Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

케이티 캐롤에게 기술 지원을 부탁드립니다. 우리는 또한 Cytation 화상 진찰 격판덮개 리더의 지시 그리고 제공을 위한 박사 데이비드 쿨 과 Proteomics 분석 실험실감사합니다. 이 작품은 라이트 주립 재단 보조금(L.E.W.)에 의해 지원되었습니다.

1. 형광 라벨을 사용하여 EdU의 검출
<ol><li>재고 솔루션<ol>
<li>이중 증류H2O의 10 mL에 12.5 mg의 EdU를 추가하여 5 mM EdU 재고 솔루션을 준비합니다.</li>
		<li>라벨 링 솔루션 구성 요소를 준비: 200 mM 트리스 (3-하이드록시 프로필리아졸라메틸) 아민 (THPTA) (1.15 mL H2O에서 100 mg), 100 mM CuSO4 (15.95 mg 1mL H2O; 신선한만들기), 10 mM Cy3 피콜릴-아지드 (10 mM Cy3 피콜릴-아지드 3m ,...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+atherosclerosis+and+the+development+of+preatherosclerotic+intimal+hyperplasia.">Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia.</a> Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).</li><li>Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Techniques+to+assess+cell+proliferation.">Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li><li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+Chemistry:+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality.">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells.">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li><li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry.">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry.">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li><li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+sphingolipid+research.">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry.">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li><li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).</li><li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling.">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li><li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation:+A+Comparative+Study.">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

EdU의 통합은 세포 증식을 측정하는 간단하고 간단한 방법입니다. 특히 부착세포(13)에유용하다. 우리의 프로토콜은 평활근 세포를 사용하지만 모든 부착 세포 (상피, 내피 등)에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜이 복잡하지는 않지만, 한 가지 중요한 단계는 라벨링 솔루션을 만드는 것입니다 - 성분은 나열된 순서대로 추가되어야 합니다. 또한, 케미발광웨스턴 블롯과 마찬가지로, ...

