Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
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Agradecemos a Katie Carroll por la asistencia técnica. También damos las gracias al Dr. David Cool y al Laboratorio de Análisis de Proteómica por la instrucción y el suministro del lector de placas de imágenes Cytation. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Estatal Wright (a L.E.W.).

1. Detección de EdU usando etiqueta fluorescente
<ol><li>Soluciones de stock<ol>
<li>Prepare una solución de stock EdU de 5 mM añadiendo 12,5 mg de EdU a 10 ml de DobleE2O destilado.</li>
		<li>Preparar los componentes de la solución de etiquetado: 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg en 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg en 1 mL H2O; hacer fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azida (1 mg en 95,3 mL H 2 O 2 O 2 O2O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 O 2 ...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. 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Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

La incorporación de EdU es una forma sencilla y directa de medir la proliferación celular; es particularmente útil para las células adherentes13. Nuestro protocolo utiliza células musculares lisas, pero es aplicable a cualquier célula adherente (epitelial, endotelial, etc.). Aunque el protocolo no es complicado, el único paso crítico es hacer que la solución de etiquetado sea: los ingredientes deben agregarse en el orden indicado. Además, al igual que las manchas occidentales quimiolumin...

La proliferación es una parte crítica de la función celular1,2. El control de la proliferación influye en procesos normales como el desarrollo y en procesos patológicos como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares. El crecimiento hiperplástico de las células musculares lisas vasculares, por ejemplo, se cree que es un precursor de la aterosclerosis3. Los cambios en la proliferación celular también se utilizan para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Dado su impacto generalizado, la medición de la proliferación es un pilar de muchos laboratorios basados en la biología celular.
La proliferación celular se puede medir simplemente contando las células si la población celular de interés se divide con bastante rapidez. Para las células de crecimiento más lento, el recuento de células puede ser menos sensible. La proliferación se mide a menudo mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Aunque el estándar de oro es la incorporación de 3H-timidina, muchos laboratorios están alejándose de este método dada la disponibilidad de alternativas más nuevas y no radiactivas. Estos incluyen colorantes fluorescentes citoplasmáticos, detección de proteínas asociadas al ciclo celular, y la incorporación de análogos de nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2' desoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiruridina (EdU)4.
Los tintes citoplásmicos, como el éster de succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE), detectan la proliferación porque la intensidad del tinte se reduce a la mitad cada vez que la célula divide5. Esta técnica se utiliza comúnmente en la citometría de flujo para células no adherentes. No se ha utilizado mucho para células adherentes, pero con la nueva generación de lectores de placas de imágenes esto puede cambiar. La detección de proteínas asociadas al ciclo celular a través de técnicas basadas en anticuerpos (citometría de flujo, inmunohistoquímica, etc.) se utiliza a menudo para tejidos o células no adherentes. Estas células/tejidos deben ser fijados y permeabilizados antes de la tinción. Los análogos de nucleósidoBrdU y EdU son similares en enfoque a 3H-timidina, pero sin el inconveniente de la radiactividad. La incorporación de BrdU se detecta mediante anticuerpos anti-BrdU, y por lo tanto las células deben ser fijas y permeabilizadas antes de la tinción. Además, las células deben tratarse con DNase para exponer el epítopo de BrdU.
La incorporación de EdU se detecta mediante la química de clics, en la que los grupos de alquino y azida "hacen clic" juntos en presencia de cobre catalítico. Cualquiera de los grupos puede servir como molécula biosintéticamente incorporada o molécula de detección4. Los análogos de nucleósidos disponibles comercialmente tienen el grupo alquino unido. Para los ensayos de proliferación, por lo tanto, el análogo de nucleósido salyne funcionalizado es detectado por un azida conjugada con un tinte fluorescente u otro marcador. La incorporación de EdU tiene varias ventajas sobre BrdU. En primer lugar, debido a que los grupos de alquino y azida no se encuentran en las células de mamíferos, esta interacción es muy específica con un fondo bajo6. Debido a que ambos grupos son pequeños, las células no necesitan someterse a la desnaturalización del ADN para exponer el análogo de nucleósido como se requiere para BrdU7. Por último, la química del clic es muy versátil, y se puede utilizar para el etiquetado metabólico de ADN, ARN, proteínas, ácidos grasos, y carbohidratos8,9,10,11. Si el objetivo metabólicamente etiquetado de interés está en la superficie celular, las células vivas se pueden etiquetar12. Además, las células se pueden procesar para la tinción inmunofluorescente con anticuerpos.
El siguiente protocolo describe el uso de la incorporación de EdU y la química de clic para medir la proliferación en células musculares lisas vasculares humanas(Figura 1). Mostramos tres formas diferentes de medir la incorporación de EdU, resultados representativos de cada uno, y sus ventajas y desventajas. La medición de la proliferación a través de la química de clics es particularmente útil para las células de crecimiento adherente y más lentas. Además, la morfología de la célula está bien mantenida y también se puede realizar la tinción basada en anticuerpos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

