Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Vi takker Katie Carroll for teknisk assistanse. Vi takker også Dr. David Cool og Proteomikk analyselaboratorium for instruksjon på og levering av Cytation Imaging plate leseren. Dette arbeidet ble støttet av en Wright State Foundation stipend (til L.E.W.).

1. påvisning av EdU med fluorescerende etikett
<ol><li>Stock-løsninger<ol>
<li>Forbered en 5 mM EdU lagerløsning ved å legge 12,5 mg EdU til 10 mL dobbel destillert H2O.</li>
		<li>Klargjør komponentene for merkings løsningen: 200 mM Tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA) (100 mg i 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg i 1 ml H2O; lag fersk), 10 mm Cy3 picolyl-Natriumazid (1 mg i 95,3 ml h2o , lagret i 5 μL alikvoter ved-20 ° c), og 1 M natrium a...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+atherosclerosis+and+the+development+of+preatherosclerotic+intimal+hyperplasia.">Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia.</a> Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).</li><li>Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Techniques+to+assess+cell+proliferation.">Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li><li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+Chemistry:+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality.">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells.">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li><li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry.">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry.">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li><li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+sphingolipid+research.">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry.">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li><li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).</li><li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling.">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li><li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation:+A+Comparative+Study.">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

Innlemmelse av EdU er en enkel og grei måte å måle celle spredning på; Det er spesielt nyttig for tilhenger celler13. Vår protokoll bruker glatte muskelceller, men det gjelder for alle tilhenger celle (epitel, endothelial, etc.). Selv om protokollen ikke er komplisert, er det en kritisk trinn gjør merkings løsningen-ingrediensene må legges i den rekkefølgen som er oppført. I tillegg, som chemiluminiscerende vestlige blots, hvis du bruker luminescence avlesning platen må leses umiddelbar...

Spredning er en kritisk del av cellulær funksjon1,2. Kontroll av spredning påvirker normale prosesser som utvikling, og patologisk prosesser som kreft og kardiovaskulær sykdom. Hyperplastisk vekst av vaskulære glatte muskelceller, for eksempel, antas å være en forløper til aterosklerose3. Endringer i celle spredning brukes også til å vurdere potensiell toksisitet av nye legemidler. Gitt den utbredte virkningen, er måling av spredning en bærebjelke i mange cellebiologi-baserte laboratorier.
Celle spredning kan måles ved å bare telle celler hvis cellen befolkning av interesse skiller ganske raskt. Celle antall kan være mindre følsomme for tregere voksende celler. Spredning måles ofte ved innlemmelse av merket nukleosid analogs. Selv om gullstandarden er 3H-tymidin innlemmelse, mange laboratorier får bort fra denne metoden gitt tilgjengeligheten av nyere, ikke-radioaktive alternativer. Disse inkluderer cytoplasmatiske fluorescerende fargestoffer, påvisning av celle syklus assosierte proteiner, og innlemmelse av ikke-radioaktive nukleosid analogs som 5-bromo-2 ' deoxyuridine (BrdU) og 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
Cytoplasmatiske fargestoffer, for eksempel carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester (CFSE), oppdage spredning fordi intensiteten av Dye halvdelene hver gang cellen skiller5. Denne teknikken brukes vanligvis i flyt flowcytometri for ikke-tilhenger celler. Det har ikke vært brukt mye for tilhenger celler, men med den nye generasjonen av bilde plate lesere dette kan endre seg. Påvisning av celle syklus forbundet proteiner gjennom antistoff-baserte teknikker (Flow flowcytometri, immunhistokjemi, etc.) brukes ofte for vev eller ikke-tilhenger celler. Disse cellene/vev må festes og permeabilized før farging. Nukleosid analogs BrdU og EdU er like i tilnærming til 3H-tymidin, men uten at det inntrufne radioaktivitet. Inkorporering av BrdU oppdages av anti-BrdU-antistoffer, og derfor må cellene festes og permeabilized før farging. I tillegg må celler behandles med DNase for å eksponere BrdU-epitope.
Innlemmelse av EdU oppdages ved å klikke kjemi, der alkyne og Natriumazid grupper "Klikk" sammen i nærvær av katalysator kobber. Begge grupper kan tjene som biosynthetically innarbeidet molekyl eller deteksjon molekyl4. Kommersielt tilgjengelige nukleosid analogs har alkyne gruppen vedlagt. For spredning analyser, derfor alkyne funksjonalisert nukleosid analoge oppdages av en Natriumazid bøyd til et fluorescerende fargestoff eller annen markør. Innlemmelse av EdU har flere fordeler fremfor BrdU. Først fordi alkyne og Natriumazid grupper ikke finnes i pattedyrceller, er denne interaksjonen svært spesifikk med en lav bakgrunn6. Fordi begge gruppene er små, trenger ikke cellene å gjennomgå DNA-denaturering for å eksponere nukleosid analog som kreves for BrdU7. Til slutt, klikk kjemi er svært allsidig, og kan brukes til metabolsk merking av DNA, RNA, protein, fettsyrer, og karbohydrater8,9,10,11. Hvis metabolically merket mål av interesse er på celleoverflaten, kan levende celler være merket12. I tillegg kan celler bli ytterligere behandlet for immunofluorescent farging med antistoffer.
Følgende protokoll beskriver bruken av EdU innlemmelse og klikk kjemi for å måle spredning i menneskelige vaskulære glatte muskelceller (figur 1). Vi viser tre forskjellige måter innlemmelse av EdU kan måles, representative resultater fra hver, og deres fordeler og ulemper. Måling av spredning via Klikk kjemi er spesielt nyttig for tilhenger, tregere voksende celler. I tillegg er morfologi av cellen godt vedlikeholdt og antistoff-baserte flekker kan også utføres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

