Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
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Ringraziamo Katie Carroll per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. David Cool e il Laboratorio di Analisi Proteomics per l'istruzione e la fornitura del lettore di lastre di imaging Cytation. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Wright State Foundation (a L.E.W.).

1. Rilevamento di EdU utilizzando l'etichetta fluorescente
<ol><li>Soluzioni stock<ol>
<li>Preparare una soluzione di stock EdU da 5 mM aggiungendo 12,5 mg di EdU a 10 mL di doppia distillazione H2O.</li>
		<li>Preparare i componenti della soluzione di etichettatura: 200 mM tris(3-hydroxyltriazolylmethyl)ammine(THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg in 1 mL H2O; fare fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg in 95 m.O.3 M. , conservato in 5 aliquote a ...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li><li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+Chemistry:+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality.">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells.">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li><li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry.">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry.">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li><li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+sphingolipid+research.">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry.">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li><li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).</li><li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling.">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li><li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation:+A+Comparative+Study.">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

L'incorporazione di EdU è un modo semplice e diretto per misurare la proliferazione cellulare; è particolarmente utile per le cellule aderenti13. Il nostro protocollo utilizza cellule muscolari lisce, ma è applicabile a qualsiasi cellula aderente (epiteliale, endoteliale, ecc.). Anche se il protocollo non è complicato, l'unico passo critico è fare la soluzione di etichettatura - gli ingredienti devono essere aggiunti nell'ordine elencato. Inoltre, come le macchie occidentali chemiluminescenti...

La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare1,2. Il controllo della proliferazione influenza i normali processi come lo sviluppo e i processi patologici come il cancro e le malattie cardiovascolari. La crescita iperplastica delle cellule muscolari lisce vascolari, per esempio, è pensata per essere un precursore dell'aterosclerosi3. I cambiamenti nella proliferazione cellulare sono utilizzati anche per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Dato il suo impatto diffuso, la misurazione della proliferazione è un pilastro di molti laboratori basati sulla biologia cellulare.
La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando le cellule se la popolazione cellulare di interesse si divide abbastanza rapidamente. Per le cellule a crescita più lenta, i conteggi delle cellule possono essere meno sensibili. La proliferazione è spesso misurata dall'incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Anche se il gold standard è di 3H-tiofina, molti laboratori si stanno allontanando da questo metodo data la disponibilità di alternative più recenti e non radioattive. Questi includono coloranti fluorescenti citoplasmici, rilevamento di proteine associate al ciclo cellulare e incorporazione di analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2' (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU)4.
I coloranti citoplasmici, come carboxyfluorescein diacetate succinimidil ester (CFSE), rilevano la proliferazione perché l'intensità del coloranti si dimezza ogni volta che la cellula si divide5. Questa tecnica è comunemente utilizzata nella citometria di flusso per le cellule non aderenti. Non è stato utilizzato molto per le cellule aderenti, ma con la nuova generazione di lettori di lastre di imaging questo può cambiare. La rilevazione delle proteine associate al ciclo cellulare attraverso tecniche basate su anticorpi (citometria di flusso, immunoistochimica, ecc.) è spesso utilizzata per tessuti o cellule non aderenti. Queste cellule/tessuti devono essere fissi e permeabilizzati prima della colorazione. Gli analoghi Nucleoside BrdU ed EdU sono simili nell'approccio a 3H-tiofina, ma senza l'inconveniente della radioattività. L'incorporazione di BrdU viene rilevata dagli anticorpi anti-BrdU, e quindi le cellule devono essere fisse e permeaabilizzate prima della colorazione. Inoltre, le cellule devono essere trattate con DNase per esporre l'epitopo BrdU.
L'incorporazione di EdU viene rilevata dalla chimica del click, in cui i gruppi alkyne e azide "click" insieme in presenza di rame catalitico. Entrambi i gruppi possono servire come molecola biosinteticamente incorporata o molecola di rilevamento4. Gli analoghi nucleoside disponibili in commercio hanno il gruppo alchino attaccato. Per i test di proliferazione, quindi, l'analogo nucleoside funzionalizzato alkyne viene rilevato da un'azide coniugata a un colore fluorescente o a un altro marcatore. L'incorporazione di EdU ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In primo luogo, perché i gruppi di alchine e azide non si trovano nelle cellule dei mammiferi, questa interazione è altamente specifica con uno sfondo basso6. Poiché entrambi i gruppi sono piccoli, le cellule non hanno bisogno di sottoporsi alla denaturazione del DNA per esporre l'analogo nucleoside come richiesto per BrdU7. Infine, la chimica del clic è altamente versatile e può essere utilizzata per l'etichettatura metabolica di DNA, RNA, proteine, acidi grassi e carboidrati8,9,10,11. Se l'obiettivo metabolicamente etichettato di interesse è sulla superficie cellulare, le cellule vive possono essere etichettate12. Inoltre, le cellule possono essere ulteriormente elaborate per la colorazione immunofluorescente con anticorpi.
Il protocollo seguente descrive l'uso dell'incorporazione EdU e la chimica dei clic per misurare la proliferazione nelle cellule muscolari lussuriane vascolari umane (Figura 1). Mostriamo tre diversi modi in cui l'incorporazione di EdU può essere misurata, risultati rappresentativi da ciascuno, e i loro vantaggi e svantaggi. Misurare la proliferazione tramite la chimica dei clic è particolarmente utile per le cellule aderenti e a bassa crescita. Inoltre, la morfologia della cellula è ben mantenuta e può anche essere eseguita una colorazione basata su anticorpi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

