Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

نود أن نعترف بإبراهيم العامدي لزراعة نباتات التبغ المعدلة وراثياً والدكتور توماس راديماشر لتوفيره ناقلات تعبير التبغ. ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور ريتشارد م. تويمان على المساعدة التحريرية وماركوس ساك على المناقشات المثمرة بشأن هيكل ربط الأربطة المتقاربة في إطار التعليم الإنمائي. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل البرامج الداخلية Fraunhofer-Gesellschaft في إطار المنحة رقم. جذب 125-600164 والدولة من [نورث-رهين-وستفليا] تحت [ليستثنززنترم] منحة رقم 423 "شبكة, إنتاج متكيّفة". وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة المالية الألمانية في إطار منحة فريق التدريب البحثي "تسليم المخدرات المستهدفة بالأورام" 331065168. دعمت شركة جنرال إلكتريك للرعاية الصحية نشر هذه المقالة المفتوح.

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

تطبيقات من الرواية تقارب راتينج
لقد أظهرنا أن راتنجات الكروماتوغرافيا المتقاربة المخصصة لالتقاط mAbs يمكن تصنيعها عن طريق تعطيل الرباط الذي يحتوي على epitope خاص بـ mAb إلى agarose عبر المرتبطة بـ NHS. لتصميم مثل هذا الراتنج، كان من الضروري معرفة تسلسل الظهارة واستخدام epitope خطي. الراتنجات الناتجة مفيدة لالتقاط mAbs لأنها يمكن أن تحل محل مكلفة البروتين A خطوات الكروماتوغرافيا تقارب. التفاعل بين 2F5 و DFE في دراسة الحالة لدينا تم التوسط من قبل النعت الربية-paratope ملزمة، لذلك يجب أن يكون لدينا ligand أكثر انتقائية من البروتين A، الذي يربط إلى منطقة Fc من معظم المورين وIgGs الإنسان. لأن هناك حاجة إلى الأربطة الفردية لكل mAb، قد تبدو طريقتنا في البداية مناسبة أساسا للأجسام المضادة التي يتم إنتاجها على نطاق واسع جدا. ومع ذلك، من خلال الجمع بين نهجنا مع التعبير السريع البروتين العابر القائم على النبات، يمكن إعداد الأربطة تقارب جديدة في أقل من 2 أسابيع27 مع الحد الأدنى من الجهد28. وبالتالي، فإن الطريقة هي أيضا مناسبة لتنقية mAb على نطاق صغير.
الإنتاج والتحسينات المحتملة للربط التقارب
النباتات تقدم منصة إنتاج سريعة وآمنة للربط التقارب5،29،30،مثل بروتين الانصهار DFE واردة في دراسة الحالة لدينا. وقلّل غسل المواد النباتية إلى حد كبير كمية بروتينات الخلايا المضيفة في خطوة واحدة، وتم دمجها بسهولة في روتين توضيح قياسي. ومع ذلك، كان استرداد ligand منخفضة في الإعداد الحالي، وربما يرجع ذلك إلى استقراره الحراري المعتدل وبعض غير محددة ملزمة لطبقات فلتر، كما ذكرت للمنتجات الأخرى31،32،33. هندسة الناقل لزيادة استقراره الحراري قد يساعد بالتالي على تحسين غلة الرباط في المستقبل، كما هو موضح لمرشح لقاح الملاريا CCT، إنزيم مضاد للورم PpADI أو mesophilic β-glucosidase34، 35و36. وينطبق الشيء نفسه على خطوة الترشيح العمق، حيث هندسة البروتين قد تساعد على الحد من غير محددة ملزمة لمادة فلتر37. ويمكن أيضا خفض تكاليف الإنتاج لDFE وligands مماثلة عن طريق تحسين الكفاءة العامة للتوضيح باستخدام flocculants أو إضافات فلتر38،39.
عندما يتم استخدام DsRed كناقل، فإنه يشكل مجمع رباعي. وهذا مفيد لأنه يزيد من عدد الepitopes لكل ligand، ولكنه قد يجعل أيضا الرباط أكثر عرضة للتفكيك أو denaturation أثناء الكروماتوغرافيا تقارب. بروتين الناقل الأحادي مثل mCherry قد يكون من الأفضل، لأنه مستقر عند درجة الحموضة منخفضة40،وإدراج تكرار جنبا إلى جنب من epitope من شأنه أن يزيد من متعطشا للربط وبالتالي زيادة قدرة الراتنج5، 26 , 41- وبالنسبة للبروتينات البسيطة التي تحمل الموجات الإنقلت (أي تلك التي ليس لها روابط ثنائيكبريتيد أو تعديلات ما بعد الترجمة) فإن نظم الإنتاج الميكروبية قد تقلل من تكاليف التصنيع وتجعل الأربطة أكثر قدرة على المنافسة مع البروتين ألف. على سبيل المثال، تم التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر في الخلايا البكتيرية مع العائد من ~ 1 غرام · كجم-1 الكتلة الحيوية، والتي من شأنها أن تقلل بشكل كبير من تكاليف إنتاج الأربطة42.
بغض النظر عن المضيف التعبير، كان مطلوبا ربط تقارب تنقية أثناء اقتران لتقليل تجميد بروتينات الخلية المضيفة أو مكونات وسائل الإعلام التي يمكن أن تقلل خلاف ذلك انتقائية الراتنج والقدرة. إدراج علامة بولي الهيستيدين لتنقية IMAC زيادة النقاء إلى ~ 90٪ في خطوةواحدة، وتسهيل إنتاج ligand سريع وغير مكلفة 5،43،44. ومع ذلك، فإن موقف علامة الانصهار مهم لأنه لديه القدرة على إعاقة بشكل معقم ملزم الظهارية أو للحث على انشقاق إما العلامة أو epitope من الناقل45،46.
