Name: measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry
Uploaded: 2019-10-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Katie Carroll'a teknik yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr David Cool ve Proteomics Analiz Laboratuvarı öğretim ve Cytation görüntüleme plaka okuyucu sağlanması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Wright Devlet Vakfı hibe (L.E.W.) tarafından desteklendi.

1. Floresan etiket kullanılarak EdU'nun algılanması
<ol><li>Stok çözümleri<ol>
<li>10 mL çift distile H2O'ya 12,5 mg EdU ekleyerek 5 mM EdU stok çözeltisi hazırlayın.</li>
		<li>Etiketleme çözeltisi bileşenlerini hazırlayın: 200 mM tris (3-hidroksipropiltririlolylmethyl)amin (THPTA) (100 mg in 1.15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (1m CuSO 1 mL H2O; taze olun), 10 mM Cy3 pikolyl-azide (1 mg in 95.3 m HL2L2L - 20 °C'de 5°L aliquots ve 1 M sodyum askorbat (1 m...

<ol>
	<li>Fuster, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+proliferation+in+atherosclerosis:+Insights+from+animal+models+and+human+studies.">Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies.</a> Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).</li><li>Zhu, J., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+of+cell+growth+and+proliferation.">Metabolic regulation of cell growth and proliferation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li><li>Cizek, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+atherosclerosis+and+the+development+of+preatherosclerotic+intimal+hyperplasia.">Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia.</a> Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).</li><li>Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+Techniques+to+assess+cell+proliferation.">Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).</li><li>Quah, B. J. C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Carboxyfluorescein+Diacetate+Succinimidyl+Ester+(CFSE)+to+Monitor+Lymphocyte+Proliferation.">The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).</li><li>Sletten, E., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+Chemistry:+Fishing+for+Selectivity+in+a+Sea+of+Functionality.">Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Cycle+Position+in+Mammalian+Cells.">Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).</li><li>Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+for+Analysis+of+Cell+Proliferation+in+Flow+Cytometry.">Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry.</a> Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).</li><li>Jiang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+dynamic+glycosylation+in+vivo+using+supersensitive+click+chemistry.">Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).</li><li>Izquierdo, E., Delgado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+chemistry+in+sphingolipid+research.">Click chemistry in sphingolipid research.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).</li><li>Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Live+Cells+by+Copper-Catalyzed+Alkyne-Azide+Click+Chemistry.">Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).</li><li>Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+Functional+IL-2+Receptor+in+Vascular+Smooth+Muscle+Cells.">Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells.</a> The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).</li><li>Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mammalian cell viability: methods and protocols. , (2011).</li><li>Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+Cell-compatible+Click+Chemistry+with+Copper-chelating+Azides+for+Biomolecular+Labeling.">Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling.</a> Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).</li><li>Bescancy-Webler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+the+Efficacy+of+Bioorthogonal+Click+Reactions+for+Bioconjugation:+A+Comparative+Study.">Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study.</a> Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).</li><li>Diermeier-Daucher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+specific+applicability+of+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+(EDU)+for+dynamic+proliferation+assessment+in+flow+cytometry.">Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).</li><li>Cie&#347;lar-Pobuda, A., Los, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospects+and+limitations+of+&#8220;Click-Chemistry&#8221;-based+DNA+labeling+technique+employing+5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine+(EdU).">Prospects and limitations of &#8220;Click-Chemistry&#8221;-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2&#8242;deoxyuridine (EdU).</a> Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).</li></ol>

EdU'nun birleştirilmesi hücre çoğalmasını ölçmenin basit ve basit bir yoludur; özellikle yapışık hücreler için yararlıdır13. Protokolümüz düz kas hücreleri kullanır, ancak herhangi bir yapışık hücre için geçerlidir (epitel, endotel, vb). Protokol karmaşık olmasa da, tek kritik adım etiketleme çözümünü yapmaktır — maddeler listelenen sıraya eklenmelidir. Buna ek olarak, kemilüminesans Batı lekeleri gibi, lüminesans okuma kullanıyorsanız plaka hemen okunma...

Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır1,2. Proliferasyonun kontrolü, kanser ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişim ve patolojik süreçler gibi normal süreçleri etkiler. Vasküler düz kas hücrelerinin hiperplastik büyüme, örneğin, ateroskleroz bir habercisi olduğu düşünülmektedir3. Hücre çoğalmasındaki değişiklikler, yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için de kullanılmaktadır. Yaygın etkisi göz önüne alındığında, proliferasyon ölçümü birçok hücre biyolojisi tabanlı laboratuvarların dayanak noktasıdır.
Hücre çoğalması, hücre popülasyonu oldukça hızlı bölünürse, sadece hücreleri sayarak ölçülebilir. Yavaş büyüyen hücreler için hücre sayıları daha az hassas olabilir. Proliferasyon genellikle etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesi ile ölçülür. Altın standart 3H-timidin dahil olmasına rağmen, birçok laboratuvarlar yeni, radyoaktif olmayan alternatifler durumu göz önüne alındığında bu yöntemden uzak laşıyorlar. Bunlar arasında sitoplazmik floresan boyalar, hücre döngüsü ile ilişkili proteinlerin saptanması ve 5-bromo-2' deoksiürin (BrdU) ve 5-ethynyl-2′-deoksitürin(EdU) 4 gibi radyoaktif olmayan nükleozit analoglarının birleşmesi sayılabilir.
Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFSE) gibi sitoplazmik boyalar, hücre5'iher bölünde de boyanın yoğunluğu yarıya indiği için çoğalma tespit eder. Bu teknik genellikle non-yapışık hücreler için akış sitometri kullanılır. Bu yapışık hücreler için çok kullanılmamıştır, ancak görüntüleme plaka okuyucuların yeni nesil ile bu değişebilir. Antikor temelli tekniklerle (akış sitometrisi, immünohistokimya, vb.) hücre döngüsü ile ilişkili proteinlerin saptanması genellikle dokular veya non-yapışık hücreler için kullanılır. Bu hücreler/dokular boyama dan önce sabit ve permeabilize edilmelidir. Nükleozit analogları BrdU ve EdU 3H-timidin yaklaşım benzer, ancak radyoaktivite rahatsızlık olmadan. BrdU'nun dahil edilmesi anti-BrdU antikorları tarafından saptanmıştır ve bu nedenle hücreler boyamadan önce sabit ve permeabilize edilmelidir. Buna ek olarak, brdU epitop maruz kalmak için hücreler DNase ile tedavi edilmelidir.
EdU'nun birleştirilmesi, alkin ve azid gruplarının katalitik bakır varlığında bir araya gelip "tıkladığı" tıklama kimyası ile saptanır. Her iki grup biyosentetik olarak dahil molekül veya algılamamolekülü 4olarak hizmet verebilir. Ticari olarak mevcut nükleozit analogları alkyne grubu bağlı. Bu nedenle, alkine fonksiyonel nükleozit analogunun floresan boya veya diğer belirteçlere konjuge bir azid ile saptanır. EdU'nun bã1/4tÃ§eye karÅ Ä± Ã§ok sayÄ±da avantajı bulunuyor. Birincisi, alkine ve azit grupları memeli hücrelerinde bulunmadığından, bu etkileşim düşük arka plan6ile son derece spesifiktir. Her iki grup da küçük olduğundan, brdU7için gerekli olan nükleozit analogunu ortaya çıkarmak için hücrelerin DNA denatürasyonuna geçmesi gerekmez. Son olarak, tıklama kimyası çok yönlü, ve DNA, RNA, protein, yağ asitleri vekarbonhidratlar8,9,10,11metabolik etiketleme için kullanılabilir. Metabolik olarak etiketlenmiş ilgi hedefi hücre yüzeyinde ise, canlı hücreler12olarak etiketlenebilir. Buna ek olarak, hücreler daha fazla antikorlar ile immünofloresan boyama için işlenebilir.
Aşağıdaki protokol, insan vasküler düz kas hücrelerinde çoğalmayı ölçmek için EdU kuruluş ve tıklama kimyası kullanımını açıklar(Şekil 1). EdU'nun üç farklı şekilde ölçülebileceğini, her birinden temsili sonuçlar ve bunların avantaj ve dezavantajlarının ölçülebileceğini gösteriyoruz. Tıklama kimyası ile çoğalma ölçme özellikle yapışık, yavaş büyüyen hücreler için yararlıdır. Buna ek olarak, hücrenin morfolojisi iyi korunur ve antikor bazlı boyama da yapılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-Ethynyl-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NE08701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1167-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C1297-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 picolyl azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1178-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Microscope</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11140-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R37606</td>
			<td>DAPI nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3002802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>S3014-5kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Signal ELISA Femto</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI137075</td>
			<td>ELISA substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THPTA</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1010-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X 100</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring proliferation of vascular smooth muscle cells using click chemistry