증식은 세포 기능1,2의중요한 부분입니다. 증식의 통제는 발달과 같은 일반적인 프로세스, 암과 심장 혈관 질병과 같은 병리학 적인 프로세스에 영향을 미칩니다. 혈관 평활근 세포의 과소 플라스틱 성장은 예를 들어, 죽상 동맥 경화증의 전구체로 생각된다3. 세포 증식의 변화는 또한 새로운 약물의 잠재적인 독성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 그것의 광범위 한 영향을 감안할 때, 증식 측정은 많은 세포 생물학 기반 실험실의 주류.
관심있는 세포 인구가 상당히 급속하게 분할하는 경우에 세포 증식은 단순히 세포를 계수해서 측정될 수 있습니다. 느린 성장 세포의 경우 세포 수가 덜 민감할 수 있습니다. 증식은 종종 표지된 뉴클레오시드 유사체의 혼입에 의해 측정됩니다. 금 표준은 3H-티미딘 통합이지만, 많은 실험실은 새로운 비 방사성 대안의 가용성을 감안할 때이 방법에서 벗어나고 있다. 이들은 세포질 형광 염료, 세포 주기 관련 단백질의 검출, 및 5-브로모-2' deoxyuridine (BrdU) 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU)와 같은 비 방사성 뉴클레오시드 유사체의 혼입을 포함한다4.
카르복시플루아세진과 같은 세포질 염료는 설치니미딜 에스테르(CFSE)를 이아세테이트하며, 세포가 분열될 때마다 염료의 강도가 반으로 줄어들기 때문에 증식을감지한다5. 이 기술은 일반적으로 비 부착 세포에 대한 유세포 분석에서 사용된다. 그것은 부착 된 세포에 많이 사용되지 않았지만 새로운 세대의 이미징 플레이트 판독기와 함께 이 변경 될 수 있습니다. 항체 기반 기술(유세포 분석, 면역조직화학 등)을 통한 세포 주기 관련 단백질의 검출은 종종 조직 또는 비부착 세포에 사용된다. 이 세포/조직은 염색하기 전에 고쳐지고 투과되어야 합니다. 뉴클레오시드 유사체 BrdU 및 EdU는 3H-티미딘에 대한 접근법에서 유사하지만 방사능의 불편함없이. BrdU의 편입은 반대로 BrdU 항체에 의해 검출되고, 그러므로 세포는 염색의 앞에 고정되고 투과되어야 합니다. 또한, 세포는 BrdU 에피토프를 노출시키기 위해 DNase로 처리되어야 한다.
EdU의 통합은 클릭 화학에 의해 감지되며, 알키네와 아지드 그룹은 촉매 구리가있는 경우 함께 "클릭"합니다. 어느 그룹은 생합성 으로 통합된 분자 또는 검출 분자4로서작용할 수 있다. 시판되는 뉴클레오시드 유사체는 알키네 그룹이 부착되어 있다. 증식 검문, 따라서, 알키네 기능화된 뉴클레오시드 유사체는 형광 염료 또는 다른 마커에 공액화된 아지드에 의해 검출된다. EdU의 통합은 BrdU에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 알키네 및 아지드 기는 포유류 세포에서 발견되지 않기 때문에, 이러한 상호작용은 낮은 배경6과매우 특이적이다. 두 그룹 모두 작기 때문에, 세포는 BrdU7에필요한 대로 뉴클레오시드 아날로그를 노출하기 위해 DNA 변성 수술을 받을 필요가 없다. 마지막으로, 클릭 화학은 매우 다재다능하며 DNA, RNA, 단백질, 지방산 및 탄수화물8,9,10,11의대사 라벨링에 사용할 수 있습니다. 관심 있는 대사 표지된 표적이 세포 표면에 있는 경우에, 살아있는 세포는12표지될수 있다. 또한, 세포는 항체로 면역형광 염색을 위해 추가로 처리될 수 있다.
다음 프로토콜은 인간 혈관 평활근 세포에서 증식을 측정하기 위해 EdU 혼입 및 클릭 화학의 사용을설명한다(도 1). 우리는 EdU의 통합을 측정 할 수있는 세 가지 방법, 각각의 대표 결과, 그리고 장점과 단점을 보여줍니다. 클릭 화학을 통한 증식 측정은 부착성, 느린 성장 세포에 특히 유용합니다. 또한, 세포의 형태는 잘 유지되고 항체 계 염색도 수행될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

증식하는 세포의 능력은 대부분의 세포의 정상적인 기능에 필수적이며, 증식의 dysregulation은 많은 질병 과정의 핵심입니다. 이러한 이유로, 증식 측정은 세포 기능을 평가하는 데 사용되는 일반적인 도구입니다. 세포 증식은 계수만으로 측정할 수 있습니다. 그러나 이것은 확산을 측정하는 간접적인 수단입니다. 분할을 준비하는 세포를 직접 검출하는 한 가지 일반적인 방법은 표지된 뉴클레오시드 유사체의 통합입니다. 이들은 방사성 뉴클레오시드 아날로그 3H-티미딘 플러스 5-브로모-2' deoxyuridine (BrdU) 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU)와 같은 비방사성 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. EdU의 통합은 BrdU에 비해 몇 가지 장점이 클릭 화학에 의해 감지됩니다. 이 보고서에서는 EdU의 통합에 의한 확산을 측정하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 각각의 장점과 단점과 함께 다양한 판독값에 대한 옵션이 포함되어 있습니다. 또한 계획된 실험의 특정 요구 사항을 충족하기 위해 프로토콜을 최적화하거나 변경할 수 있는 위치에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이 기본적인 프로토콜이 그밖 세포 대사 산물을 측정하기 위해 수정될 수 있는 쪽에 접촉합니다.

도 2에서,PDGF에 응하여 VSMC의 증식을 측정하는 3가지 다른 실험의 결과를 입증하였다. SMC를 위해 제형화된 매체에서 세포를 성장한 후, 혈청 무첨가 DMEM에서 실험을 수행하여 혈청 또는 증식에 대한 성장 인자의 잠재적 인 영향을 제거하였다. 그림 2A에서는 형광 대 발광 판독을 사용하여 동일한 실험에서 결과를 비교합니다. 이러한 플레이트를 읽기 위?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

증식은 세포 기능의 중요한 부분이며, 신약의 잠재적 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 판독값입니다. 따라서 증식 측정은 세포 생물학에서 자주 사용되는 분석입니다. 여기에서 우리는 부착 및 비 부착 세포에서 사용될 수 있는 증식을 측정하는 간단하고 다양한 방법을 제시합니다.