تعطيل الرباط التقارب على أعمدة الكروماتوغرافيا التي تنشطها دائرة الصحة الوطنية
وقد تم التعطيل يدويا أو باستخدام نظام كروماتوغرافيا. ويبدو أن أحجام التخزين المؤقت الصغيرة لكل عمود تفضل المناولة اليدوية (على سبيل المثال، بسبب الحد الأدنى من أحجام النفايات). ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة إلى أعمدة متعددة/أكبر، فإن نظام الكروماتوغرافيا يجعل من السهل التحكم في ظروف الاقتران (مثل معدلات التدفق المنظمة) وبالتالي فمن الأرجح أن يحقق نتائج قابلة للاستنساخ من حيث DBC. تشير بياناتنا إلى أن المخزن المؤقت للاقتران ودرجة الحموضة لها تأثير هام على كفاءة الاقتران وتكاليف العمود الإجمالية. عوامل الفرز التي تؤثر على رد فعل اقتران وتعديلها لكل بروتين الناقل (أو حتى لكل الناقل ligand الانصهار) يمكن بالتالي تحسين كفاءة اقتران وأداء الراتنج، ونحن نوصي هذا النهج.
اختبار العزلة 2F5 باستخدام الراتنج تقارب DFE
إنتاج المنتج والنقاء هي جوانب هامة من أداء الراتنج، وفي حالة DFE حققنا العائد من 105 ± 11٪ (± SD، ن = 3) ونقاء 97 ± 3٪ (± SD، n = 3)، وهو ما يمكن مقارنته مع أداء الراتنجات البروتين A القياسية25 ،26. مؤشر أداء رئيسي آخر للراتنجات بشكل عام (وخاصة بالنسبة لتلك التي تقوم على ربط اتّصال التقاربيّة) هو DBC عند 10% من المنتجات، لأن هذه المعلمة تؤثر على كمية الراتنج المطلوبة لعملية محددة وبالتالي التكاليف. ل ال [دف] [ليغد], كان ال [دبك] أوّليّة حوالي 4 [غ]· L-1 الراتنج، وهو ~ 13٪ من القيمة المقابلة للبروتين A في ظل ظروف مماثلة (فقط 2 دقيقة وقت الاتصال)25،47 ولكن حوالي 15 أضعاف أعلى بالمقارنة مع راتنجات التقارب مخصصة أخرى مثل المضادة للFSH المناعية ligand باستخدام نفس وقت الإقامة من 2 دقيقة48. انخفض DBC من DFE إلى 15٪ من قيمة البداية بعد 25 دورات الربط وelute، في حين أن هناك حاجة إلى أكثر من 50 دورات لنفس الخسارة من DBC في الراتنجات البروتين A التجارية49. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن الناقل لدينا لم يتم تحسينها حتى الآن إلى نفس المدى كما البروتين A، الذي تم التحقيق بشكل شامل وتحسينعلى مدى العقود الأربعة الماضية8.
حتى الآن قمنا بتحسين استقرار الراتنج واستعادة المنتج عن طريق التحول من العازلة انخفاض درجة الحموضة elution إلى تركيز عال من كلوريد المغنيسيوم (الشكل3)، كما أوصى في الدراسات السابقة13. اللون الأحمر المميز للربط تقارب لم تتلاشى إلى حد كبير خلال 25 دورات ربط وelute، لذلك نحن نتكهن بأن البروتياز النباتية الذاتية في استخراج النبات أوضح31 قد يكون اقتطاع وبالتالي تعطيل epitope من الليغاان. ولذلك، فإن تصميم الوصلات المقاومة للبروتياز لربط الناقل والظهارية قد يساعد على الحفاظ على DBC الأولي على مدى عدد موسع من الدورات. وبالنظر إلى التعبير السريع والبسيط وتنقية الرباط DFE، واقترانه مباشرة إلى راتنجات الكروماتوغرافيا التجارية، وغلة منتجاتها الممتازة ونقاءها، نعتقد أن أسلوبنا يوفر بديلا ً مناسباً للبروتين A لل تنقية mAbs ومشتقات الأجسام المضادة التي لا تربط البروتين A، وخاصة إذا كان التحسينات على الناقل والرابط يمكن تحسين DBC واستقرار ligand. وقد أيد هذا الافتراض من قبل الفرق الصغير في ثابت التفكك من DFE تنقية والبروتين A-تنقية 2F5 الأجسام المضادة5،مما يشير إلى أن لدينا ربط تقارب جديد يسمح باستعادة mAbs عالية الجودة.
الفوائد والقيود الحالية للطريقة
إنتاج الرباط تقارب كاندماج وراثي مع بروتين الناقل يزيد من الذوبان في المخازن المؤقتة المائية وبالتالي التوافق مع ظروف اقتران ligand نموذجية. وعلى النقيض من ذلك، قد تكون الببتيدات الفارغة المستمدة من تركيب الببتيد المرحلة الصلبة الذوبان محدودة في ظل هذه الظروف بسبب تسلسلها50، والتي لا يمكن تغييرها لأنها تمليها سلسلة الأحماض الأمينية من epitope المعترف بها من قبل mAb ل أن تكون تنقية. لذلك استخدم آخرون توليف على الراتنج من الأربطة الببتيد51. وكانت قدرة الربط ثابت من الراتنج الناتجة عالية (~ 80 غرام · L-1)،ولكن عملية إعداد الراتنج طويلة، لم يتم الإبلاغ عن قدرة ملزمة ديناميكية والنقاء والانتعاش التي تم الحصول عليها كانت أقل مما كانت عليه في نهجنا. ميزة إضافية من ربط البروتين الانصهار في نطاق المختبر هو أن ligand والمتغيرات منها يمكن أن تنتج بسرعة، وتنقية واختبارها مع الحد الأدنى من الجهد في سهلة الاستخدام عالية من خلال نظام التعبير52.
