Name: enrichment and detection of clostridium perfringens toxinotypes in retail food samples
Uploaded: 2019-10-18T14:00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples at JoVE.com

Denne forskning har ikke modtaget nogen specifik finansiering fra den offentlige, kommercielle eller ikke-profit sektorer.

Bemærk: C. perfringens betragtes som en biosikkerheds risikoniveau 2 (BSL2) organisme. Selv om ikke alle fødevareprøver vil indeholde C. perfringens, skal alle dyrkede prøver behandles som sådanne. Alle passende forholdsregler og personale beskyttelsesudstyr (PPE) skal bæres til enhver tid. At defiltrere alt materiale inden bortskaffelse.
1. Forbered modificeret rpm4,15
<ol><li>Kombiner 30 g/L Fluid thioglycolat medium, 60 g/L gelatine, 5 g/L peptone, 5 g/L glucose, 5 g/L kaliumphosphat dibasic, 3 g/L gær ekstrakt, 1,5 g/L natriumchlorid, 0,5 g/L jernholdige sulfat i deioniseret vand indtil jævnt dispergeret. Vi laver typisk 1 L-batches.</li>
	<li>Autoklave ved 121 °C i 15 min.</li>
	<li>Afkøles til ca. 40 °C.</li>
	<li>Når RPM er køligt, tilsættes D-cycloserin til en endelig koncentration på 440 mg/L. Bemærk: Stam koncentrationer af D-cycloserin opløst i sterilt vand ved 50 mg/mL kan opbevares ved-20 °C til fremtidig brug.</li>
	<li>Overfør aseptisk 10 mL RPM til 15 mL koniske rør. RPM kan tilberedes i bundter og opbevares ved 4 °C i op til en måned.</li>
	<li>Varm RPM til 37 °C før brug.</li>
</ol>2. opsamling af prøver og RPM-inkubation
<ol><li>Transport af fødevarer til laboratoriet under omgivende temperaturer inden for 1 h. fødevarer kan transporteres i original emballage eller sterile beholdere. Hvis den ikke testes med det samme, kan maden opbevares ved-20 °C, indtil den anvendes. Læg mærke til typen af fødevarer og oprindelseslandet i henhold til emballage etiketten, hvis en sådan findes, samt alle andre relevante oplysninger.</li>
	<li>Fjern ca. 1,0 – 2,0 g mad og Overfør til steril Petri skål eller tilsvarende. Fint hakket med en steril barberkniv eller skalpel.</li>
	<li>Der inokuleres i 10 mL fosfatbuffer saltvand (PBS) i et 15 mL konisk rør. Bland godt.<ol>
<li>For at vælge for vegetativt celler overføres 5 ml PBS-Food blandingen til et 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml rpm. Fastgør låget stramt.</li>
		<li>For at vælge sporer skal de resterende 5 mL PBS-Food-blandinger opvarmes ved 85 °C i 15 minutter og derefter overføres til et 15 mL konisk rør, der indeholder 10 mL RPM. Fastgør låget stramt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vortex og invertere mad-RPM kulturer for at sikre fuldstændig blanding.</li>
	<li>Tætsiddende koniske rør og wrap låg med paraffin film eller plast wrap for at sikre en anaerobe miljø.</li>
	<li>Inkuber natten over (ON) ved 37 °C.</li>
	<li>Den følgende morgen notat enhver turbiditet eller gæring i RPM rør.</li>
</ol>3. TSC "sandwich" plating
<ol><li>Inokulere på RPM kulturer i TSC agar ved hjælp af en "sandwich" teknik (figur 2) beskrevet nedenfor.</li>
	<li>Forbered TSC agar i fabrikantens anvisninger.<ol>
<li>TSC-pladerne forberedes ved at overføre 10 mL smeltet TSC-agar til sterile Petri skåle og gøre det muligt at størkne. Disse kan tilberedes i avanceret og opbevares ved 4 °C. Sørg for, at pladerne opvarmes til stuetemperatur før brug.</li>
		<li>For det øverste lag af TSC-pladen opretholdes den resterende smeltede TSC-agar ved 40 °C. Bemærk: Selvom agar's smeltepunkt er over 85 °C, størkner den smeltede agar omkring 32 – 45 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hent omhyggeligt de på RPM kulturer og Overfør 100 μL til TSC agar base. På grund af gæring, nogle kulturer kan være under pres. Sørg for at bære alle relevante PV.</li>
	<li>Spred RPM-inokulum ved hjælp af steriliserede glasperler eller celle sprederen.</li>
	<li>Lad RPM blive "absorberet" i TSC agar i 5 – 10 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Overfør forsigtigt 20 mL smeltet, 40 °C TSC agar til pladen ved hjælp af en serologisk pipette.</li>
	<li>Udskift Petri skålen, og lad TSC agar helt størkne ved stuetemperatur.</li>
	<li>Vend Petri skålen og Inkuber ved 37 °C på.</li>
	<li>Hvis der ønskes serielle fortyndinger, skal du udføre fortyndinger af ON RPM-kulturerne i frisk, forvarmet RPM før inokulering til TSC agar.</li>
</ol>4. under dyrkning af sulfit reducerende kolonier
<ol><li>Den følgende morgen, fjerne plader fra inkubator og undersøge for bakteriel vækst. Aerobe bakterier kan være til stede på overfladen af agar. Anaerobe bakterier vil blive fundet voksende indlejret i agar. Sulfit-reducerende bakterier vil vende omgivende agar sort. Mulige C. perfringens kolonier vil være sorte og indlejret i agar.</li>
	<li>
C. perfringens formodede kolonier vil være positive for sulfit reduktion og vil fremstå sort, indlejret i agar. Ved hjælp af en steril engangs pipette "pluck" de sorte kolonier fra agar og overføres til 10 mL frisk RPM i et 15 mL konisk rør. Det er vigtigt, at luften fra pipetten udvises før piercing agar.</li>
	<li>Hvis der er en tæt mængde aerob bakterievækst på pladens overflade, skal du bruge en steril celle skraber til at fjerne kolonier fra udvalgte områder. Flere C. perfringens mistænkte kolonier kan udtages fra samme TSC-plade i separate rpm-kulturer.</li>
	<li>Tætsiddende koniske rør låg og wrap i paraffin film eller plast wrap. Inkuber ved 37 °C.</li>
</ol>5. DNA-ekstraktion
<ol><li>Fjern på RPM kulturer og undersøge for tegn på vækst, herunder Turbiditet og gæring.</li>
	<li>Vend forsigtigt RPM kultur for at sprede alle bosatte bakterier og forsigtigt åbne. 1 mL af kulturen overføres til et mikrocentrifuge glas.</li>
	<li>Centrifugeres ved tophastighed (ca. 15.000 x g) i 10 min. til pellet bakterier.</li>
	<li>Vask pellet med 1 mL steril PBS.<ol>
<li>Under visse omstændigheder vil uforfordøjet gelatine bosætte sig oven på pelleterede bakterier. At fjerne gelatine, "Fluff" off gelatine ved forsigtigt agitere med PBS ved hjælp af en mikropipette. Dette vil "fnug op" gelatine, mens de forlader den bakterielle pellet intakt.</li>