La capacidad de una célula para proliferar es integral a la función normal de la mayoría de las células, y la desregulación de la proliferación está en el corazón de muchos procesos de la enfermedad. Por estas razones, la medición de la proliferación es una herramienta común utilizada para evaluar la función celular. La proliferación celular se puede medir simplemente contando; sin embargo, se trata de un medio indirecto para medir la proliferación. Un medio común de detectar directamente las células que se preparan para dividir es mediante la incorporación de análogos de nucleósidos etiquetados. Estos incluyen el nucleósido radioactivo analógico 3H-timidina más análogos nucleósidos no radiactivos tales como 5-bromo-2' deoxiuridina (BrdU) y 5-etil-2o-desoxiuridina (EdU). La incorporación de EdU se detecta por química de clic, que tiene varias ventajas en comparación con BrdU. En este informe, proporcionamos un protocolo para medir la proliferación mediante la incorporación de EdU. Este protocolo incluye opciones para varias lecturas, junto con las ventajas y desventajas de cada una. También discutimos los lugares donde el protocolo se puede optimizar o modificar para satisfacer las necesidades específicas del experimento planeado. Por último, tocamos las formas en que este protocolo básico se puede modificar para medir otros metabolitos celulares.

En la Figura 2,demostramos los resultados de tres experimentos diferentes que miden la proliferación de VSMC en respuesta al PDGF. Después de cultivar las células en medios formulados para smCs, llevamos a cabo el experimento en DMEM libre de suero, para eliminar cualquier efecto potencial de los factores séricos o de crecimiento en la proliferación. En la Figura 2A comparamos los resultados, del mismo experimento, utilizando una lectura fluorescente vs lum...

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Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

La proliferación es una parte crítica de la función celular, y una lectura común utilizada para evaluar la toxicidad potencial de nuevos fármacos. Por lo tanto, la medición de la proliferación es un ensayo frecuentemente utilizado en la biología celular. Aquí presentamos un método simple y versátil de medición de la proliferación que se puede utilizar en células adherentes y no adherentes.

Medición de la proliferación de células musculares lisas vasculares mediante la química de clics

