Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
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Nous remercions Katie Carroll pour son assistance technique. Nous remercions également le Dr David Cool et le Laboratoire d'analyse de la protéomique pour l'instruction et la fourniture du lecteur de plaques d'imagerie Cytation. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Wright State Foundation (à L.E.W.).

1. Détection de l'EdU à l'aide d'une étiquette fluorescente
<ol><li>Solutions boursières<ol>
<li>Préparer une solution de 5 mM EdU en ajoutant 12,5 mg d'EdU à 10 ml de H2O double distillé.</li>
		<li>Préparer les composants de la solution d'étiquetage : 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg en 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg en 1 mL H2O; faire frais), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg en 95,3 m L2L , stocké dans 5 aliquots ll ?...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li><li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+Chemistry:+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality.">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells.">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li><li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li><li>Stoddart, M. 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Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

L'incorporation d'EdU est un moyen simple et simple de mesurer la prolifération cellulaire; il est particulièrement utile pour les cellules adhérentes13. Notre protocole utilise des cellules musculaires lisses, mais il s'applique à toute cellule adhérente (épithéliale, endothéliale, etc.). Bien que le protocole ne soit pas compliqué, la seule étape critique consiste à faire la solution d'étiquetage — les ingrédients doivent être ajoutés dans l'ordre indiqué. En outre, comme les t...

La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire1,2. Le contrôle de la prolifération influence les processus normaux tels que le développement, et les processus pathologiques tels que le cancer et les maladies cardiovasculaires. La croissance hyperplastique des cellules musculaires lisses vasculaires, par exemple, est pensé pour être un précurseur de l'athérosclérose3. Les changements dans la prolifération cellulaire sont également utilisés pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. Compte tenu de son impact généralisé, la mesure de la prolifération est un pilier de nombreux laboratoires de biologie cellulaire.
La prolifération cellulaire peut être mesurée en comptant simplement les cellules si la population cellulaire d'intérêt se divise assez rapidement. Pour les cellules à croissance plus lente, le nombre de cellules peut être moins sensible. La prolifération est souvent mesurée par l'incorporation d'analogues nucléodés étiquetés. Bien que l'étalon-or soit l'incorporation de 3H-thymidine, de nombreux laboratoires s'éloignent de cette méthode étant donné la disponibilité de nouvelles alternatives non radioactives. Il s'agit notamment de colorants fluorescents cytoplasmiques, la détection des protéines associées au cycle cellulaire, et l'incorporation d'analogues nucléosides non radioactifs tels que la désoxyuridine 5-bromo-2' (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU)4.
Les colorants cytoplasmiques, tels que la carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), détectent la prolifération parce que l'intensité du colorant diminue à chaque fois que la cellule divise5. Cette technique est couramment utilisée dans la cytométrie de flux pour les cellules non adhérentes. Il n'a pas été utilisé beaucoup pour les cellules adhérentes, mais avec la nouvelle génération de lecteurs de plaques d'imagerie cela peut changer. La détection des protéines associées au cycle cellulaire par des techniques à base d'anticorps (cytométrie de flux, immunohistochimie, etc.) est souvent utilisée pour les tissus ou les cellules non adhérentes. Ces cellules/tissus doivent être fixés et perméabilisés avant la coloration. Les analogues nucléoside brdU et EdU sont similaires en approche à 3H-thymidine, mais sans les inconvénients de la radioactivité. L'incorporation de BrdU est détectée par des anticorps anti-BrdU, et donc les cellules doivent être fixées et perméabilisées avant la coloration. En outre, les cellules doivent être traitées avec DNase pour exposer l'épitope BrdU.
L'incorporation d'EdU est détectée par la chimie de clic, dans laquelle les groupes d'alkyne et d'azide « cliquent » ensemble en présence du cuivre catalytique. L'un ou l'autre groupe peut servir de molécule biosynthétiquement incorporée ou molécule de détection4. Les analogues nucléosidedisponibles disponibles dans le commerce ont le groupe d'alkyne attaché. Pour les essais de prolifération, par conséquent, l'analogue nucléoside fonctionnalisé d'alkyne est détecté par un azide conjugué à un colorant fluorescent ou à un autre marqueur. L'incorporation d'EdU présente plusieurs avantages par rapport à BrdU. Tout d'abord, parce que les groupes d'alkyne et d'azide ne se trouvent pas dans les cellules de mammifères, cette interaction est très spécifique avec un fond bas6. Parce que les deux groupes sont petits, les cellules n'ont pas besoin de subir la dénaturation de l'ADN pour exposer l'analogique nucléoside comme requis pour BrdU7. Enfin, la chimie de clic est très polyvalente, et peut être employée pour l'étiquetage métabolique de l'ADN, de l'ARN, des protéines, des acides gras, et des hydrates de carbone8,9,10,11. Si la cible d'intérêt étiquetée métaboliquement se trouve à la surface des cellules, les cellules vivantes peuvent être étiquetées12. En outre, les cellules peuvent être traitées plus en détail pour la coloration immunofluorescente avec des anticorps.
Le protocole suivant décrit l'utilisation de l'incorporation D'EdU et de la chimie des clics pour mesurer la prolifération dans les cellules musculaires lisses vasculaires humaines (Figure 1). Nous montrons trois façons différentes d'incorporation d'EdU peut être mesurée, les résultats représentatifs de chacun, et leurs avantages et inconvénients. La mesure de la prolifération par l'intermédiaire de la chimie de clic est particulièrement utile pour les cellules adhérentes et de plus en plus lentes. En outre, la morphologie de la cellule est bien entretenue et la coloration à base d'anticorps peut également être effectuée.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