		<li>Fjern PBS-gelatine blandingen med blid aspiration. De resterende bakterielle piller gensuspenderes med 1 mL frisk PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuger den opslæmmede bakterielle pellet ved tophastighed i 10 minutter, og Aspirér forsigtigt supernatanten.</li>
	<li>Udfør straks DNA-ekstraktion ved hjælp af et DNA-ekstraktions udstyr og en protokol, der er specielt skabt til ekstraktions DNA fra gram positive bakterier (Se tabellen over materialer).</li>
	<li>Brug straks det ekstraherede DNA eller Opbevar ved-20 °C indtil PCR-analyse.</li>
</ol>6. påvisning af C. perfringens via PCR-genotype
<ol><li>For at afgøre, om kulturer er positive for C. perfringens toxinotypes, undersøger ekstraheret DNA for forskellige toksin gener via PCR. Bemærk: fordi vi er mest interesseret i Epsilon-toksin producerende stammer type B og D C. perfringens, evaluerer vi for tilstedeværelsen af alfa-, beta-og Epsilon-toksin gener. Primere er opført i tabel 2. Primers for 16s ribosomale DNA anvendes som en DNA-ekstraktions kontrol. Yderligere primere kan bruges til at teste for toxinotypes A til G og kan findes i publiceret litteratur2,12,13.</li>
	<li>Brug tidligere ekstraherede C. perfringens DNA som en positiv kontrol. Denne kontrol sikrer, at alle komponenter i PCR-reaktionerne virker. Vi bruger DNA udvundet fra C. perfringens type B (atcc 3626) som vores positive kontrol. Vokse ATCC 3636 på i RPM ved 37 °C og udtrække DNA ved hjælp af de samme metoder, der er beskrevet i trin 5.1 – 5.7. Opbevares udtrukket DNA ved-20 °C indtil brug.</li>
	<li>Angiv PCR-betingelser som følger: 94,0 °C i 3 min; 94,0 °C i 30 s; 47,9 °C i 30 s, 72,0 °C i 1 min (Gentag trin 2 – 4 for 35 cyklusser); 72,0 °C i 10 min.</li>
	<li>For at bekræfte PCR-produkter skal du køre PCR-reaktioner på en 1,8 g/100 mL agopstået gel ved hjælp af standardteknikker. Forventede PCR-produktstørrelser er angivet i tabel 2. Typiske PCR-resultater vises i figur 3.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+perfringens:+toxinotype+and+genotype.">Clostridium perfringens: toxinotype and genotype.</a> Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).</li><li>Rood, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+Clostridium+perfringens+toxin-based+typing+scheme.">Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme.</a> Anaerobe. , (2018).</li><li>Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+sheep-multiple+sclerosis+connection.">A review of the sheep-multiple sclerosis connection.</a> Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).</li><li>Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Clostridium+perfringens+type+B+in+an+individual+at+first+clinical+presentation+of+multiple+sclerosis+provides+clues+for+environmental+triggers+of+the+disease.">Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease.</a> PLoS One. 8, 76359 (2013).</li><li>Wagley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Clostridium+perfringens+epsilon+toxin+associated+with+multiple+sclerosis.">Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis.</a> Multiple Sclerosis. , (2018).</li><li>Linden, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+perfringens+Epsilon+Toxin+Causes+Selective+Death+of+Mature+Oligodendrocytes+and+Central+Nervous+System+Demyelination.">Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination.</a> MBio. 6, 02513 (2015).</li><li>Popoff, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin:+a+fascinating+pore-forming+toxin.">Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin.</a> FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).</li><li>Lee, C. A., Labbe, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Enterotoxin-+and+Epsilon-Positive+Clostridium+perfringens+Spores+in+U.S.+Retail+Spices.">Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices.</a> Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).</li><li>Wen, Q., McClane, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+enterotoxigenic+Clostridium+perfringens+type+A+isolates+in+American+retail+foods.">Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).</li><li>Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+Clostridium+perfringens+in+retail+chicken+livers.">Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers.</a> Anaerobe. 21, 67-68 (2013).</li><li>Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+Clostridium+perfringens+in+American+foods.">Incidence of Clostridium perfringens in American foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).</li><li>Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Clostridium+perfringens+type+C+enteritis+in+pigs+using+a+DNA+amplification+technique+(PCR).">Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR).</a> Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).</li><li>Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction+test+for+differentiation+of+five+toxin+types+of+Clostridium+perfringens.">Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens.</a> Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).</li><li>Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+clostridium+perfringens+during+simulated+transport+and+stability+of+some+plasmid-borne+toxin+genes+under+aerobic+conditions.">Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions.</a> Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).</li><li>Erickson, J. E., Deibel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+medium+for+rapid+screening+and+enumeration+of+Clostridium+perfringens+in+foods.">New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods.</a> Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).</li><li>Regan, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+epsilon+toxin-producing+Clostridium+perfringens+strains+in+American+retail+food.">Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food.</a> Anaerobe. 54, 124-127 (2018).</li></ol>