Bir hücrenin çoğalma yeteneği çoğu hücrenin normal fonksiyonunun ayrılmaz bir parçasıdır ve proliferasyon un disregülasyonu birçok hastalık süreçlerinin merkezinde yer alır. Bu nedenlerden dolayı, proliferasyonölçümü hücre fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan yaygın bir araçtır. Hücre çoğalması basitçe sayılarak ölçülebilir; ancak bu, çoğalma ölçmek için dolaylı bir araçtır. Bölmeye hazırlanan hücreleri doğrudan algılamanın ortak yollarından biri, etiketli nükleozit analoglarının birleştirilmesidir. Bunlar arasında radyoaktif nükleozit analog 3H-timinin artı 5-bromo-2' deoksiürin (BrdU) ve 5-etirnil-2′-deoksitürin (EdU) gibi radyoaktif olmayan nükleozit analogları bulunmaktadır. EdU'nun dahil edilmesi, BrdU ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları olan tıklama kimyası ile algılanır. Bu raporda, EdU'nun dahil edilmesiyle çoğalma ölçmek için bir protokol salıyoruz. Bu protokol, her birinin avantajları ve dezavantajları ile birlikte çeşitli okumalar için seçenekler içerir. Ayrıca, protokolün planlanan deneyin özel gereksinimlerini karşılamak üzere optimize edilebildiği veya değiştirilebileceği yerleri de tartışırız. Son olarak, bu temel protokolün diğer hücre metabolitlerini ölçmek için değiştirilme yollarına değiniyoruz.

Şekil2'de, PDGF'ye yanıt olarak VSMC'nin çoğalmasını ölçen üç farklı deneyin sonuçlarını gösteriyoruz. Kobİ'ler için formüle edilmiş ortamdaki hücreleri büyüttükten sonra, serum veya büyüme faktörlerinin çoğalma üzerindeki olası etkilerini ortadan kaldırmak için serumsuz DMEM'de deney yaptık. Şekil 2A'da, aynı deneyden elde edilen sonuçları floresan vs Parlak okuma kullanarak karşılaştırıyoruz. Bu plakaları okumak için...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry at JoVE.com

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır ve yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yaygın bir okumadır. Bu nedenle, proliferasyonun ölçülmesi hücre biyolojisinde sıkça kullanılan bir ispondur. Burada, yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde kullanılabilecek basit ve çok yönlü bir proliferasyon ölçme yöntemi salıyoruz.

Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...