والقيود الحالية للطريقة المعروضة هنا هي القدرة الدينامية المنخفضة للربط البالغة 3 ز· L-1 وخفضه 90٪ على مدى 25 دورات ربط وelute5. ويمكن معالجة هذه القيود في المستقبل عن طريق تطبيق شروط تحميل أقل صرامة واستبدال الناقل DsRed الحالي بمتغير هندسي أكثر استقرارا ً على التوالي. على سبيل المثال، مضاعفة وقت الاتصال الحالي من 2 إلى 4 دقائق لديه القدرة على مضاعفة قدرة الربط الديناميكي كما هو مبين لبعض راتنجات البروتين A26.
استكشاف الاخطاء
يسلط الجدول التالي الضوء على المشاكل المحتملة التي يمكن مواجهتها أثناءهذا البروتوكول ويوفر تلميحات حول كيفية حلها (الجدول 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">الجدول 1: المشاكل المحتملة التي يمكن مواجهتها والإصلاحات الممكنة.</td>
		</tr>
<tr>
<td>خطوة البروتوكول</td>
			<td>المشكله</td>
			<td>Couse</td>
			<td>اصلاح</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>النباتات لا تنمو</td>
			<td>ظروف النمو المهددة</td>
			<td>التحقق من الحموضة والموصلية من الأسمدة</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>التحقق من درجة الحرارة وظروف الضوء</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 و 3</td>
			<td>كميات كبيرة من بروتينات الخلية المضيفة موجودة بعد استخراج</td>
			<td>هطول الأمطار غير الكامل</td>
			<td>تحقق من درجة الحرارة أثناء الغسل</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>تحقق من التحريض في حمام الغسل</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 و 3</td>
			<td>لم يتم العثور على أي منتج في مستخلص النبات</td>
			<td>درجة حرارة عالية جداً</td>
			<td>التحقق من درجة الحرارة ودرجة الحموضة أثناء الغسل</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>درجة الحموضة في المخزن المؤقت ابيضاض منخفضة جدا</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>تبقى أجزاء الجذعية أو الأوراق الكبيرة بعد الاستخراج</td>
			<td>خلط غير كامل في الخلاط</td>
			<td>تأكد من أن المواد النباتية لا تشكل المكونات في الخلاط</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>زيادة الضغط السريع أثناء الترشيح العمق</td>
			<td>تحديد عامل التصفية و/أو الاتجاه غير صحيح</td>
			<td>التحقق من نوع عامل التصفية واتجاهه</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>القليل من البروتين الانصهار خلال الإلتوى / الكثير من البروتين الانصهار في التدفق من خلال</td>
			<td>لم يتم شحن راتنج IMAC بالأيونات المعدنية</td>
			<td>تحقق مما إذا كان راتنج IMAC مشحونًا بشكل صحيح بالأيونات</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>فقدت بروتين الانصهار علامة التقارب</td>
			<td>تجنب أشعة الشمس الشديدة وارتفاع درجات الحرارة أثناء زراعة النباتات</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>بروتين الانصهار المفقود أثناء التركيز</td>
			<td>بروتين الانصهار المرتبط بالغشاء</td>
			<td>التحقق من نوع الغشاء</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>تأكد من أن عامل التركيز لم يكن مرتفعاً جداً</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>انخفاض العائد اقتران</td>
			<td>تسلسل غير صحيح من اقتران الكاشف إضافة</td>
			<td>التحقق من تسميات الكواشف وتسلسل الإضافة</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>إعداد غير صحيح للأعمدة قبل اقتران</td>
			<td>التحقق من شروط preparaiton العمود</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 و 6</td>
			<td>انخفاض مباب العائد</td>
			<td>انخفاض التعبير mAb في الكتلة الحيوية النباتية</td>
			<td>اختبار التعبير mAb في الكتلة الحيوية</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>انخفاض كثافة الرباط</td>
			<td>تحقق من نقاء إعداد البروتين الانصهار</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>تركيزات بروتين منخفضة جدا / عالية في برادفورد حسب</td>
			<td>تشكيل فقاعة أثناء الأنابيب</td>
			<td>تحقق من وجود فقاعات في بالت 96 جيدا</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>تركيز منخفض من الماب أثناء قياس موارد البرنامج الخاصة</td>
			<td>بروتين للخطر رقاقة</td>
			<td>مقارنة مع نتائج mAb القياسية مع التركيز المعروف</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>تخفيف عينة غير صحيحة</td>
			<td>التحقق من معدل التخفيف والمخزن المؤقت</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: إطلاق النار من المتاعب.

