze twee methoden, de EdU positieve handmatige telling was identiek aan de geautomatiseerde telling net als de totale niet-geprikkelde telt. Het voordeel van deze twee methoden is de zichtbaarheid van de cellen te tellen, verbeterde nauwkeurigheid, en dat niet-specifieke kleuring van puin kan worden gezien en vermeden.Het belangrijkste nadeel van de handmatige telmethode is tijd. Vergeet niet om de etiketteringsoplossing vlak voor gebruik vers te maken en de ingrediënten toe te voegen in de volgorde in het geschreven protocol. Als de intensiteit van de kleuring is zwak, probeer het aanpassen van de chelator koper verhouding.Vergeet niet dat paraformaldehyde giftig is. Het moet worden gebruikt in een rookkap tijdens het dragen van handschoenen. De procedure zelf is niet moeilijk, maar moet mogelijk worden geoptimaliseerd door de chelator-aan-koperverhoudingen in de etiketteringsoplossing aan te passen.Bovendien kunnen incubatietijden en lengte van de EdU-behandeling worden aangepast afhankelijk van het celtype en de specifieke vraag die wordt gesteld. Deze techniek is compatibel met celoppervlak en intracellulaire kleuring, zodat de kenmerken van scheidings- en niet-delende cellen kunnen worden bepaald. Hoewel vaak gebruikt om proliferatie te meten, klik chemie kan ook worden gebruikt voor de metabole etikettering van RNA, eiwitten, vetzuren en koolhydraten.Als het metabolische doelwit van belang is op het celoppervlak, levende cellen kunnen worden gelabeld.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focus Ca 2 + Voorbijgaande Detectie in glad spierweefsel

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolatie van de Mens Umbilical arteriële gladde spiercellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycanen in zebravis embryo&#39;s door metabole Labeling en Bioorthogonal Klik Chemie

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Meting van de gladde spieren Functie in het Geïsoleerde Tissue Bath-applicaties om Farmacologie Onderzoek

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Twee-foton Imaging van intracellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Behandeling en stikstofoxide productie in endotheelcellen en gladde spiercellen van een geïsoleerd Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Meting van Calcium Schommelingen Binnen het sarcoplasmareticulum van gekweekte gladde spiercellen Met behulp van FRET-gebaseerde confocale Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: Een Efficiënt<em&gt; In Vivo</em&gt; Model van gladde spiercel proliferatie en endotheliale functie

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...