클릭 화학을 사용하여 혈관 평활근 세포의 증식 측정

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

증식은 세포 기능의 중요한 척도입니다. 이 프로토콜을 통해 조사관은 시판되는 키트의 높은 비용없이 실험실에서 민감한 확산 분석기를 개발할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포의 가혹한 처리 및/또는 방사능사용을 피한다는 것입니다.이 기술을 시연하는 것은 내 실험실의 매니저인 비키 웡(Vicky Wong)이 될 것입니다. 증식을 분석하기 위해, 96웰 플레이트에서 DMEM의 밀리리터 당 20, 000 세포에서 2%의 태아 소 혈청 및 플레이트에서 2%의 태아 소 혈청및 플레이트로 매끄러운 근육 세포 매체를 가진 플라스크에서 혈관 매끄러운 근육 세포를 제거하십시오. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 세포를 성장시다.확산을 자극하는 긍정적인 컨트롤로 밀리리터 혈소판 유래 성장 인자당 30 나노그램을 3~6개의 우물에 첨가합니다. 그런 다음 음수 컨트롤과 동일한 수의 우물에 PBS를 추가합니다. 72시간 동안 배양합니다.이전에 준비된 5개의 밀리몰러 EdU 스톡을 1밀리몰라에 희석하고 72시간 배양 기간의 마지막 24시간 동안 각 웰에 마이크로리터 2개를 추가합니다. 배경 형광 및 발광을 결정하기 위해 EdU없이 복제 한 세트를 유지합니다. 24시간 후, 미디어를 제거하여 세포를 수정한 다음, 4%의 파라포름알데히드의 웰당 150마이크로리터를 추가하고 실온에서 10분을 배양합니다.파라포름알데히드를 제거하고 우물당 물에 1%TX-100의 150 마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. TX-100을 제거하기 위해 PBS로 세 번 세척하십시오. 형광을 사용하여 통합 된 EdU를 감지하려면, 올바른 순서로 재고 솔루션에서 시약을 추가하여 사용하기 직전에 96 웰 플레이트 당 라벨링 용액 10 밀리리터를 만듭니다 : 20 마이크로 리터 THPTA, 20 마이크로 리터 구리 황산염, 5 마이크로 리터 플루오레세인 피콜릴 - 아지드, 100 마이크로 리터 는 100 마이크로 리터의 PBS에 밀리터로 밀리터로 밀리터.가장 중요한 단계는 사용하기 직전에 라벨링 솔루션을 만드는 것입니다. 우물에서 PBS를 제거하고, 각 우물에 150 마이크로리터의 라벨링 솔루션을 추가하고 섭씨 37도에서 30분을 배양합니다. 모든 핵을 검출하려면 형광 현미경 또는 이미징 플레이트 판독기에서 각 우물과 이미지에 DAPI를 추가합니다.수동 계수를 방지하고 이미징 플레이트 판독기를 사용할 수 없는 경우 이 프로토콜을 HRP 아지드 및 ELISA 기판을 사용하여 발광 판독기로 수정할 수 있습니다. 발광을 사용하여 EdU를 감지하려면 먼저 0.1% 폴리소르바테 20으로 트리스 버퍼링식 식염수(triss 버퍼링식 식염수)를 준비합니다. 그런 다음 각 우물에 150 마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가하고 실온에서 90 분 동안 배양하십시오.차단 버퍼를 제거한 후 PBS 의 200 마이크로리터로 셀을 세 번 세척하십시오. 통합 된 EdU를 감지하려면 먼저 재고 솔루션의 시약을 올바른 순서로 추가하여 96 웰 플레이트 당 라벨링 솔루션 10 밀리리터를 준비하십시오. 첫째, 20 마이크로 리터 THPTA, 다음 20 마이크로 리터 구리 황산염, 5 마이크로 리터 비오틴 피콜릴 - 아지드, 100 마이크로 리터 나트륨 아스코르바트 PBS에 총 부피 10 밀리리터.TBST 의 200 마이크로 리터와 함께 5 번 3 분 우물을 흔들어 씻으시다. 실온에서 20분 동안 150마이크로리터의 과산화수소 0.3%의 마이크로리터를 담금질합니다. 