المنتجات الصيدلانية الحيوية مهمة لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض في كل فرع تقريبا من فروع الطب1. الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) تهيمن على سوق الأدوية الحيوية، مع المبيعات في جميع أنحاء العالم من المتوقع أن تصل إلى ما يقرب من 110 مليار يورو في عام 20202. منصة التعبير المفضلة لmAbs هي خطوط الخلايا المبيض الهامستر الصينية، والتي تنتج عادة titers mAb عالية تصل إلى 10 g∙L-1 في ثقافة supernatant3،4. ومع ذلك، فإن إنتاج mAbs في الثقافات الخلايا الثدييات مكلفة بسبب ارتفاع تكلفةالمتوسطة والحاجة إلى التخمير المعقمة 5. منصات التعبير البديلة مثل النباتات يحتمل أن تقدم نهجا أسرع وأبسط وأقل تكلفة وأكثر قابلية للتطوير للتصنيع الصناعي6،7.
بالإضافة إلى التكاليف المرتبطة بثقافات الخلايا الثدييات، والاستخدام الواسع النطاق للبروتين A الكروماتوغرافيا تقارب لالتقاط المنتج هو محرك تكلفة رئيسية للإنتاج الصناعي من mAbs. البروتين A موجود بشكل طبيعي على سطح الخلايا المكورات العنقودية وربطت بجزء من التبلور (Fc) المنطقة من بعض المورين والأجسام المضادة البشرية، وبالتالي بمثابة آلية دفاعية للتهرب من الجهاز المناعي الفكاهي8. البروتين A أصبح معيار الذهب الصناعة لالتقاط mAbs من supernatants ثقافة الخلية ويستخدم أيضا على نطاق واسع من قبل مجتمع البحوث لأنه انتقائي للغاية، وعادة ما تحقق نقاء mAb من ~ 95٪ في خطوة واحدة8. ومن غير المستغرب أن مبيعات البروتين A على مدى العقدين الماضيين قد عكست بشكل وثيق مبيعات mAbs8. اعتمادا على مقياس الإنتاج، وتكاليف البروتين A يمكن أن تتوافق مع أكثر من 25٪ من إجمالي تكاليف العملية وبالتالي تؤثر على سعر السوق من mAbs العلاجية، والتي يمكن أن تصل إلى 2000 غرام-15،9. ولذلك، فإن راتنجات الكروماتوغرافيا البديلة مع أداء تنقية مماثل لديها القدرة على خفض تكاليف الإنتاج إلى حد كبير، مما يجعل العلاجات المستندة إلى الأجسام المضادة في متناول عدد أكبر من المرضى10،11 ،12. هذه البدائل قد تتحايل أيضا على مساوئ البروتين A اللونية، بما في ذلك ظروف الإلتواء القاسية عند درجة الحموضة المنخفضة (عادة <3.5) التي يمكن أن تسبب mAbs للخضوع لتغيرات مطابقة تعزز التجميع13 . الأهم من ذلك، البروتين A هو انتقائي فقط لمنطقة Fc من بعض الفئات الفرعية IgG، لذلك الجزيئات غير وظيفية مع نطاقات ملزمة مقتطعة قد تشارك في تنقية مع المنتج سليمة5،في حين أن مشتقات mAb مثل شظايا متغير سلسلة واحدة لا تربط البروتين A على الإطلاق.
هنا، ونحن نصف الراتنج الكروماتوغرافيا تقارب بديل لالتقاط mAb 2F5 تحييد فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام الكتابة الخطية ELDKWA (حرف واحد رمز الأحماض الأمينية)5،14. نحن وراثيا تنصهر الظهارة 2F5 إلى C-محطة من البروتين الفلورسنت DsRed، الذي كان يعمل كناقل وجزيء مراسل، وأنتجت البروتين الناتج DsRed-2F5-Epitope (DFE) في التبغ المعدل وراثيا ( نيكوتيانا تاباكوم) النباتات. تم تنقية DFE من قبل خطوة واحدة شلت المعادن أيون تقارب اللونية (IMAC). تم تحقيق تجميد الرباط التقارب DFE النقي على راتنج أجاروز عبر مرتبطة عن طريق اقتران الكيميائية باستخدام N-هيدروكسيسوتشينيميد (NHS) تنشيط عبر الأعمدة agarose. ثم استخدمت التصاميم التجريبية الإحصائية لتحسين إجراء التعطيل واقتران الكفاءة15. تم تقييم استراتيجية تنقية mAb 2F5 من حيث نقاء الأجسام المضادة، والغلة والاستقرار في الأربطة. على النقيض من البروتين A، الذي يربط منطقة Fc، DFE ملزمة منطقة تحديد التكامل من 2F5، وضمان تنقية الجزيئات مع paratope سليمة. مفهومنا يمكن بسهولة تكييفها مع أي mAb مع epitope خطي أو غيرها من الأربطة التقارب القائم على الببتيد التي يمكن تحديدها بسهولة من قبل الدراسات microarray16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> الشكل 1: مخطط تدفق العمليات لإعداد راتنجات تقارب الظهارة التي يمكن استخدامها لالتقاط mAbs من مستخلصات النباتات الخام أو المنائج ثقافة الخلية. (أ) تم التعبير عن تقارب الرباط DFE في مصانع التبغ المعدلة وراثيا. تم تضمين خطوة هطول الأمطار الحرارية (B) قبل أن يتم تجانس الأوراق المقطوعة (C). (D) تم توضيح استخراج النبات الخام عن طريق الترشيح كيس، والترشيح عمق و0.2 م الترشيح المعقمة. (E) ثم تم تنقية DFE من قبل IMAC. (واو،ز) تم تعطيل ربط تقارب DFE المنقى على أعمدة أغاروز المرتبطة بـ EDC/NHS. (H) استخدمت الثقافات البكتيرية التي تحمل T-DNA ترميز الأجسام المضادة 2F5 للتعبير العابر في النباتات N. بنتهامايانا (I) نمت في phytotron. (ي) تم حصاد أوراق ن. بنتامايانا ومعالجتها كما هو موضح في D. (K) تم تنقية mAb 2F5 من استخراج أوضح باستخدام أعمدة تقارب DFE(L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