Ingen oplysninger.

Her beskriver vi en metode til at identificere C. perfringens prævalens i detail fødevareprøver med begrænset opdyrkning og uden brug af et anaerob kammer system. Denne metode bruger en kombination af teknikker til at øge identifikationen af C. perfringens fra fødevareprøver. Ved at bruge en modificeret version af RPM-medier, giver vi mulighed for selektiv vækst af C. perfringens. Ved at sandwichere den inokulerede RPM i mellem lag af TSC agar, er vi i stand til at identificere og isolere anaerobe, sulfit-reducerende bakterier karakteristisk for C. perfringens. For at bekræfte tilstedeværelsen af C. perfringens, sulfit-reducerende kolonier er sub-kultiveret i frisk rpm. Den modificerede version eller RPM giver os mulighed for nemt at udtrække DNA fra kulturer, hvilket muliggør PCR-bekræftelse af specifikke toksin gener. Bekræftelse af C. perfringens kontaminerede fødevareprøver kan opnås inden for tre dage.
I tidlige eksperimenter blev madprøver simpelthen inokuleret i RPM og DNA udvundet fra på kulturer. Denne metode resulterede i påvisning af C. perfringens i et begrænset antal prøver (data ikke vist). Selv om RPM er selektiv for c. perfringens vækst, er den ikke eksklusiv for c. perfringens vækst. Andre, gram-positive, D-cycolserin resistente bakterier kan stadig vokse i RPM. Vi hypotese, at forurening med andre bakterielle arter kan have reduceret vores påvisning af C. perfringens stammer ved at reducere følsomheden af vores PCR analyse i vores første på rpm kultur. Et afgørende skridt i at øge påvisning af C. perfringens var inddragelsen af TSC agar "sandwich" teknik. Dette tillod os at differentiere og vælge for anaerobe, sulfite-reducerende kolonier, karakteristisk for C. perfringens. Et vigtigt skridt i denne proces er at sikre, at det øverste lag af smeltet TSC agar er ved 40 °C. Selv om nogle C. perfringens stammer kan vokse ved højere temperaturer (46 – 48 °c)15,16, tilsætning af smeltet agar ved højere temperaturer reducerer mængden af genvundne kulturer, for det meste sandsynligvis på grund af celledød .
Der er flere potentielle begrænsninger for denne metode. Som tidligere nævnt udvælger eller differentierer hverken RPM eller TSC agar udelukkende for C. perfringens , hvilket giver mulighed for vækst af andre bakteriearter, som findes i fødevareprøver. Dette kan reducere følsomheden af analysen til at vælge for C. perfringens kun. Men, dette er en fælles begrænsning i næsten alle dyrkning teknikker. Genotyping bekræftelse af rensede isolater er den bedste metode til endeligt at identificere C. perfringens og andre bakteriearter. En anden begrænsning af denne undersøgelse er, at vi ikke tester de rensede isolater. Vi bevidst gjorde dette for at begrænse mængden af afdyrkning, som gentagne afdyrkning frygtes at resultere i plasmid tab. Fordi vi ikke isolerer til renhed, er det muligt, at flere C. perfringens toxinotypes kan være til stede i samme prøve eller subkultur. Hvis forskerne ønsker at få renset isolater, kan standard rensningsmetoder anvendes på den sidste RPM-kultur, der er beskrevet i denne metode; Dette kræver typisk brug af anaerobe kamre. Selv om det oprindeligt blev brugt til at isolere c. perfringens fra mad, kan denne metode bruges til at identificere og isolere c. perfringens fra et væld af kilder. Specifikt, en sådan anvendelse af denne metode er at teste fækale prøver fra mennesker (eller dyr), der mistænkes for at være inficeret med C. perfringens og toxinotype bakterierne til bedre at forstå kilden til infektion.

Clostridium perfringens (C. perfringens) er en gram positiv, anaerob, sporedannende, stang formet bakterie, der findes allestedsnærværende i miljøet. Denne art af bakterier bærer gener, der indkode for over 17 toksiner og, historisk, er blevet karakteriseret i fem toxinotypes (A-E) baseret på tilstedeværelsen af fire forskellige toksin gener: Alpha, beta, Epsilon, og Iota toxin (tabel 1)1. For nylig er det blevet foreslået, at denne Typing-ordningen skal udvides til at omfatte typer F og G, som havnen C. perfringens enterotoksiner (CPE) og NetB toksin, henholdsvis2. Men mere forskning er nødvendig, før dette skemat system er formelt accepteret. Mens alfa toksin genet er strengt kromosomalt placeret, kan CPE-genet findes både på kromosom og plasmider. Til sammenligning findes de resterende toksiner gener på forskellige mellemstore plasmider. Vi er især interesseret i forekomsten af C. perfringens typer B og D, da disse stammer producerer Epsilon toxin, en yderst potent, pore dannende toksin, som er blevet foreslået at spille en rolle i at udløse multipel SKLEROSE (MS) i mennesker3 ,4,5,6,7. Hvordan folk bliver smittet eller koloniseret af disse stammer er ukendt. En mulig forklaring er gennem indtagelse af forurenede fødevarer. For at hjælpe med at besvare dette spørgsmål, vi søgte at bestemme forekomsten af forskellige C. perfringens toxinotypes i amerikanske fødevareprøver.