과산화수소를 제거한 후 TBST 200 마이크로리터로 5회 3분간 흔들어 주세요.TBST에 희석된 스트렙타비딘-고추냉이 과로시다아제 50마이크로리터를 각 우물에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. TBST 의 200 마이크로 리터와 함께 5 번 3 분 세척 흔들어. 각 웰에 화학 발광 ELISA 기판의 50 마이크로 리터를 추가하고 발광을 감지 할 수있는 플레이트 리더에서 즉시 읽어보십시오.형광 핵은 표준 형광 판 판독기에 의해 검출될 수 있지만, 발광 프로토콜을 사용하여, 형광 스캔은 연쇄상 구하 와옥시다제 및 표준 ELISA 기판으로 검출된 균질성 액체 판독으로 변환됩니다. 형광 판독에 비해 이 방법의 장점은 보다 균일한 판독이며 PDGF에 대한 응답으로 VSMC의 증식이 측정되었을 때 여기에서 볼 수 있듯이 플레이트를 몇 초 만에 읽을 수 있다. 단점은 배경이 형광보다 높기 때문에 부정적인 컨트롤이 더 높은 경향이 있다는 것입니다.가변성을 줄이기 위해 결과 초기 셀 수로 정규화되었습니다. 그러나, 별도의 실험 세트에서, 이 방법은 세포 수의 작은 차이를 검출하기에 충분히 민감하지 않다는 것을 보여주었다. EdU 양성 및 총 세포를 계산하는 가장 효율적이고 정확한 방법은 이미징 플레이트 판독기를 사용하는 것입니다.이러한 유형의 플레이트 판독기를 사용할 수 없는 경우 수동 계산도 정확한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 두 가지 방법을 비교할 때 EdU 양수 수동 수는 자극되지 않은 총 수와 동일한 자동 수와 동일합니다. 이 두 가지 방법의 장점은 계산될 세포의 가시성, 향상된 정확도 및 파편의 비특이적 염색을 보고 피할 수 있다는 것입니다.수동 계수 방법의 주요 단점은 시간입니다. 라벨링 솔루션을 사용하기 직전에 신선하게 만들고 서면 프로토콜에 제공된 순서대로 재료를 추가해야 합니다. 염색 강도가 희미하면 첼로이터를 구리 비율에 맞게 조정해 보십시오.파라포름알데히드가 독성이 있다는 것을 기억하십시오. 장갑을 끼고 연기 후드에 사용해야합니다. 절차 자체는 어렵지 않지만 라벨링 솔루션에서 첼레이터를 구리 비율에 맞게 조정하여 최적화해야 할 수 있습니다.또한, EdU 치료의 인큐베이션 시간 및 길이는 요구되는 세포 유형 및 특정 질문에 따라 조절될 수 있다. 이 기술은 세포 표면 및 세포 내 염색과 호환되므로 분할 및 비 분할 세포의 특성을 결정할 수 있습니다. 일반적으로 증식을 측정하는 데 사용되지만, 클릭 화학은 RNA, 단백질, 지방산 및 탄수화물의 대사 라벨링에도 사용될 수 있습니다.관심의 대사 대상이 세포 표면에 있는 경우에, 살아있는 세포는 표지될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

초점 칼슘 2 +</sup평활근에서> 과도 감지

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

연구

생물학

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

인간의 탯줄 아티 평활근 세포 절연 (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

신진 대사 라벨링 및 Bioorthogonal 클릭 화학에 의해 Zebrafish 태아의 영상 Glycans

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

신생아 쥐의 폐 동맥 평활근 세포의 분리

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

소뇌 대동맥 파열 상해 : 효율적<em&gt; In Vivo</em&gt; 평활근 세포 증식과 내피 기능 모델

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...