عادة ما يتم تحقيق تنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة (mAbs) من خلال البروتين A الكروماتوغرافيا تقارب، والتي يمكن أن تمثل ما يصل إلى 25٪ من تكاليف العملية الإجمالية. وبالتالي، فإن خطوات الالتقاط البديلة والفعالة من حيث التكلفة ذات قيمة بالنسبة للصناعة التحويلية على نطاق صناعي، حيث يتم إنتاج كميات كبيرة من الكمية الواحدة من الكمية. هنا نقدم طريقة لشل حركة النعت الظهاري ة المستندة إلى DsRed إلى راتنج أجاروز مرتبط ة عبر يسمح بالتقاط انتقائي للجسم المضاد 2F5 الذي يبطل مفعول فيروس نقص المناعة البشرية من مستخلصات النباتات الخام دون استخدام البروتين A. تم دمج ELDKWA الظهارة الخطية لأول مرة وراثيا إلى البروتين الفلورسنت DsRed وتم التعبير عن البروتين الانصهار في التبغ المعدلوراثيا(Nicotiana tabacum) النباتات قبل تنقية عن طريق الكروماتوغرافيا المعدنية أيونتقارب المعطلة. وعلاوة على ذلك، تم تحسين طريقة تقوم على الأجاروز المتصلة بتنشيط لكثافة الأربطة العالية، واقتران فعال وتكلفة منخفضة. وكانت درجة الحموضة وتكوين المخزن المؤقت وتركيز الرباط القابل للذوبان أهم المعلمات خلال إجراء الاقتران، الذي تم تحسينه باستخدام نهج تصميم التجارب. وقد تم اختبار الراتنج تقارب الناتجة عن قدرتها على ربط انتقائي mAb الهدف في استخراج مصنع الخام وتم تحسين العازلة elution لاسترداد mAb عالية، نشاط المنتج والاستقرار الراتنج تقارب. ويمكن بسهولة تكييف هذه الطريقة مع الأجسام المضادة الأخرى مع epitopes الخطية. الراتنجات الجديدة تسمح ظروف الإلتواء ألطف من البروتين A ويمكن أيضا أن تقلل من تكاليف خطوة التقاط الأولي لإنتاج mAb.