Proliferasyon hücre fonksiyonunun önemli bir ölçüsüdür. Bu protokol, araştırmacıların ticari olarak mevcut kitlerin yüksek maliyeti olmadan laboratuvarlarında hassas bir proliferasyon tahlilleri geliştirmelerine olanak tanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin sert muameleve / veya radyoaktivite kullanımını önler olmasıdır.Bu tekniği göstermek Vicky Wong olacak, laboratuvarımda müdür. Proliferasyon tahnit etmek için, 96-iyi plaka dmem mililitre başına 20, 000 hücreleri 20, 000 hücreleri% 2 fetal sığır serum ve plaka düz kas hücresi media ile bir şişe vasküler düz kas hücreleri kaldırmak. Hücreleri bir gecede 37 derecede büyütün.Çoğalmayı teşvik etmek için olumlu bir kontrol olarak üç ila altı kuyulara mililitre trombosit elde edilen büyüme faktörü başına 30 nanogram ekleyin. Ardından PBS'yi negatif denetimle aynı sayıda kuyuya ekleyin. 72 saat kuluçkaya yat.Seyreltik daha önce bir milimolar için beş milimolar EdU stok hazırlanan ve 72 saatlik kültür döneminin son 24 saat için her kuyu ya iki mikrolitre ekleyin. Arka plan floresansını ve Parlaklığı belirlemek için EdU olmadan bir dizi çoğaltma tutun. Yirmi dört saat sonra, medya kaldırarak hücreleri düzeltmek, sonra% 4 paraformaldehit kuyu başına 150 mikrolitre ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.Paraformaldehit çıkarın ve kuyu başına su ve 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka 150 mikrolitre ekleyin. TX-100'ü çıkarmak için PBS ile üç kez yıkayın. Floresan kullanarak dahil EdU tespit etmek için, doğru sırada stok çözeltileri reaktifler ekleyerek kullanmak için hemen önce 96-iyi plaka başına etiketleme çözeltisi 10 mililitre yapmak:20 mikrolitre THPTA, 20 mikrolitre bakır sülfat, beş mikrolitre floresan pikolyl-azis, ve 100 mikrolitre sodyum ascorbate pbs içine toplam 10 mililitre mililitre mililitre lik itme alanı.En kritik adım, etiketleme çözümlerini kullanmadan hemen önce yapmaktır. PBS'yi kuyulardan çıkarın, her kuyuya 150 mikrolitre etiketleme çözeltisi ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Tüm çekirdekleri algılamak için, floresan mikroskop veya görüntüleme plakası okuyucuüzerinde her kuyuya VE görüntüye DAPI ekleyin.Manuel sayma önlemek için ve bir görüntüleme plaka okuyucu mevcut olmadığında, bu protokol HRP azide ve ELISA substrat kullanarak bir parlaklık okuma değiştirilebilir. Luminscence kullanarak EdU'yi tespit etmek için öncelikle %0,1 polisorbat 20 ile tris-tamponlu salin hazırlayın. Daha sonra her kuyuya 150 mikrolitre bloke tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 90 dakika kuluçkaya yatırın.Engelleme tamponu çıkardıktan sonra hücreleri 200 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Dahili EdU'yu tespit etmek için, ilk olarak stok çözümlerinden doğru sırada reaktifler ekleyerek 96 kuyulu plaka başına 10 mililitre etiketleme çözeltisi hazırlayın. İlk olarak, 20 mikrolitre THPTA, sonra 20 mikrolitre bakır sülfat, beş mikrolitre biotin pikol-azid, 100 mikrolitre sodyum 10 mililitre toplam hacmi için PBS içine akorbat.Sallayarak TBST 200 mikrolitre ile beş kez üç dakika kuyuları yıkayın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca % 0.3 hidrojen peroksit 150 mikrolitre ile endojen peroksidazları söndürün. Hidrojen peroksit çıkardıktan sonra, sallayarak TBST 200 mikrolitre ile beş kez üç dakika yıkayın.Her iyi ve bir saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka tbst seyreltilmiş streptavidin-horseradish peroksidaz 50 mikrolitre ekleyin. Sallayarak TBST 200 mikrolitre ile beş kez üç dakika yıkayın. Her kuyuya 50 mikrolitre kemilüminesans ELISA substratı ekleyin ve lüminesans algılayabilen bir plaka okuyucuda hemen okuyun.Floresan çekirdekleri standart bir floresan plaka okuyucu tarafından tespit edilebilse de, lüminesans protokolü kullanılarak floresan tazyik, streptavidin-horseradish peroksidaz ve standart ELISA substratı ile saptanan homojen sıvı okumaya dönüştürülür. Floresan okuma ile karşılaştırıldığında bu yöntemin avantajı daha homojen bir okuma ve plaka pdgf yanıt olarak VSMC çoğalması ölçüldüğünde burada görüldüğü gibi saniyeler içinde okunabilir. Dezavantajı arka plan floresan ile daha yüksek olmasıdır, bu nedenle negatif kontroller daha yüksek olma eğilimindedir.Değişkenliği azaltmak amacıyla sonuçlar ilk hücre sayılarına göre normalleştirildi. Ancak, ayrı bir deneme kümesinde, bu yöntemin hücre sayılarında küçük farklılıkları algılayacak kadar hassas olmadığı gösterilmiştir. EdU pozitif ve toplam hücreleri saymak için en verimli ve doğru yolu bir görüntüleme plaka okuyucu kullanarak.Bu tür plaka okuyucu kullanılamıyorsa, manuel sayma da doğru sonuçlar verecektir. Bu iki yöntem karşılaştırılırken, EdU pozitif manuel sayısı toplam uyarlanmamış sayımlar ile otomatik sayım ile aynıydı. Bu iki yöntemin avantajı, sayılacak hücrelerin görünürlüğü, doğruluğun iyileştirilmesi ve enkazın spesifik olmayan boyanması görülebilmekte ve önlenebilir.Manuel sayma yönteminin en büyük dezavantajı zaman. Etiketleme çözümünü kullanmadan hemen önce taze yapmayı unutmayın ve maddeleri yazılı protokolde verilen sıraya ekleyin. Boyama yoğunluğu loşsa, şelatörü bakır oranına göre ayarlamayı deneyin.Paraformaldehitin toksik olduğunu unutmayın. Eldiven giyerken duman kaputunda kullanılmalıdır. Yordamın kendisi zor değildir, ancak etiketleme çözeltisindeki bakır oranlarına göre şelatör ayarlayarak optimize edilmesi gerekebilir.Buna ek olarak, kuluçka süreleri ve EdU tedavisinin uzunluğu hücre tipine ve sorulan özel soruya bağlı olarak ayarlanabilir. Bu teknik hücre yüzeyi ve hücre içi boyama ile uyumludur, böylece bölünen ve bölünemeyen hücrelerin özellikleri belirlenebilir. Yaygın olarak proliferasyon ölçmek için kullanılmasına rağmen, tıklama kimyası da RNA, proteinler, yağ asitleri ve karbonhidratmetabolik etiketleme için kullanılabilir.Eğer metabolik hedef hücre yüzeyinde yse, canlı hücreler etiketlenebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Metabolik Etiketleme ve Bioorthogonal tıklayın Kimya Zebra balığı Embriyolar Görüntüleme glukanlardır

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Murin Aort Kırma Yaralanması: Verimli<emIn vivo</em&gt; Düz Kas Hücresi çoğalması ve Endotel Fonksiyon Modeli

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...