Tilstedeværelsen af C. perfringens toxinotypes i amerikanske fødevareprøver er undersøgt og kræver ofte brug af anaerobe containersystemer og talrige subculturing trin8,9,10,11 . Selv om der er behov for talrige subculturing trin for at opnå oprenset isolater, kan denne metode føre til tab af plasmider over tid12,13,14, hvilket muligvis påvirker påvisning af plasmid-bårne toksin gener herunder Epsilon-toksin genet. Vi søgte at udvikle en nem metode, med færre sub-culturing trin, til selektivt kultur C. perfringens uden brug af anaerobe kamre, krukker eller poser. Kort fortalt inokuleres fødevareprøver i hurtige perfringens-medier (RPM) natten over (ON) og derefter "klemt" ind i TSC agar og inkuberet på. Kolonier, der mistænkes for at være C. perfringens , bliver derefter under dyrket i rpm og inkuberet igen på. DNA udvindes og PCR udføres for at bestemme genotype (figur 1). Vi valgte at bruge RPM, da det har vist sig at øge inddrivelsen af C. perfringens stammer fra fødevareprøver sammenlignet med andre mere standard Media15. Desuden blev RPM anvendt med succes til at isolere et Epsilon-toksin, der producerede type B-stamme fra en MS-patient4. Vi bruger en modificeret version af RPM i stedet for den oprindelige version til at tillade nem DNA-ekstraktion. Denne metode gør det let at identificere toksin gener i prøverne, men det er muligt, at en enkelt prøve indeholder mere end én C. perfringens toxinotype. Da vores metode ikke isolerer rensede stammer ved hjælp af flere rensnings runder, er det ikke muligt at identificere flere toxinotyper fra en prøve. Men, standard rensning teknikker (typisk striber på TSC plader eller blod agar plader) kan anvendes i slutningen af vores protokol for at opnå renset kulturer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>D-Cycloserine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D9434-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kits</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td>Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluid thioglycolate medium</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R453452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G1890-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Individual Primers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron (II) sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>F8633-250 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme from chicken egg white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Needed for DNA extraction, not provided in kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafilm or plastic wrap</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from casein and other animal proteins</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70173-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfringens Agar Base (TSC + SFP)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0587</td>
			<td>Make TSC agar according to instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2222-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Scraper</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell Spreader</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile petri dishes</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplies and equipment for gel electrophoresis</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>table top centrifuge</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq&#160;PCR Master Mix Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>201443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler for PCR reaction</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water bath</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70161-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment and detection of clostridium perfringens toxinotypes in retail food samples