التعبير وتنقية الرباط التقارب
تم التعبير عن البروتين الانصهار DFE في نباتات التبغ المعدلة وراثيا نمت في الدفيئة. وكان العائد ~ 120 mg·kg-1 كتلة ورقة مع متوسط الكتلة الحيوية من ~ 130 غرام لكل مصنع. وكان نقاء DFE <5% من ملعقة صغيرة في مستخلصات النباتات الخام قبل الغسل ولكن زادت إلى ~ 40٪ بعد المعالجة الحرارية في 70 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة، والتي عجلت > 97٪ من بروتينات الخلية المضيفة. تم دمج خطوة الغسل بسهولة في روتين الحصاد والاستخراج (الشكل1) واستغرق أقل من 2 ساعة من الوقت الإضافي، بما في ذلك إعداد حمام المياه. وكان الانتعاش العام من DFE 23.5 ملغ كجم1 مع نقاء > 90٪. وكانت الخطوات المسؤولة عن فقدان المنتج هي الغسل، والترشيح العمق، وIMAC، مع خسائر محددة من 40٪ و 27٪ و 45٪، على التوالي. كان عمق مرشح قدرة في المتوسط 135 ± 36 L م-2 (± SD، n = 3) وبالتالي في النطاق العلوي من القيم المبلغ عنها في الأدب21. زيادة غلة DFEمع عمر النبات (الشكل 2).
تعطيل الرباط التقارب على أعمدة الكروماتوغرافيا التي تنشطها دائرة الصحة الوطنية
خلال اختبارات الاقتران الأولية، وجدنا أن المخزن المؤقت HEPES (درجة الحموضة 8.3) زيادة كفاءة اقتران إلى 89 ± 6٪ (± SD، n = 3) مقارنة مع 78 ± 9٪ (± SD، n = 3) للحاجز بيكربونات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. ولذلك، تم استخدام HEPES لجميع تجارب الاقتران اللاحقة. تم اختيار نهج وزارة الطاقة لتحسين كفاءة اقتران DFE إلى راتنج الآغاروز المرتبط بـ NHS. ازدادت الكمية المطلقة من DFE المعطلة على الراتنج مع كتلة DFE حقن في العمود واستقرت في ~ 15 غرام · L-1 في حين انخفض العائد اقتران باستمرار كماتم حقن المزيد من DFE (الشكل 2). وكان العائد اقتران أيضا > 50٪ أقل في المخزن المؤقت الحمضية، مما يدل على الحاجة إلى فحص لظروف اقتران مناسبة لكل ligand على أساس كل حالة على حدة. تم تحديد الظروف المثالية من حيث العائد اقتران، والكمية المطلقة من DFE المعطلة وتكاليف العمود باستخدام أداة التحسين العددي لبرنامج DoE. وكانت أكثر الظروف استصواباً (درجة الحموضة 9.0 و7.0 ملغم من DFE لكل 1 مل من راتنج الأجاروز المترابط) موجودة على هضبة كبيرة وبالتالي كانت قوية. الجزيئات DFE الاحتفاظ الفلورة الحمراء حتى بعد اقتران، وكثافة اللون تتوافق معالكمية الإجمالية من DFE المعطلة (الشكل 2). لذلك، يمكن استخدام لون العمود كمعلمة مراقبة جودة بسيطة لتقدير كفاءة الاقتران وجودة العمود. وأكد الفلورة أيضا أن DFE البروتين الانصهار تجميعها في حالة رباعية من DsRed الأصلي.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> الشكل 2: تحسين تجميد DFE إلى راتنج الأجاروز المرتبط بـ NHS. (A) LDS-PAA هلام مع تراكب وصمة عار الغربية من عينات التجانس وelution من مقتطفات مصنع DFE المعدلة وراثيا unblanched وبلانش. تم حصاد النباتات بعد 38 أو 45 أو 52 يوما من البذر. تم تنفيذ البقع الغربية باستخدام المضادة له6-الأجسام المضادة5. (B) المبلغ الإجمالي للربط تقارب DFE المقترنة في الاعتماد إذا اقتران درجة الحموضة والكتلة الإجمالية من DFE تنقية حقن على NHS تنشيط عبر ربط أعمدة agarose. تشير النقاط الحمراء إلى التجارب الفعلية التي أجريت لإنشاء نموذج سطح الاستجابة. (C) أعمدة تقارب DFE بعد إجراء الاقتران. الأرقام تتوافق مع شروط اقتران أبرز في لوحة B. dps = أيام بعد البذر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
اختبار العزلة 2F5 باستخدام الراتنج تقارب DFE
تم إنتاج الأجسام المضادة المؤتلف 2F5 بشكل عابر في نباتات نيكوتيانا بنتاميانا المزروعة في فيتوترون5. تم اختبار التقاط 2F5 من استخراج النبات الخام باستخدام أعمدة تقارب إلى جانب ~ 7.0 ملغ DFE تنقية (الخطوة 6). الإلواء من راتنجات البروتين A عادة ما ينطوي على العازلة الحمضية (درجة الحموضة ~ 3.3)13. لذلك، قمنا في البداية بتقييم مختلف المخازن المؤقتة للانخفاض في درجة الحموضة (pH 6.0-3.25) لأعمدة DFE. وقد نجح الإنعلاث من 2F5 في قيم درجة الحموضة أقل من 4.5 مع أعلى انتعاش من ~ 35٪ في درجة الحموضة 3.25. ومع ذلك، فإن انخفاض درجة الحموضة تعطيل كل من الأجسام المضادة (كما أكد ذلك قياس الطيف SPR) وLigand DFE (كما هو مبين في فقدان اللون وانخفاض DBC، الشكل3). وكان من المتوقع أن هذا الأخير نظرا لأن التشوهات DsRed الأصلي في درجة الحموضة <4.022,23. لتجنب المنتج وdenaturation ligand، اختبرنا كلوريد المغنيسيوم كعامل الإلتاءب البديل لأنه قد تم استخدامه سابقا لelute mAbs من راتنجات التقارب الأخرى24. وكان تركيز كلوريد المغنيسيوم من 1.25 M كافية لelute 2F5 من الراتنج تقارب DFE مع استرداد 105 ± 11٪ (± SD، ن = 3) ونقاء 97 ± 3٪ (± SD، ن = 3). وكان هذا الأداء مماثلة للبروتين A الراتنجات25،26. وكان ثابت تفكك التوازن(K D) من DFE تنقية 2F5 الأجسام المضادة وFuzeon ligand الاصطناعية 791 pM في حين أن من البروتين A-تنقية النظير كان 763 PM5. وعلاوة على ذلك، لم يلاحظ فقدان كبير للألوان في الراتنج على مدى ما مجموعه 25 دورة ربط وelute. انخفض DBC من الراتنج تقارب DFE في 10٪ 2F5 اختراق خطيا على مدى 25 دوراتإلى ~ 15٪ من القيمة الأولية (الشكل 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> الشكل 3: اختبار عزل 2F5 من المستخلصات النباتية الواضحة باستخدام راتنجات DFE المتقاربة. (أ) راتنجات تقارب DFE بعد دورة واحدة من الإلتاءب باستخدام المخازن المؤقتة ذات قيم الحموضة المختلفة في النطاق 4.0-3.0 ونفس الراتنجات بعد خطوة تحييد عند درجة الحموضة 6.0. (B) راتنجات تقارب DFE بعد دورة واحدة وست دورات من تنقية 2F5 باستخدام 1.25 M أو 4.00 M كلوريد المغنيسيوم كما eluent. (C) كروماتوغرام من تجارب التحميل الأمامي (منحنيات كسر من خلال) لتحديد القدرة ملزمة ديناميكية تعتمد على دورة من الراتنج DFE باستخدام كلوريد المغنيسيوم كما eluent. تم قياس منحنيات كسر من خلال ل4.0 M و 1.25 M المخازن العازلة كلوريد المغنيسيوم elution وأرقام دورة مختلفة. (D) القدرة الملزمة الديناميكية المعتمدة على الدورة من DFE باستخدام كلوريد المغنيسيوم 1.25 M كما eluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