Evnen til å spre en celle er en vesentlig del av den normale funksjonen til de fleste celler, og feilregulering av spredning er kjernen i mange sykdoms prosesser. Av disse grunner er måling av spredning et vanlig verktøy som brukes til å vurdere celle funksjon. Celle spredning kan måles bare ved å telle; Dette er imidlertid en indirekte måte å måle spredning. En vanlig måte å direkte oppdage celler forbereder å dele er ved inkorporering av merket nukleosid analogs. Disse inkluderer det radioaktive nukleosid analoge 3H-tymidin pluss ikke-radioaktive nukleosid analogs, for eksempel 5-bromo-2 ' Deoxyuridine (BrdU) og 5-ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU). Innlemmelse av EdU oppdages ved å klikke kjemi, som har flere fordeler sammenlignet med BrdU. I denne rapporten gir vi en protokoll for måling av spredning ved inkorporering av EdU. Denne protokollen inkluderer alternativer for ulike readouts, sammen med fordeler og ulemper ved hver. Vi diskuterer også steder der protokollen kan optimaliseres eller endres for å imøtekomme de spesifikke behovene til planlagt eksperiment. Til slutt berører vi på måter som denne grunnleggende protokollen kan endres for å måle andre celle metabolitter.

I figur 2viser vi utfallet av tre ulike eksperimenter som måler SPREDNING av VSMC som svar på PDGF. Etter å ha vokst cellene i Media formulert for SMCs, utførte vi eksperimentet i serum gratis DMEM, for å eliminere eventuelle effekter av serum eller vekstfaktorer på spredning. I figur 2a sammenligner vi resultater, fra samme eksperiment, ved hjelp av et fluorescerende vs selvlysende avlesning. For å lese disse platene brukte vi en multimode mikroplate les...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Spredning er en kritisk del av mobilnettet funksjon, og en felles avlesning brukes til å vurdere potensiell toksisitet av nye legemidler. Måling av spredning er derfor en hyppig brukt analyse i cellebiologi. Her presenterer vi en enkel, allsidig metode for å måle spredning som kan brukes i tilhenger og ikke-tilhenger celler.

