Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
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Agradecemos a Katie Carroll por assistência técnica. Agradecemos também ao Dr. David Cool e ao Laboratório de Análise Proteômica por instruções e fornecimento do leitor de placas de imagem Cytation. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Wright State Foundation (para L.E.W.).

1. Detecção de EdU usando rótulo fluorescente
<ol><li>Soluções de ações<ol>
<li>Prepare uma solução de ações edu de 5 mM adicionando 12,5 mg de EdU a 10 mL de H2O destilado duplo.</li>
		<li>Prepare os componentes da solução de rotulagem: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg em 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg em 1 mL H2O; fazer fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg em 95,3 m HL 2 Ol2Ozi2 , armazenados em 5 μL alíquo...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. 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Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

A incorporação da UEd é uma forma simples e direta de medir a proliferação celular; é particularmente útil para as células aderentes13. Nosso protocolo usa células musculares lisas, mas é aplicável a qualquer célula aderente (epiteliais, endoteliais, etc.). Embora o protocolo não seja complicado, o único passo crítico é fazer a solução de rotulagem - os ingredientes devem ser adicionados na ordem listada. Além disso, como as manchas ocidentais quimiiluminescentes, se usar a leit...

A proliferação é uma parte crítica da função celular1,2. O controle da proliferação influencia processos normais, como desenvolvimento e processos patológicos, como câncer e doenças cardiovasculares. Acredita-se que o crescimento hiperplástico das células musculares lisas vasculares, por exemplo, seja um precursor da aterosclerose3. Mudanças na proliferação celular também são usadas para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. Dado o seu impacto generalizado, medir a proliferação é um pilar de muitos laboratórios baseados em biologia celular.
A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem de células se a população celular de interesse se dividir rapidamente. Para células de crescimento mais lento, a contagem de células pode ser menos sensível. A proliferação é muitas vezes medida pela incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Embora o padrão ouro seja a incorporação 3H-thymidine, muitos laboratórios estão fugindo desse método, dada a disponibilidade de alternativas mais novas e não radioativas. Estes incluem corantes fluorescentes citoplasmais, detecção de proteínas associadas ao ciclo celular e incorporação de análogos de nucleosídeos não radioativos, como deoxiuridina (BrdU) 5-bromo-2' e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
Corantes citoplasmais, como carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), detectam proliferação porque a intensidade do corantes metades cada vez que a célula divide5. Esta técnica é comumente usada em citometria de fluxo para células não aderentes. Não foi usado muito para pilhas aderentes, mas com a geração nova de leitores da placa da imagem latente isto pode mudar. A detecção de proteínas associadas ao ciclo celular através de técnicas baseadas em anticorpos (citometria de fluxo, imunohistoquímica, etc.) é frequentemente usada para tecidos ou células não aderentes. Estas células/tecidos devem ser fixadas e permeabilizadas antes da coloração. Os análogos de nucleosídeo BrdU e EdU são semelhantes na aproximação a 3H-thymidine, mas sem a inconveniência da radioatividade. A incorporação da BrdU é detectada por anticorpos anti-BrdU e, portanto, as células devem ser fixas e permeabilizadas antes da coloração. Além disso, as células devem ser tratadas com DNAse para expor o epítopo brdu.
A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, na qual os grupos de alquino e azida "clicam" juntos na presença de cobre catalítico. Um ou outro grupo pode serir como a molécula biossintética incorporada ou a molécula4da deteção. Análogos nucleosídeos comercialmente disponíveis têm o grupo de alquin. Para ensaios de proliferação, portanto, o análogo nucleosídeo funcionalizado de alquino é detectado por um azide conjugado a um corante fluorescente ou outro marcador. A incorporação da EdU tem várias vantagens sobre a BrdU. Primeiro, como os grupos de alquino e azida não são encontrados em células de mamíferos, essa interação é altamente específica, com um fundo baixo6. Como ambos os grupos são pequenos, as células não precisam se submeter à desnaturação de DNA para expor o análogo nucleosídeo, conforme necessário para o BrdU7. Finalmente, a química do clique é altamente versátil, e pode ser usada para a rotulagem metabólica de DNA, RNA, proteínas, ácidos graxos e carboidratos8,9,10,11. Se o alvo metabolicamente rotulado de interesse está na superfície celular, as células vivas podem ser rotulados12. Além disso, as células podem ser processadas para coloração imunofluorescente com anticorpos.
O seguinte protocolo descreve o uso da incorporação da UEd e clique na química para medir a proliferação de células musculares suaves vasculares humanas(Figura 1). Mostramos três maneiras diferentes de incorporação de EdU pode ser medido, resultados representativos de cada um, e suas vantagens e desvantagens. Medir a proliferação através da química do clique é particular útil para células de crescimento mais lentas e aderentes. Além disso, a morfologia da célula é bem conservada e a coloração baseada em anticorpos também pode ser realizada.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