في هذا الإجراء، يتم تعطيل الرباط الظهاري القائم على DsRed لإنتاج راتنج تقارب انتقائي للغاية لالتقاط الأجسام المضادة أحادية النسيلة من مستخلصات النباتات الخام أو اللاتابات ثقافة الخلية، كبديل للبروتين A.

تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

تسيطر الأجسام المضادة أحادية النسيلة على سوق الأدوية الحيوية ويتم تنقيتها عادة من قبل البروتينات اللونية. الراتنج وفقا هو سائق تكلفة رئيسية أثناء الإنتاج التي تؤثر على سعر العلاجات المضادة القائمة. هنا نحن وصف رابطة تقارب جديدة على أساس البروتين الفلورسنت التي تقرأ على أنها الناقل لeptope خطي من فيروس نقص المناعة البشرية تحييد الأجسام المضادة 2F5.بشكل عام يسمح أسلوبنا جيل سريع من راتنجات اللونية تقارب التي يمكن استخدامها لالتقاط الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وقد أثبتنا هذه القدرة من خلال التقاط الأجسام المضادة 2F5 من استخراج مصنع الخام. نحن الأمثل ظروف التقاط ومخزن الحل من أجل تحسين القدرة على ربط دينامية وإعادة الاستخدام الراتنج.يسمح راتنجنا عموماً بظروف أكثر مرونة من البروتين A ولديه القدرة على تقليل تكاليف تنقية الأجسام المضادة أحادية النسيلة. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تكيف الراتنج للأجسام المضادة الأخرى التي ترتبط epitopes الخطية. لبدء هذا الإجراء، ضبط تركيز حل رابطة التقارب المعدة بحيث يكون في نطاق 5 إلى 15 غراما للتر الواحد كما هو محدد من قبل تصميم التجارب.تخزين الحل على الجليد حتى رد فعل اقتران جاهز. بعد ذلك، قم بتعبئة حقنة واحدة ذات ملليلتر بمحلول DFE. وإعداد محول لتركيب الحقن على أعمدة agarose عبر الارتباطات عبر NHS بحجم سرير واحد ملليلتر.لكل 10 أعمدة تستخدم في اقتران، إعداد 30 ملليلتر من حل التعطيل، 30 ملليلتر من محلول منخفض pH، و ملليلتر واحد من حل التخزين. ثم أعد 20 ملليلتر من حمض الهيدروكلوريك المليمولر الواحد في أنبوب. و احتضنه على الثلج لمدة 20 دقيقة على الأقلإعداد مقياس دقيق لمراقبة تدفق من خلال الكسور لجميع الخطوات خلال التفاعل اقتران. بعد هذا، فتح عمود أغاروز مختومة تنشيط NHS عبر الاتّصال. تطبيق قطرة من المخزن المؤقت على مدخل المحول، لمنع الهواء من دخول العمود.قم بتركيب محول الحقنة في مدخل العمود. غسل العمود مع ستة ملليلتر من الجليد بارد حمض الهيدروكلوريك ملليمولار واحد، بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة. باستخدام حقنة مليلترتين، قم على الفور بحقن 1.5 ملليلتر من محلول DFE بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة.وجمع تدفق من خلال كسر على مقياس دقيق لتحليل لاحق. ختم العمود في كلا الطرفين واحتضان لمدة 15 إلى 45 دقيقة، في 22 درجة مئوية. حقن المقبل ستة ملليلتر من حل التنشيط، تليها ستة ملليلتر من محلول pH منخفضة، بمعدل تدفق أقل من ملليلتر واحد في الدقيقة الواحدة، وإزالة غير التكافؤ ملزمة يغاندس من الراتنج.قم بإدخال ستة ملليلترات من حل التنشيط، واحتضان العمود لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، حقن ستة ملليلتر من محلول pH منخفض في العمود. متبوعة بستة ملليلترات من حل التنشيط.ثم حقن آخر ستة ملليلتر من محلول منخفض pH في العمود. حقن مليلترين من محلول التخزين في العمود، وتخزينه عند أربع درجات مئوية. أولاً إعداد 100 ملليلتر من استخراج النبات أوضح تحتوي على 2F5، أو عظمى لنظام التعبير المفضل على أساس الخلية، والذي يحتوي أيضا 2F5.المقبل إعداد العازلة التوازن، والحديد العالي X قوة الوهم العازلة، كما هو مبين في بروتوكول النص. قم بمسح نظام الكروماتوغرافيا بالمخازن المؤقتة. قم بتحميل عمود تقارب DFE على نظام الكروماتوغرافيا.