La capacità di una cellula di proliferare è parte integrante della normale funzione della maggior parte delle cellule, e la disregolazione della proliferazione è al centro di molti processi di malattia. Per questi motivi, la misurazione della proliferazione è uno strumento comune utilizzato per valutare la funzione cellulare. La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando; tuttavia, questo è un mezzo indiretto per misurare la proliferazione. Un mezzo comune per rilevare direttamente le cellule che si preparano a dividersi è l'incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Questi includono il nucleoside radioattivo analogico 3H-thymidine più analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2' (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU). L'incorporazione di EdU è rilevata dalla chimica del click, che ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In questa relazione, forniamo un protocollo per misurare la proliferazione con l'incorporazione di EdU. Questo protocollo include opzioni per varie letture, insieme ai vantaggi e agli svantaggi di ciascuna. Discutiamo anche dei luoghi in cui il protocollo può essere ottimizzato o modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell'esperimento pianificato. Infine, tocchiamo i modi in cui questo protocollo di base può essere modificato per misurare altri metaboliti cellulari.

Nella Figura 2viene illustrato i risultati di tre diversi esperimenti che misurano la proliferazione di VSMC in risposta a PDGF. Dopo aver coltivato le cellule nei media formulati per le SMC, abbiamo condotto l'esperimento nel DMEM senza siero, per eliminare eventuali effetti potenziali del siero o dei fattori di crescita sulla proliferazione. Nella Figura 2A confrontiamo i risultati, dallo stesso esperimento, utilizzando una lettura fluorescente vs luminescente...

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Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare e una lettura comune utilizzata per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Misurare la proliferazione è, quindi, un saggio frequentemente usato nella biologia cellulare. Qui presentiamo un metodo semplice e versatile di misurazione della proliferazione che può essere utilizzato in cellule aderenti e non aderenti.

Misurazione della proliferazione delle cellule muscolari lustiche vascolari utilizzando la chimica dei clic