Clostridium perfringens (C. perfringens) er en produktiv toksin producent og forårsager en bred vifte af sygdomme i forskellige værter. C. perfringens er kategoriseret i fem forskellige toxinotypes, A gennem E, baseret på transport af fire store toksin gener. Forekomsten og distributionen af disse forskellige toxinotyper er undersøgt, især deres omsiggribende i amerikanske detail-fødevarer. Af særlig interesse for os er de type B og D stammer, som producerer Epsilon toxin, en ekstremt dødelig toksin foreslået at være den miljømæssige udløser af multipel sklerose i mennesker. For at evaluere tilstedeværelsen af forskellige C. perfringens toxinotypes i forskellige fødevareprøver, udviklede vi en nem metode til selektivt kultur disse bakterier uden brug af en anaerob container system kun involverer tre dyrkning trin. Fødevarer købes fra lokale købmandsforretninger og transporteres til laboratoriet under omgivende forhold. Prøverne hakes og inokuleres i modificerede Rapid perfringens-medier (RPM) og inkuberet natten over ved 37 °C i et forseglet, lufttæt konisk rør. Overnight kulturer er inokuleret på et bund lag af solid Tryptose sulfit Cycloserin (TSC) agar, og derefter overlagt med et øverste lag af smeltet TSC agar, hvilket skaber en "Sandwiched", anaerobe miljø. Agarpladerne inkuberes natten over ved 37 °C og evalueres derefter for udseendet af sorte, sulfit reducerende kolonier. C. perfringens-mistænkte kolonier fjernes fra TSC-agar ved hjælp af sterile øjen pipetter og inokuleres i omdrejninger og sub-dyrkes natten over ved 37 °c i et lufttæt konisk rør. DNA udvindes fra RPM Subculture, og derefter analyseres for tilstedeværelsen af C. perfringens toksin gener via polymerase kædereaktion (PCR). Afhængigt af den type mad, man prøver at prøve, testes typisk 15 – 20% af prøverne positivt for C. perfringens.