وتككيل مع خمسة السيرة الذاتية من العازلة التوازن، بمعدل تدفق ملليلتر واحد في الدقيقة. مراقبة امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر. ثم تحميل 80 ملليلتر من استخراج النبات أوضح، أو عظمى على العمود بمعدل تدفق 5 ملليلتر في الدقيقة الواحدة.لضمان وقت الاتصال دقيقتين. جمع تدفق من خلال عينات في 2 ملليلتر الكسور أو إعادة بناء منحنى اختراق. تخزين تدفق من خلال العينات في أربع درجات مئوية، إذا كان تحليل العينة الفورية غير ممكن.بعد هذا غسل العمود مع 6CV من العازلة التوازن. جمع عينة في بداية، منتصف ونهاية الغسيل. تمييع MAB2F5 مع خمسة مجلدات من قوة عالية من قوة الوهم العازلة.جمع كسر DFE عندما زادت إشارة الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر إلى خمسة وحدات امتصاص ملي فوق خط الأساس. تحسين العازلة الوهم لكل زوج epitope-الأجسام المضادة، كما هو موضح في بروتوكول النص. يتم التعبير عن البروتين الانصهار DFE في نباتات التبغ المعدلة وراثيا، التي تزرع في الدفيئة.الانتعاش العام للDFE هو 23.5 ملليغرام لكل كيلوغرام. مع نقاء أكثر من 90٪ المبلغ المطلق من DFE شل على الراتنج يزيد مع كتلة DFE حقن في العمود، والهضاب في حوالي 15 غراما للتر الواحد، في حين أن العائد اقتران ينخفض باستمرار كما يتم حقن أكثر DFE. وينظر إلى جزيئات DFE للاحتفاظ فلوركينس الأحمر، حتى بعد اقتران.كثافة اللون يتوافق مع المبلغ الإجمالي للDFE شل. لذلك يمكن استخدام لون العمود كمعلمة بسيطة لمراقبة الجودة لتقدير كفاءة اقتران، ونوعية العمود. يتم إنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة 2F5 بشكل عابر في نباتات نيكوتيانا بنثاميانا التي تزرع في النبات.يتم اختبار التقاط 2F5 من استخراج مصنع الخام، باستخدام أعمدة تقارب، إلى جانب ما يقرب من سبعة ملليغرام من DFE المنقاة. تركيز كلوريد المغنيسيوم من 1.25 الضرس كافية ل2F5 elute من الراتنج تقارب DFE مع الانتعاش ما يقرب من 100٪ ونقاء ما يقرب من 97٪ وهو مماثل للراتنجات البروتين A. DBC من الراتنج تقارب DFE في 10٪ 2F5 اختراق، ينخفض خطيا على مدى الدورات 25، إلى حوالي 15٪ من القيمة الأولية.استخدمنا تصميم نهج التجارب لتحسين القدرة على الاقتران لدينا رابطة تقارب. هذه الشروط يمكن ضبطها بدقة ليغاند أخرى في المستقبل. يستخدم أسلوبنا البروتين الفلورسنت لخيط بروتين الناقل الفرعية للمنتج يغاند محددة.في الوقت نفسه فقط إضافة وظائف كمؤشر جودة بصرية من إجراءات التعبئة، وتوفير تغذية مرتدة فورية وبديهية للمشغل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

مقاربة سطحية وكفاءة لإنتاج المذيلات عكسية ثاني كبريتيد عبر ربط

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

A طريقة الترشيح القائم على إعداد نوى عالية الجودة من عبر ربط العضلات والهيكل العظمي للكروماتين مناعي

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop المعطل تداولها تقارب معدنية اللوني، إعادة تشكيل ومقايسة من بوليهيستيديني معلم متالونزيمي للمختبرات الجامعية

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

التحديد السريع لتقارب الأجسام المضادة- المستضدات بواسطة القياس الضوئي الشامل

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

إنتاج البروتينات الخالية من الخلايا للتحليل الوظيفي وتطوير الأجسام المضادة التي تستهدف البروتينات الغشائية

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

تطوير قطاع كروماتوغرافي للتدفق الجانبي للكشف السريع والكمي عن مركبات الجزيئات الصغيرة

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...