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

La proliferazione è un'importante misura della funzione cellulare. Questo protocollo consente agli investigatori di sviluppare un saggio di proliferazione sensibile nei loro laboratori senza l'alto costo dei kit disponibili in commercio. Il vantaggio principale di questa tecnica è che evita un duro trattamento delle cellule e / o l'uso di radioattività.A dimostrare questa tecnica sarà Vicky Wong, la manager del mio laboratorio. Per testare la proliferazione, rimuovere le cellule muscolari lisce vascolari da un pallone con mezzi cellulari muscolari lisci nel siero e nella piastra bovina fetale al 2% a 20.000 cellule per millilitro in DMEM in una piastra da 96 pozzetti. Far crescere le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte.Aggiungere 30 nanogrammi per fattore di crescita derivato dalla piastrine millilitro a tre o sei pozzi come controllo positivo per stimolare la proliferazione. Aggiungere quindi PBS allo stesso numero di pozzi di un controllo negativo. Incubare per 72 ore.Diluire in precedenza cinque scorte di EdU millimolare a un millimolare e aggiungere due microlitri a ciascun pozzo per le ultime 24 ore del periodo di coltura di 72 ore. Mantenere un set di repliche senza EdU per determinare la fluorescenza e la luminescenza in background. Ventiquattro ore dopo, fissare le cellule rimuovendo il supporto, quindi aggiungendo 150 microlitri per pozzo del 4% di paraformaldeide e incubare 10 minuti a temperatura ambiente.Rimuovere la paraformaldeide e aggiungere 150 microlitri di 1%TX-100 in acqua per pozzo e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare tre volte con PBS per rimuovere il TX-100. Per rilevare l'EdU incorporato usando la fluorescenza, fare 10 millilitri di soluzione di etichettatura per piastra da 96 pozzetti appena prima dell'uso aggiungendo reagenti da soluzioni stock nell'ordine giusto:20 microlitri THPTA, 20 microlitri solfato di rame, cinque microlitri fluoresceina picolil-azide e 100 microlitri ascorbate di sodio in PBS per un volume totale di 10 millilitri.Il passaggio più critico è quello di creare la soluzione di etichettatura appena prima dell'uso. Rimuovere il PBS dai pozzi, aggiungere 150 microlitri di soluzione di etichettatura a ciascun pozzo e incubare 30 minuti a 37 gradi Celsius. Per rilevare tutti i nuclei, aggiungere DAPI a ogni pozzo e immagine su un microscopio fluorescente o un lettore di lastre di imaging.Per evitare il conteggio manuale e quando un lettore di lastre di imaging non è disponibile, questo protocollo può essere modificato in una lettura a luminescenza utilizzando azide HRP e un substrato ELISA. Per rilevare EdU utilizzando la luminescenza, preparare prima la salina tris-buffered con lo 0,1% di polisorbato 20. Quindi aggiungere 150 microlitri di tampone di blocco ad ogni pozzo e incubare per 90 minuti a temperatura ambiente.Dopo aver rimosso il buffer di blocco, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di PBS. Per rilevare l'EdU incorporato, preparare prima 10 millilitri di soluzione di etichettatura per piastra da 96 porcili aggiungendo reagenti da soluzioni stock nell'ordine giusto. In primo luogo, 20 microlitri THPTA, poi 20 microlitri solfato di rame, cinque microlitri biotina picolil-azide, 100 microlitri ascorbato di sodio in PBS per un volume totale di 10 millilitri.Lavare i pozzi cinque volte tre minuti con 200 microlitri di TBST con scuotimento. Perossidasi endogene quench con 150 microlitri di perossido di idrogeno allo 0,3% per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il perossido di idrogeno, lavare cinque volte tre minuti con 200 microlitri di TBST con scuotimento.Aggiungere 50 microlitri di perossidasi di streptavidina-rafano diluita in TBST ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Lavare cinque volte tre minuti con 200 microlitri di TBST con scuotimento. Aggiungere 50 microlitri di substrato ELISA chemiluminescente ad ogni pozzo e leggere immediatamente in un lettore di lastre in grado di rilevare la luminescenza.Sebbene i nuclei fluorescenti possano essere rilevati da un lettore standard di piastre a fluorescenza, utilizzando il protocollo di luminescenza, la scansione fluorescente viene convertita in una lettura liquida omogenea rilevata con perossidasi streptavidina-rafano e un substrato ELISA standard. Il vantaggio di questo metodo rispetto a una lettura fluorescente è una lettura più omogenea e la piastra può essere letta in pochi secondi come si vede qui quando è stata misurata la proliferazione di VSMC in risposta al PDGF. Lo svantaggio è che lo sfondo è più alto che con la fluorescenza, quindi i controlli negativi tendono ad essere più alti.Nel tentativo di ridurre la variabilità, i risultati sono stati normalizzati al conteggio iniziale delle celle. Tuttavia, in un insieme separato di esperimenti, è stato dimostrato che questo metodo non è abbastanza sensibile da rilevare piccole differenze nel numero di celle. Il modo più efficiente e accurato per contare le cellule positive e totali dell'EdU è utilizzare un lettore di lastre di imaging.Se questo tipo di lettore di lastre non è disponibile, il conteggio manuale produrrà anche risultati accurati. Quando si confrontano questi due metodi, il conteggio manuale positivo dell'EDU era identico al conteggio automatizzato, così come il conteggio totale non stimolato. Il vantaggio di questi due metodi è la visibilità delle cellule da contare, una migliore precisione e che la colorazione non specifica dei detriti può essere vista ed evitata.Lo svantaggio principale con il metodo di conteggio manuale è il tempo. Ricordarsi di rendere fresca la soluzione di etichettatura appena prima dell'uso e aggiungere gli ingredienti nell'ordine fornito nel protocollo scritto. Se l'intensità della colorazione è fioca, provare a regolare il rapporto chelatore/rame.Ricorda che la paraformaldeide è tossica. Dovrebbe essere usato in un cappuccio dei fumi mentre si indossano i guanti. La procedura in sé non è difficile, ma potrebbe dover essere ottimizzata regolando i rapporti chelatore/rame nella soluzione di etichettatura.Inoltre, i tempi di incubazione e la durata del trattamento EdU possono essere regolati a seconda del tipo di cellula e della domanda specifica posta. Questa tecnica è compatibile con la superficie cellulare e la colorazione intracellulare in modo da poter determinare le caratteristiche delle cellule divisorie e non divisorie. Sebbene comunemente usato per misurare la proliferazione, la chimica dei clic può anche essere utilizzata per l'etichettatura metabolica di RNA, proteine, acidi grassi e carboidrati.Se il bersaglio metabolico di interesse è sulla superficie cellulare, le cellule vive possono essere etichettate.

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