Ved hjælp af denne metode, 15 – 20% af vores udtagne fødevarer test positiv for C. perfringens. Mens de fleste stammer er positive for toxinotype A, har vi med succes opdaget både type B og D i fødevareprøver. I et tidligere udgivet papir testede vi i alt 216 fødevareprøver købt fra New York Retail Stores16 (tabel 3). Disse prøver omfattede forskellige kødprøver (oksekød, lam, svinekød og lam), fjerkræ prøver (kylling og kalkun), og Seafood prøver (torsk, laks, skaldyr, snapper, skrubbe, blæksprutte, tilapia, tun, og forskellige andre fisk). Produkter og mælkeprøver blev også afprøvet. Af 216 prøver, 34 (16%) var positive for C. perfringens. Af 34 C. perfringens positive prøver, 31 prøver (91,2%) indeholdt alfa toksin, en prøve (2,9%) indeholdt alfa-, beta-og Epsilon-toksin, og to prøver (5,9%) indeholdt Alpha-og Epsilon-toksin.
Interessant nok opdagede vi også, at C. perfringens var mere udbredt som vegetativt celler sammenlignet med sporer. Femogtyve prøver blev sammenlignet for tilstedeværelsen af vegetativt C. perfringens celler eller sporer. Sporer blev udvalgt til ved varme chokerende prøver ved 85 °C i 15 min. Af de 25 testede prøver var 16% positive for vegetativt C. perfringens -stammer versus 4% for sporer. Dette indikerer, at det kan være mere omkostningseffektivt at teste for kun vegetativt celler i stedet for begge.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig01.jpg"> Figur 1: oversigt over proceduren. Fødevare prøverne hakes og fortyndes til sterile PBS. Halvdelen af PBS-Food prøven inokuleres i rpm for at vælge for vegetativt celler. Den resterende PBS-Food-prøve er varme chokeret ved 85 °C i 15 min for at vælge for sporer før inokulering i RPM. Kulturer inkuberet på 37 °C derefter belagt i TSC agar. TSC agar inkuberes på 37 °C og sorte, sulfit-reducerende kulturer er under kultiveret i frisk RPM. Sub-dyrkede RPM-kulturer inkuberet ved 37 °C, og DNA udvindes for at udføre genotypebestemmelse via PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig01large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig02.jpg"> Figur 2: skematisk af TSC agar sandwich teknik. RPM-medier, der indeholder C. perfringens -bakterier, er belagt mellem to lag TSC agar for at fremme et anaerob miljø. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig02large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59931/59931fig03.jpg"> Figur 3: udvalgte PCR-resultater. Eksempel billeder af resultaterne af genotypebestemmelse af c. perfringens fra syv forskellige typer fødevarer og en positiv kontrol af c. perfringens typen B. En molekylvægt stige (første vognbane af hver gel) blev brugt til at tilnærme størrelsen af PCR resultater i base Pairs (BP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59931/59931fig03large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Toxinotype</td>
			<td>Alpha</td>
			<td>Beta</td>
			<td>Epsilon</td>
			<td>Tøddel</td>
			<td>Cpe</td>
			<td>NetB</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Etableret</td>
			<td>A</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Foreslåede</td>
			<td>F</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>+</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">+ nuværende -ikke til stede +/-måske eller måske ikke være til stede</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: oversigt over C. perfringens genotyper. Et diagram over de kombinationer af toksiner, der produceres af hver C. perfringens toxinotype.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mål</td>
			<td>Primer par</td>
			<td>Forventet PCR-produkt (BP)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alpha</td>
			<td>F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA KAT CGT GTA AG</td>
			<td>325</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beta</td>
			<td>F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C</td>
			<td>196</td>
		</tr>
<tr>
<td>Epsilon</td>
			<td>F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT FTT ACT AAC</td>
			<td>655</td>
		</tr>
<tr>
<td>16s RNA</td>
			<td>F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T</td>
			<td>~ 1300</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: primere og forventede PCR-produkter til udvalgte toksin gener. Primere, der anvendes i PCR genotypebestemmelse-trinnet.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3" rowspan="2">Fødevare type</td>
			<td colspan="2">Skriv en</td>
			<td colspan="2">Type B</td>
			<td colspan="2">Type C</td>
			<td colspan="2">Type D</td>
			<td colspan="2">C. perf +</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Alfa toksin positiv</td>
			<td colspan="2">Alfa-, beta-og Epsilon-toksin positiv</td>
			<td colspan="2">Alfa og beta toksin positiv</td>
			<td colspan="2">Alfa-og Epsilon-toksin positiv</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr><tr><td colspan="2"></td>
			<td>N</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
			<td>N</td>
			<td>%</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Kød</td>
			<td>Oksekød</td>
			<td>38</td>
			<td>8</td>
			<td>21</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>9</td>
			<td>24</td>
		</tr><tr><td>Lam</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Svinekød</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
			<td>13</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>Blandet</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>100%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>64</td>
			<td>11</td>
			<td>17</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>12</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Fjerkræ</td>
			<td>Kylling</td>
			<td>19</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>5</td>
			<td>26</td>
		</tr><tr><td>Tyrkiet</td>
			<td>7</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>26</td>
			<td>5</td>
			<td>19</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>5</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td rowspan="11">Skaldyr</td>
			<td>Torsk</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Blandet</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Laks</td>
			<td>11</td>
			<td>2</td>
			<td>18</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>shelfish</td>
			<td>32</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>Snapper</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>75%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>3</td>
			<td>75%</td>
		</tr><tr><td>Skrubbe</td>
			<td>12</td>
			<td>4</td>
			<td>33%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>33%</td>
		</tr><tr><td>Blæksprutte</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>Tilapia</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>Tun</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Andre</td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>13</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>100</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Mejeri</td>
			<td>Ko</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Ged</td>
			<td>4</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Mælk</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>10</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Producere</td>
			<td>Vegetabilsk</td>
			<td>12</td>
			<td>1</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>Frugt</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Urt</td>
			<td>3</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Subtotal</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>Samlede</td>
			<td></td>
			<td>216</td>
			<td>31</td>
			<td>14</td>
			<td>1</td>
			<td>0,50%</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>0,90%</td>
			<td>34</td>
			<td>16</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: forekomsten af forskellige C. perfringens toxinotypes i 216 fødevareprøver. Et eksempel på de opnåede resultater, når du bruger denne metode til at teste detail mad til C. perfringens. Denne tabel er blevet ændret fra det tidligere offentliggjorte manuskript Regan et al.16.