La capacité d'une cellule à proliférer fait partie intégrante de la fonction normale de la plupart des cellules, et la dysrégulation de la prolifération est au cœur de nombreux processus de la maladie. Pour ces raisons, la mesure de la prolifération est un outil courant utilisé pour évaluer la fonction cellulaire. La prolifération cellulaire peut être mesurée simplement par comptage; cependant, il s'agit d'un moyen indirect de mesurer la prolifération. Un moyen courant de détecter directement les cellules se préparant à se diviser est par l'incorporation d'analogues nucléosides étiquetés. Il s'agit notamment de la nucléoside radioactive analogique 3H-thymidine plus non-radioactifs analogues nucléoside tels que 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU). L'incorporation d'EdU est détectée par la chimie de clic, qui a plusieurs avantages par rapport à BrdU. Dans ce rapport, nous fournissons un protocole pour mesurer la prolifération par l'incorporation de l'UE. Ce protocole comprend des options pour diverses lectures, ainsi que les avantages et les inconvénients de chacun. Nous discutons également des endroits où le protocole peut être optimisé ou modifié pour répondre aux besoins spécifiques de l'expérience planifiée. Enfin, nous touchons à la façon dont ce protocole de base peut être modifié pour mesurer d'autres métabolites cellulaires.

Dans la figure 2, nous démontrons les résultats de trois expériences différentes mesurant la prolifération de VSMC en réponse au PDGF. Après avoir augmenté les cellules dans les médias formulés pour les SMC, nous avons effectué l'expérience dans le Srum dMEM libre, pour éliminer tous les effets potentiels du sérum ou des facteurs de croissance sur la prolifération. Dans la figure 2A, nous comparons les résultats, de la même expérience, à l'aid...

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Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire, et une lecture commune utilisée pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. La mesure de la prolifération est donc un résultat fréquemment utilisé en biologie cellulaire. Nous présentons ici une méthode simple et polyvalente de mesure de la prolifération qui peut être utilisée dans les cellules adhérentes et non adhérentes.

Mesurer la prolifération des cellules musculaires vasculaires lisses à l'aide de la chimie de clic