A capacidade de uma célula para proliferar é parte integrante da função normal da maioria das células, e a desregulação da proliferação está no coração de muitos processos de doença. Por estas razões, medir a proliferação é uma ferramenta comum usada para avaliar a função celular. A proliferação celular pode ser medida simplesmente pela contagem; no entanto, este é um meio indireto de medir a proliferação. Um meio comum de detectar diretamente as células se preparando para dividir é a incorporação de análogos nucleosídeos rotulados. Estes incluem o análogo radioradioativo do nucleosídeo 3H-thymidine mais análogos não radioativos do nucleosside tais como o deoxyuridine de 5 bromo-2' (BrdU) e 5-etilnyl-2′-deoxyuridine (EdU). A incorporação da EdU é detectada pela química do clique, que tem várias vantagens quando comparada à BrdU. Neste relatório, fornecemos um protocolo para medir a proliferação pela incorporação da EdU. Este protocolo inclui opções para várias leituras, juntamente com as vantagens e desvantagens de cada um. Também discutimos locais onde o protocolo pode ser otimizado ou alterado para atender às necessidades específicas do experimento planejado. Finalmente, tocamos nas maneiras que este protocolo básico pode ser modificado para medir outros metabólitos celulares.

Na Figura 2,demonstramos os resultados de três experimentos diferentes que medem a proliferação do VSMC em resposta ao PDGF. Depois de cultivar as células em meios de comunicação formulados para SMCs, realizamos o experimento em DMEM livre de soro, para eliminar quaisquer efeitos potenciais do soro ou fatores de crescimento na proliferação. Na Figura 2A comparamos os resultados, do mesmo experimento, usando uma leitura fluorescente vs luminescente. Para ...

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Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

A proliferação é uma parte crítica da função celular, e uma leitura comum usada para avaliar a toxicidade potencial de novos medicamentos. A medição da proliferação é, portanto, um ensaio freqüentemente usado na biologia celular. Aqui apresentamos um método simples e versátil de medição da proliferação que pode ser usado em células aderentes e não aderentes.

Medição da proliferação de células musculares vasculares lisas usando química clique