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples at JoVE.com

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Formålet med denne protokol er at påvise forskellige Clostridium perfringens toxinotypes i lokalt indkøbte fødevarer, især Epsilon-toksin, der producerer stamme typer B og D, uden brug af anaerobe kamre.

Berigelse og påvisning af Clostridium perfringens toxinotypes i detail fødevareprøver

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...

Vi har udviklet en nem metode til at teste fødevareprøver for de forskellige C perfringens toksinotyper. Vi er især interesseret i forekomsten af toksinotyper B og D, som producerer epsilon toksin. Vores protokol giver mulighed for nem berigelse og påvisning af de forskellige C perfringens toksinotyper uden brug af anaerobe kamre eller væksthuse med begrænset sub-dyrkning.Denne metode kan også bruges til at teste jord, vand, fækale prøver og meget mere. Demonstration af proceduren vil være Zuha Anwar og Samantha Regan, teknikere fra laboratoriet. Begynd med at forberede modificerede hurtige perfringens medium, eller RPM.Kombiner ingredienser i henhold til manuskript retninger, og autoklave blandingen ved 121 grader Celsius i 15 minutter. Tillad medium til at køle til ca 40 grader Celsius, derefter tilføje D-cycloserine til en endelig koncentration på 440 milligram per liter. Aseptisk overføre RPM til 15 milliliter koniske rør, og opbevares ved fire grader Celsius i op til en måned.Før brug, varm mediet til 37 grader Celsius. Når der indsamles prøver, der skal testes, overføres maden til laboratoriet i henhold til manuskriptretninger. Hvis ikke test straks, kan maden opbevares på minus 20 grader Celsius.Noter fødevaretypen og oprindelseslandet samt alle andre relevante oplysninger. For at teste maden, overføre ca en til to gram til en steril petriskål, og fint hakke det med et sterilt barberblad eller skalpel. Inokuler det i 10 milliliter PBS i et 15 milliliter konisk rør, og bland godt.Vælg for vegetative celler ved at overføre fem milliliter PBS-fødevareblandingen til et konisk rør på 15 milliliter med 10 milliliter omdrejningstal og lukke låget tæt. Vælg for sporer ved opvarmning af de resterende fem milliliter af blandingen til 85 grader Celsius i 15 minutter. Og derefter overføre det til et rør med RPM og lukke låget stramt.For at sikre fuldstændig blanding, vortex og invertere maden RPM kulturer. Derefter tæt forsegle koniske rør og pak lågene med paraffin film for at skabe et anaerobt miljø. Inkuber rørene natten over ved 37 grader Celsius og bemærk enhver turbiditet eller gæring den følgende morgen.Forbered Tryptose Sulfite Cycloserine eller TSC Agar i henhold til producentens retning, og brug derefter sandwichteknikken til at vaccinere den med nattens RPM-kulturer. Forbered basislaget af pladerne ved at overføre 10 milliliter af den smeltede Agar til sterile Petrie retter og gør det muligt at størkne. Vedligehold de resterende TSC Agar ved 40 grader Celsius for det øverste lag, og overfør omhyggeligt 100 mikroliter af nattens RPM-kultur til Agar-basen.Nogle kulturer kan være under pres på grund af gæring, så sørg for at bære alle passende personlige værnemidler. Spred inoculin med sterile glasperler eller en cellespreder, og lad omdrejningstrækket blive absorberet i Agar i fem til 10 minutter. Brug derefter en serologisk pipette til omhyggeligt at overføre 20 milliliter af den smeltede TSC Agar til pladen.Udskift Petrie skållåget og lad TSC Agar størkne ved stuetemperatur, derefter vende skålen og inkubere det ved 37 grader Celsius natten over. Hvis det er nødvendigt, udføres serielle fortyndinger af RPM-kulturen før inokulering i TSC Agar. Efter inkubationen, undersøge plader for bakterievækst.Aerobe bakterier kan være til stede på overfladen af Agar, mens anaerobe bakterier vil blive indlejret i Agar. Sulfit reducere bakterier vil vende de omkringliggende Agar sort, og mulige C perfringens kolonier vil være sort og indlejret i Agar. Hvis der er en tæt mængde aerob bakterievækst på pladens overflade, skal du bruge en celleskraber til at fjerne kolonier fra udvalgte områder.Brug en steril engangs-øje dropper til at plukke de formodede C perfringens kolonier fra Agar, og sørg for at udvise luften før piercing Agar. Kolonierne overføres til 10 milliliter frisk omdrejningstal i et konisk rør på 15 milliliter. Der kan udtages prøver af flere kolonier fra samme plade til separate RPM-kulturer.Fastgør de koniske rørlåg, pak dem ind i paraffinfilm, og inkuber dem natten over ved 37 grader Celsius. C perfringens er en BSL to organisme. Det er vigtigt at bruge passende sikkerhedsforanstaltninger til enhver tid, især når du åbner natten RPM kulturer og omhyggeligt dekontaminere og bortskaffe brugte medier.På den næste dag, fjerne natten kulturer og undersøge dem for turbiditet og gæring, derefter gå videre med DNA-ekstraktion. Forsigtigt vende RPM kultur til at sprede eventuelle faste bakterier og forsigtigt åbne røret. Overfør en milliliter til et mikrocentrifugerør, og pellet bakterierne ved centrifugering.Pellet med en milliliter steril PBS. Hvis ufordøjet gelatine har lagt sig oven på bakterierne, fnug det ud ved at ophidse med PBS. Forsigtigt aspirere gelatine og PBS og re-suspendere de resterende bakterielle pellet med en milliliter frisk PBS.Det er vigtigt at fjerne enhver pelleteret gelatine med begrænset forstyrrelse af cellepellet. Manglende fjern gelatine kan hæmme DNA-ekstraktion og PCR. Centrifuge bakterierne i 10 minutter og omhyggeligt aspirere supernatant.Derefter udføre DNA-ekstraktion ved hjælp af et kit specielt designet til gram positive bakterier. Brug DNA'et med det samme, eller opbevar det på minus 20 grader Celsius. Udfør PCR på det udtrukne DNA for at afgøre, om kulturerne er positive for C perfringens toksinotyper.Brug C perfringens DNA som en positiv kontrol for at sikre, at alle PCR reagenser virker. Kør PCR i henhold til manuskript retninger og analysere produkterne med agarose gel elektroforese. Denne protokol blev brugt til at teste i alt 216 fødevareprøver købt fra New York detailbutikker.Prøverne omfattede forskellige kødprøver, fjerkræprøver og skaldyrsprøver. C perfringens Type B blev anvendt som en positiv kontrol. Det blev konstateret, at 15 til 20% af de fødevarer i stikprøven test positiv for C perfringens.Af de 34 positive prøver indeholdt 31 prøver alfa toksinet, en prøve indeholdt alfa- og beta- og epsilon toksin. Og to prøver indeholdt alfa og epsilon toksin. Vi har udviklet en nem metode til at teste fødevareprøver for de forskellige C perfringens toksinotyper.Vi er især interesseret i forekomsten af toksinotyper B og D, som producerer epsilon toksin.