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

La prolifération est une mesure importante de la fonction cellulaire. Ce protocole permet aux chercheurs de mettre au point un test de prolifération sensible dans leurs laboratoires sans le coût élevé des trousses disponibles dans le commerce. Le principal avantage de cette technique est qu’elle évite le traitement sévère des cellules et/ou l’utilisation de la radioactivité.Vicky Wong, la directrice de mon laboratoire, démontrera cette technique. Pour apaiser la prolifération, retirez les cellules musculaires lisses vasculaires d’un flacon avec le média lisse de cellules de muscle dans le sérum bovin foetal de 2%, et plaquez à 20.000 cellules par millilitre dans DMEM dans une plaque de 96 puits. Faire croître les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Ajouter 30 nanogrammes par plaquette millilitre dérivé du facteur de croissance à trois à six puits comme un contrôle positif pour stimuler la prolifération. Ajoutez ensuite PBS au même nombre de puits qu’un contrôle négatif. Incuber pendant 72 heures.Diluer le stock d’EdU de cinq millimolaires préparé précédemment à un millimolaire et ajouter deux microlitres à chaque puits pendant les 24 dernières heures de la période de culture de 72 heures. Conservez un ensemble de répliques sans EdU pour déterminer la fluorescence et la luminescence de fond. Vingt-quatre heures plus tard, fixer les cellules en enlevant les médias, puis en ajoutant 150 microlitres par puits de 4% paraformaldéhyde et incuber 10 minutes à température ambiante.Retirer le paraformaldéhyde et ajouter 150 microlitres de 1%TX-100 dans l’eau par puits et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Laver trois fois avec PBS pour enlever le TX-100. Pour détecter l’EdU incorporé à l’aide de fluorescence, faire 10 millilitres de solution d’étiquetage par plaque de 96 puits juste avant l’utilisation en ajoutant des réacgages à partir de solutions de stock dans le bon ordre: 20 microlitres THPTA, 20 microlitres de cuivre sulfate, cinq microlitres fluorescéine picolyl-azide, et 100 microlitres sodium ascorbate en PBS pour un volume total de 10 millilitres.L’étape la plus critique est de faire la solution d’étiquetage juste avant l’utilisation. Retirer le PBS des puits, ajouter 150 microlitres de solution d’étiquetage à chaque puits et incuber 30 minutes à 37 degrés Celsius. Pour détecter tous les noyaux, ajoutez dapi à chaque puits et l’image sur un microscope fluorescent ou lecteur de plaque d’imagerie.Pour éviter le comptage manuel et lorsqu’un lecteur de plaque d’imagerie n’est pas disponible, ce protocole peut être modifié en une lecture de luminescence à l’aide d’azide HRP et d’un substrat ELISA. Pour détecter l’EdU à l’aide de luminscence, préparez d’abord une solution saline tamponnée à trois avec 0,1 % de polysorbate 20. Ajouter ensuite 150 microlitres de tampon bloquant à chaque puits et incuber pendant 90 minutes à température ambiante.Après avoir enlevé le tampon de blocage, lavez les cellules trois fois avec 200 microlitres de PBS. Pour détecter l’EdU incorporé, préparez d’abord 10 millilitres de solution d’étiquetage par plaque de 96 puits en ajoutant des réadages à partir de solutions de stock dans le bon ordre. Tout d’abord, 20 microlitres THPTA, puis 20 microlitres de cuivre sulfate, cinq microlitres biotine picolyl-azide, 100 microlitres sodium ascorbate en PBS pour un volume total de 10 millilitres.Laver les puits cinq fois trois minutes avec 200 microlitres de TBST en secouant. Étanchez les peroxydes endogènes avec 150 microlitres de peroxyde d’hydrogène de 0,3 % pendant 20 minutes à température ambiante. Après avoir enlevé le peroxyde d’hydrogène, laver cinq fois trois minutes avec 200 microlitres de TBST en secouant.Ajouter 50 microlitres de peroxyde streptavidine-raifort diluée dans tbst à chaque puits et incuber à température ambiante pendant une heure. Laver cinq fois trois minutes avec 200 microlitres de TBST en secouant. Ajouter 50 microlitres de substrat ELISA chemiluminescent à chaque puits et lire immédiatement dans un lecteur de plaque capable de détecter la luminescence.Bien que les noyaux fluorescents puissent être détectés par un lecteur standard de plaque de fluorescence, en utilisant le protocole de luminescence, l’analyse fluorescente est convertie en une lecture liquide homogène détectée avec du peroxyde streptavidine-raifort et un substrat ELISA standard. L’avantage de cette méthode par rapport à une lecture fluorescente est une lecture plus homogène et la plaque peut être lue en quelques secondes comme on le voit ici lorsque la prolifération de VSMC en réponse à PDGF a été mesurée. L’inconvénient est que l’arrière-plan est plus élevé qu’avec la fluorescence, donc les contrôles négatifs ont tendance à être plus élevés.Dans une tentative de diminuer la variabilité, les résultats ont été normalisés aux comptes initiaux de cellules. Cependant, dans un ensemble distinct d’expériences, il a été démontré que cette méthode n’est pas assez sensible pour détecter de petites différences dans le nombre de cellules. La façon la plus efficace et la plus précise de compter les cellules positives et totales de l’EdU est d’utiliser un lecteur de plaques d’imagerie.Si ce type de lecteur de plaque n’est pas disponible, le comptage manuel donnera également des résultats précis. Lorsqu’on compare ces deux méthodes, le nombre manuel positif d’EdU était identique au nombre automatisé, tout comme le nombre total non formulé. L’avantage de ces deux méthodes est la visibilité des cellules à compter, une meilleure précision, et que la coloration non spécifique des débris peut être vu et évité.Le principal inconvénient avec la méthode de comptage manuel est le temps. N’oubliez pas de rendre la solution d’étiquetage fraîche juste avant l’utilisation et d’ajouter les ingrédients dans l’ordre fourni dans le protocole écrit. Si l’intensité de la coloration est faible, essayez d’ajuster le rapport chélateur/cuivre.Rappelez-vous que le paraformaldéhyde est toxique. Il doit être utilisé dans une hotte de fumée tout en portant des gants. La procédure elle-même n’est pas difficile, mais peut-être besoin d’être optimisée en ajustant les ratios chélateur/cuivre dans la solution d’étiquetage.En outre, les temps d’incubation et la durée du traitement edu peuvent être ajustés en fonction du type de cellule et de la question spécifique posée. Cette technique est compatible avec la surface cellulaire et la coloration intracellulaire afin que les caractéristiques des cellules de division et de non-division puissent être déterminées. Bien que couramment utilisée pour mesurer la prolifération, la chimie des clics peut également être utilisée pour l’étiquetage métabolique de l’ARN, des protéines, des acides gras et des glucides.Si la cible métabolique d’intérêt se trouve à la surface de la cellule, les cellules vivantes peuvent être étiquetées.

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Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Blessure à la gorge aortique murine: une efficacité<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de prolifération des cellules musculaires lisses et fonction endothéliale

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...