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

La proliferación es una medida importante de la función celular. Este protocolo permite a los investigadores desarrollar un ensayo de proliferación sensible en sus laboratorios sin el alto costo de los kits disponibles comercialmente. La principal ventaja de esta técnica es que evita el tratamiento duro de las células y/o el uso de radiactividad.Demostrando esta técnica estará Vicky Wong, la gerente de mi laboratorio. Para ensayar la proliferación, elimine las células musculares lisas vasculares de un matraz con medios de células musculares lisas en un suero bovino 2%fetal y una placa a 20.000 células por mililitro en DMEM en una placa de 96 pozos. Crecer las células a 37 grados Celsius durante la noche.Añadir 30 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento derivado de plaquetas a tres a seis pozos como un control positivo para estimular la proliferación. A continuación, agregue PBS al mismo número de pozos que un control negativo. Incubar durante 72 horas.Diluir el caldo de EdU de cinco mililitros previamente preparado a un milimolar y añadir dos microlitros a cada pozo durante las últimas 24 horas del período de cultivo de 72 horas. Mantenga un conjunto de réplicas sin EdU para determinar la fluorescencia y la luminiscencia de fondo. Veinticuatro horas más tarde, fijar las células mediante la eliminación de medios, a continuación, añadir 150 microlitros por pozo de 4%paraformaldehído e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.Retire el paraformaldehído y agregue 150 microlitros de 1%TX-100 en agua por pozo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar tres veces con PBS para quitar el TX-100. Para detectar EdU incorporado usando fluorescencia, hacer 10 mililitros de solución de etiquetado por placa de 96 pozos justo antes de su uso mediante la adición de reactivos de soluciones de stock en el orden correcto: 20 microlitros THPTA, 20 microlitros sulfato de cobre, cinco microlitros fluoresceína picol-azida, y 100 microlitros asbato de sodio en PBS para un volumen total de 10 mililitros.El paso más crítico es hacer que la solución de etiquetado sea justo antes de su uso. Retire el PBS de los pozos, agregue 150 microlitros de solución de etiquetado a cada pozo e incubar 30 minutos a 37 grados centígrados. Para detectar todos los núcleos, agregue DAPI a cada pozo e imagen en un microscopio fluorescente o lector de placas de imagen.Para evitar el recuento manual y cuando no hay disponible un lector de placas de imagen, este protocolo se puede modificar a una lectura de luminiscencia utilizando azide HRP y un sustrato ELISA. Para detectar EdU utilizando luminiscencia, primero prepare la solución salina tris-buffered con 0.1%polisorbato 20. A continuación, agregue 150 microlitros de tampón de bloqueo a cada pozo e incubar durante 90 minutos a temperatura ambiente.Después de retirar el tampón de bloqueo, lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS. Para detectar EdU incorporado, primero prepare 10 mililitros de solución de etiquetado por placa de 96 pozos añadiendo reactivos de las soluciones de stock en el orden correcto. Primero, 20 microlitros THPTA, luego 20 microlitros sulfato de cobre, cinco microlitros biotina picol-azida, 100 microlitros de ascorbato de sodio en PBS para un volumen total de 10 mililitros.Lave los pozos cinco veces tres minutos con 200 microlitros de TBST con agitación. Apagar peróxidasas endógenas con 150 microlitros de 0,3% de peróxido de hidrógeno durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el peróxido de hidrógeno, lave cinco veces tres minutos con 200 microlitros de TBST con agitación.Añadir 50 microlitros de peroxidasa diluida de estreptavidina-caballo en TBST a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Lavar cinco veces tres minutos con 200 microlitros de TBST con agitación. Añadir 50 microlitros de sustrato ELISA quimiuminoscente a cada pozo y leer inmediatamente en un lector de placas capaz de detectar luminiscencia.Aunque los núcleos fluorescentes pueden ser detectados por un lector de placas de fluorescencia estándar, utilizando el protocolo de luminiscencia, el escaneo fluorescente se convierte en una lectura de líquido homogénea detectada con peroxidasa de rábano de caballo de estreptavidina y un sustrato ELISA estándar. La ventaja de este método en comparación con una lectura fluorescente es una lectura más homogénea y la placa se puede leer en segundos como se ve aquí cuando se midió la proliferación de VSMC en respuesta a PDGF. La desventaja es que el fondo es más alto que con la fluorescencia, por lo tanto los controles negativos tienden a ser más altos.En un intento de disminuir la variabilidad, los resultados se normalizaron al recuento de celdas inicial. Sin embargo, en un conjunto separado de experimentos, se demostró que este método no es lo suficientemente sensible como para detectar pequeñas diferencias en los números de celda. La forma más eficiente y precisa de contar las células positivas y totales de EdU es mediante el uso de un lector de placas de imágenes.Si este tipo de lector de placas no está disponible, el recuento manual también producirá resultados precisos. Al comparar estos dos métodos, el recuento manual positivo de EdU era idéntico al recuento automatizado, al igual que los recuentos totales no estimulados. La ventaja de estos dos métodos es la visibilidad de las células a contar, una mayor precisión y que se pueden ver y evitar manchas inespecíficas de escombros.La principal desventaja con el método de conteo manual es el tiempo. Recuerde hacer la solución de etiquetado fresca justo antes de su uso y añadir los ingredientes en el orden proporcionado en el protocolo escrito. Si la intensidad de la tinción es tenue, intente ajustar la relación quelante a cobre.Recuerde que el paraformaldehído es tóxico. Se debe utilizar en una campana de humos mientras usa guantes. El procedimiento en sí no es difícil, pero puede ser necesario optimizar mediante el ajuste de las relaciones de quelante a cobre en la solución de etiquetado.Además, los tiempos de incubación y la duración del tratamiento con EdU se pueden ajustar dependiendo del tipo de célula y de la pregunta específica que se haga. Esta técnica es compatible con la superficie celular y la tinción intracelular de modo que se puedan determinar las características de las células divisorias y no divisorias. Aunque comúnmente se utiliza para medir la proliferación, la química de clics también se puede utilizar para el etiquetado metabólico de ARN, proteínas, ácidos grasos y carbohidratos.Si el objetivo metabólico de interés está en la superficie celular, las células vivas se pueden etiquetar.

Research

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Biology

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