Research

JoVE Journal

Environment

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae

Analyse af Fatty Acid indhold og sammensætning i mikroalger

A method to determine the content and composition of total fatty acids present in microalgae is described. Fatty acids are a major constituent of ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Sporing mikrobiel forurening i Retail Miljøer med fluorescerende Powder - En Retail Delicatessen Environment Eksempel

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Kolorimetrisk Papir-baseret detektion af<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Og<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Fra store mængder af Agricultural Water

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

Påvisning af fødevarebårne patogene bakterier fra Individual Filth Fluer

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

Determination of Inorganic Arsenic in a Wide Range of Food Matrices using Hydride Generation - Atomic Absorption Spectrometry.

Bestemmelse af uorganisk arsen i en bred vifte mad matricer ved hjælp af hydrid Generation - atomabsorptionsspektrometri.

The European Food Safety Authority (EFSA) underlined in its Scientific Opinion on Arsenic in Food that in order to support a sound exposure assessment to ...

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter  spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Specifikke og præcise påvisning af Citrus grønnere patogen blev liberibacter spp. ved hjælp af konventionelle PCR på Citrus blad vævsprøver

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridisering teknikker til Paraffin-Embedded voksen koraller prøver

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Påvisning af virus fra Bioaerosols ved hjælp af Anion ionbytteren

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

Påvisning af Tilapia søen Virus ved hjælp af konventionelle RT-PCR og SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the ÃƒÅ½Ã‚Â±-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Hæmning af Aspergillus flavus vækst og aflatoksin produktion transgene majs udtrykker α-amylase hæmmer fra hjelmbønne purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...