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

A proliferação é uma medida importante da função celular. Este protocolo permite que os investigadores desenvolvam um ensaio de proliferação sensível em seus laboratórios sem o alto custo de kits disponíveis comercialmente. A principal vantagem dessa técnica é que evita o tratamento severo das células e/ou o uso de radioatividade.Demonstrando essa técnica será Vicky Wong, a gerente do meu laboratório. Para avaliar a proliferação, remova as células musculares lisas vasculares de um frasco com mediação celular muscular lisa em soro bovino fetal de 2% e placa a 20.000 células por mililitro em DMEM em uma placa de 96 poços. Cresça as células a 37 graus Celsius durante a noite.Adicione 30 nanogramas por mililitro de fator de crescimento derivado de plaquetas a três a seis poços como um controle positivo para estimular a proliferação. Em seguida, adicione PBS ao mesmo número de poços que um controle negativo. Incubar por 72 horas.Diluir previamente preparado cinco milimões EdU estoque para um mililitro e adicionar dois microliters a cada poço para as últimas 24 horas do período de cultura de 72 horas. Mantenha um conjunto de réplicas sem EdU para determinar fluorescência de fundo e luminescência. Vinte e quatro horas depois, conserte as células removendo a mídia, adicionando 150 microliters por poço de 4% de paraformaldeído e incubar 10 minutos à temperatura ambiente.Remova o paraformaldeído e adicione 150 microliters de 1%TX-100 em água por poço e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Lave três vezes com PBS para remover o TX-100. Para detectar EdU incorporado usando fluorescência, fazer 10 mililitros de solução de rotulagem por placa de 96 poços pouco antes de usar adicionando reagentes de soluções de estoque na ordem certa:20 microliters THPTA, 20 microliters sulfato de cobre, cinco microliters fluoresceína picolyl-azide, e 100 microliters sódio ascorbate em PBS para um volume total de 10 mililitros.O passo mais crítico é fazer a solução de rotulagem pouco antes de ser usada. Remova o PBS dos poços, adicione 150 microliters de solução de rotulagem a cada poço e incuba 30 minutos a 37 graus Celsius. Para detectar todos os núcleos, adicione DAPI a cada poço e imagem em um microscópio fluorescente ou leitor de placas de imagem.Para evitar a contagem manual e quando um leitor de placa de imagem não estiver disponível, este protocolo pode ser modificado para uma leitura de luminescência usando azida HRP e um substrato ELISA. Para detectar EdU usando luminscência, primeiro prepare o soro fisiológico com 0,1% de polisorbato 20. Em seguida, adicione 150 microliters de tampão de bloqueio a cada poço e incubar por 90 minutos em temperatura ambiente.Depois de remover o tampão de bloqueio, lave as células três vezes com 200 microliters de PBS. Para detectar a EdU incorporada, primeiro prepare 10 mililitros de solução de rotulagem por placa de 96 poços adicionando reagentes de soluções de estoque na ordem certa. Primeiro, 20 microliters THPTA, depois 20 microliters sulfato de cobre, cinco microliters biotin picolyl-azide, 100 microliters ascorbate de sódio em PBS para um volume total de 10 mililitros.Lave os poços cinco vezes três minutos com 200 microliters de TBST com agitação. Sacie peroxidases endógenas com 150 microlitres de 0,3% de peróxido de hidrogênio por 20 minutos à temperatura ambiente. Depois de remover peróxido de hidrogênio, lave cinco vezes três minutos com 200 microliters de TBST com agitação.Adicione 50 microliters de peroxidase de streptavidin-rabanete diluído em TBST a cada poço e incubar à temperatura ambiente por uma hora. Lave cinco vezes três minutos com 200 microliters de TBST com agitação. Adicione 50 microliters de substrato ELISA quemiluminescente a cada poço e leia imediatamente em um leitor de placas capaz de detectar luminescência.Embora os núcleos fluorescentes possam ser detectados por um leitor de placas de fluorescência padrão, usando o protocolo de luminescência, a varredura fluorescente é convertida em uma leitura líquida homogênea detectada com peroxidase de rabanete streptavidin-rabídiche e um substrato ELISA padrão. A vantagem deste método em comparação com uma leitura fluorescente é uma leitura mais homogênea e a placa pode ser lida em segundos, como visto aqui quando a proliferação do VSMC em resposta ao PDGF foi medida. A desvantagem é que o fundo é maior do que com fluorescência, portanto, controles negativos tendem a ser maiores.Na tentativa de diminuir a variabilidade, os resultados foram normalizados para a contagem inicial de células. No entanto, em um conjunto separado de experimentos, foi demonstrado que este método não é sensível o suficiente para detectar pequenas diferenças nos números de células. A maneira mais eficiente e precisa de contar células positivas e totais da EdU é usando um leitor de placas de imagem.Se este tipo de leitor de placa não estiver disponível, a contagem manual também produzirá resultados precisos. Ao comparar esses dois métodos, a contagem manual positiva da EdU foi idêntica à contagem automatizada, assim como a contagem total não estimulada. A vantagem desses dois métodos é a visibilidade das células a serem contadas, melhor precisão, e que a coloração inespecífica dos detritos pode ser vista e evitada.A principal desvantagem com o método de contagem manual é o tempo. Lembre-se de fazer a solução de rotulagem fresca pouco antes de usar e adicionar os ingredientes na ordem fornecida no protocolo escrito. Se a intensidade da coloração for fraca, tente ajustar a relação quelador para cobre.Lembre-se que o paraformaldeído é tóxico. Deve ser usado em um capuz de fumaça enquanto usa luvas. O procedimento em si não é difícil, mas pode precisar ser otimizado ajustando as relações chelator para cobre na solução de rotulagem.Além disso, os tempos de incubação e o comprimento do tratamento da EdU podem ser ajustados dependendo do tipo celular e da pergunta específica que está sendo feita. Esta técnica é compatível com a superfície celular e coloração intracelular para que as características das células divisórias e não-divisórias possam ser determinadas. Embora comumente usado para medir a proliferação, a química de cliques também pode ser usada para a rotulagem metabólica de RNA, proteínas, ácidos graxos e carboidratos.Se o alvo metabólico de interesse estiver na superfície celular, as células vivas podem ser rotuladas.

Research

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