Måle spredning av vaskulær glatte muskelceller ved hjelp av Klikk kjemi

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Spredning er et viktig mål på cellefunksjon. Denne protokollen gjør det mulig for etterforskere å utvikle en sensitiv spredningsanalyse i laboratoriene sine uten høye kostnader for kommersielt tilgjengelige sett. Den største fordelen med denne teknikken er at den unngår hard behandling av celler og / eller bruk av radioaktivitet.Å demonstrere denne teknikken vil være Vicky Wong, lederen av laboratoriet mitt. For å analysere spredning, fjern vaskulære glatte muskelceller fra en kolbe med glatte muskelcellemedier i 2% føtal storfe serum og plate ved 20 000 celler per milliliter i DMEM i en 96-brønns plate. Vokse cellene ved 37 grader Celsius over natten.Tilsett 30 nanogram per milliliter blodplate avledet vekstfaktor til tre til seks brønner som en positiv kontroll for å stimulere spredning. Deretter legger du til PBS i samme antall brønner som en negativ kontroll. Inkuber i 72 timer.Fortynne tidligere forberedt fem millimolar EdU lager til en millimolar og legge to mikroliter til hver brønn for de siste 24 timene av 72 timer kulturperioden. Hold ett sett med replikere uten EdU for å bestemme bakgrunnsfluorescens og luminescens. Tjuefire timer senere, fikse cellene ved å fjerne medier, og deretter legge til 150 mikroliter per brønn på 4% paraformaldehyd og inkubere 10 minutter ved romtemperatur.Fjern paraformaldehyd og tilsett 150 mikroliter på 1% TX-100 i vann per brønn og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Vask tre ganger med PBS for å fjerne TX-100. For å oppdage inkorporert EdU ved hjelp av fluorescens, lage 10 milliliter merking løsning per 96-brønns plate like før bruk ved å legge reagenser fra lagerløsninger i riktig rekkefølge: 20 mikroliter THPTA, 20 mikroliter kobbersulfat, fem mikroliter fluorescein picolyl-azide, og 100 mikroliter natrium askorbate i PBS for et totalt volum på 10 milliliter.Det mest kritiske trinnet er å lage merkeløsningen like før bruk. Fjern PBS fra brønner, tilsett 150 mikroliter merkingsløsning til hver brønn og inkuber 30 minutter ved 37 grader Celsius. For å oppdage alle kjerner, legg dapi til hver brønn og bilde på et fluorescerende mikroskop eller bildeplateleser.For å unngå manuell telling og når en bildeplateleser ikke er tilgjengelig, kan denne protokollen endres til en luminescence-avlesning ved hjelp av HRP azide og et ELISA-substrat. For å oppdage EdU ved hjelp av luminscence, må du først forberede trisbufret saltvann med 0,1 % polysorbat 20. Tilsett deretter 150 mikroliter blokkerer bufferen til hver brønn og inkubere i 90 minutter ved romtemperatur.Etter å ha fjernet blokkeringsbufferen, vask cellene tre ganger med 200 mikroliter PBS. For å oppdage inkorporert EdU, må du først forberede 10 ml merkingsløsning per 96-brønnsplate ved å tilsette reagenser fra lagerløsninger i riktig rekkefølge. Først 20 mikroliter THPTA, deretter 20 mikroliter kobbersulfat, fem mikroliter biotin picolyl-azide, 100 mikroliter natriumaskorbat i PBS for et totalt volum på 10 milliliter.Vask brønner fem ganger tre minutter med 200 mikroliter tbst med risting. Slukke endogene peroksidaser med 150 mikroliter med 0,3% hydrogenperoksid i 20 minutter ved romtemperatur. Etter fjerning av hydrogenperoksid, vask fem ganger tre minutter med 200 mikroliter tbst med risting.Tilsett 50 mikroliter fortynnet streptavidin-pepperrotperoksidase i TBST til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i en time. Vask fem ganger tre minutter med 200 mikroliter tbst med risting. Tilsett 50 mikroliter av chemiluminescent ELISA substrat til hver brønn og les umiddelbart i en plateleser som er i stand til å oppdage luminescens.Selv om fluorescerende kjerner kan oppdages av en standard fluorescensplateleser, ved hjelp av luminescensprotokollen, konverteres fluorescerende skanning til en homogen væskeavlesning oppdaget med streptavidin-pepperrotperoksidase og et standard ELISA-substrat. Fordelen med denne metoden sammenlignet med en fluorescerende avlesning er en mer homogen avlesning og platen kan leses i løpet av sekunder sett her når spredning av VSMC som svar på PDGF ble målt. Ulempen er at bakgrunnen er høyere enn med fluorescens, og dermed har negative kontroller en tendens til å være høyere.I et forsøk på å redusere variabiliteten ble resultatene normalisert til innledende celletall. Men i et eget sett med eksperimenter ble det vist at denne metoden ikke er følsom nok til å oppdage små forskjeller i celletall. Den mest effektive og nøyaktige måten å telle EdU positive og totale celler er ved hjelp av en bildeplateleser.Hvis denne typen plateleser ikke er tilgjengelig, vil manuell telling også gi nøyaktige resultater. Når du sammenligner disse to metodene, var EdU-positiv manuell telling identisk med det automatiserte antallet, som var de totale ustimulerte tellingene. Fordelen med disse to metodene er synligheten av cellene som skal telles, forbedret nøyaktighet, og at uspesifikk farging av rusk kan ses og unngås.Den største ulempen med den manuelle tellemetoden er tid. Husk å gjøre merkingsløsningen frisk like før bruk og tilsett ingrediensene i den rekkefølgen som er angitt i den skriftlige protokollen. Hvis fargeintensiteten er svak, kan du prøve å justere forholdet mellom chelator og kobber.Husk at paraformaldehyd er giftig. Den skal brukes i en røykhette mens du bruker hansker. Prosedyren i seg selv er ikke vanskelig, men må kanskje optimaliseres ved å justere chelator til kobberforhold i merkingsløsningen.I tillegg kan inkubasjonstider og lengden på EdU-behandlingen justeres avhengig av celletypen og det spesifikke spørsmålet som stilles. Denne teknikken er kompatibel med celleoverflate og intracellulær farging slik at egenskapene til å dele og ikke dele celler kan bestemmes. Selv om det vanligvis brukes til å måle spredning, kan klikkkjemi også brukes til metabolsk merking av RNA, proteiner, fettsyrer og karbohydrater.Hvis det metabolske målet av interesse er på celleoverflaten, kan levende celler merkes.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Exploring Arteriell glatt muskulatur KV7 Kalium Channel funksjon ved hjelp Patch Clamp Elektrofysiologi og trykk Myography

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering av lungearterien glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Måling av Smooth muskelfunksjon i de Isolert Tissue Bath-applikasjoner til Farmakologi Forskning

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

To-foton avbildning av intracellulær Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Håndtering og nitrogenoksid produksjon i endotel og glatte muskelceller av en isolert Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Måling av kalsium svingninger i løpet av sarkoplasmatisk retikulum av dyrkede glatte muskelceller Bruke FRET basert Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av Murine Coronary vaskulære glatte muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Skade: En Effektiv<em&gt; In vivo</em&gt; Modell av jevn spredning av muskelceller og endotelfunksjon

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...