Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende Ibrahim Al Amedi for at dyrke de transgene tobaksplanter og Dr. Thomas Rademacher for at levere tobaks ekspressions vektoren. Forfatterne ønsker at takke Dr. Richard M. Twyman for redaktionel assistance og Markus Sack for frugtbare diskussioner om DFE Affinity ligand struktur. Dette arbejde blev delvis finansieret af de interne programmer Fraunhofer-Gesellschaft under Grant No. Tiltrække 125-600164 og staten Nordrhein-Westfalen under Leistungszentrum Grant No. 423 "netværksbaseret, adaptiv produktion". Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inden for rammerne af forsknings uddannelsesgruppen "tumor målrettet lægemiddel levering" Grant 331065168. GE Healthcare støttede offentliggørelsen af denne artikel i åben adgang.

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Anvendelser af den nye affinitets harpiks
Vi har vist, at brugerdefinerede affinitets kromatografi harpiks til opsamling af MABS kan fremstilles ved at immobilisere en ligand indeholdende en Mab-specifik epitop til NHS-aktiveret Cross-linked agopstod. At designe en sådan harpiks, var det nødvendigt at kende epitop sekvens og til at bruge en lineær epitop. De resulterende harpiks er fordelagtige for erobring af mAbs, fordi de potentielt kunne erstatte dyre protein en affinitets kromatografi trin. Interaktionen mellem 2F5 og DFE i vores casestudie blev medieret af epitope – paratope binding, så vores ligand bør være mere selektiv end protein A, som binder til FC-regionen af de fleste murine og humane IgGs. Fordi individuelle ligander er nødvendige for hver Mab, kan vores metode i første omgang synes egnet primært til antistoffer, der produceres på en meget stor skala. Men ved at kombinere vores tilgang med hurtige plante-baserede forbigående protein udtryk, kan nye affinitets ligander forberedes på mindre end 2 uger27 med minimal indsats28. Derfor er metoden også velegnet til små mAb rensning.
Produktion og potentielle forbedringer af affinitets ligand
Planter tilbyder en hurtig og sikker produktionsplatform for Affinity ligander5,29,30, såsom DFE fusion protein featured i vores casestudie. Blanching plantematerialet reducerede i høj grad mængden af værtscelle proteiner i et enkelt trin og blev let integreret i en standard afklarings rutine. Men, inddrivelse af ligand var lav i den nuværende opsætning, sandsynligvis på grund af sin moderat termisk stabilitet og nogle ikke-specifik binding til filter lagene, som rapporteret for andre produkter31,32,33. Ingeniør luftfartsselskabet til at øge sin termiske stabilitet kan derfor bidrage til at forbedre ligand udbytte i fremtiden, som beskrevet for malariavaccine kandidat CCT, antitumor enzym PpADI eller en mesofile β-glucosidase34, 35af36. Det samme gælder for dybde filtrerings trinnet, hvor protein teknik kan medvirke til at reducere den ikke-specifikke binding til Filtermaterialet37. Produktionsomkostningerne for DFE og lignende ligander kunne også reduceres ved at forbedre den generelle effektivitet af præciseringen ved hjælp af flokkulanter eller filter additiver38,39.
Når DsRed bruges som transportør, danner det et tetramerisk kompleks. Dette er fordelagtigt, fordi det øger antallet af epitoper per ligand, men det kan også gøre ligand mere modtagelig for demontering eller denaturering under affinitets kromatografi. Et monomere bære protein som mcherry kan derfor være at foretrække, fordi det er stabilt ved lav pH-værdi40, og inkluderingen af tandem gentagelser af epitop vil øge lydens aviditet og dermed øge harpiks kapaciteten5, 26 , 41. for simple bære-epitope proteiner (dvs. dem uden disulfid obligationer eller post-translationelle modifikationer) mikrobielle produktionssystemer kan reducere fremstillingsomkostningerne og gøre ligander mere konkurrencedygtige med protein A. For eksempel er grøn fluorescerende protein blevet udtrykt i bakterieceller med et afkast på ~ 1 g · kg-1 biomasse, hvilket i væsentlig grad ville reducere ligand produktionsomkostninger42.
Uanset udtryks værten, en renset affinitet ligand var påkrævet under koblingen for at minimere immobilisering af Host celle proteiner eller mediekomponenter, der ellers kan reducere harpiks selektivitet og kapacitet. Optagelsen af en poly-histidine tag til iMac rensning øget renhed til ~ 90% i et enkelt trin, lette hurtig og billig ligand produktion5,43,44. Fusions tagens position er imidlertid vigtig, fordi den har potentialet til at hæmme epitop binding eller til at inducere spalningen af enten tagget eller epitop fra bæreren45,46.
Immobilisering af Affinity ligand på NHS-aktiverede kromatografikolonner
Immobilisering blev udført manuelt eller ved hjælp af et kromatografi system. De små buffer mængder pr. kolonne syntes at favorisere manuel håndtering (f. eks. på grund af den minimale affaldsmængde). Hvis der er behov for flere/større kolonner, gør kromatografisystemet imidlertid det lettere at styre koblings forholdene (f. eks. regulerede strømningshastigheder) og er derfor mere tilbøjelige til at opnå reproducerbare resultater med hensyn til DBC. Vores data tyder på, at koblings bufferen og pH har en vigtig effekt på koblings effektiviteten og de samlede kolonne omkostninger. Screenings faktorer, der påvirker koblings reaktionen og justerer dem for hvert bære protein (eller endda for hvert luftfartsselskab – ligand fusion), kan derfor forbedre koblings effektiviteten og harpiks ydeevnen, og vi anbefaler denne fremgangsmåde.
Test 2F5 isolation ved hjælp af DFE affinitet harpiks
Produkt udbytte og renhed er vigtige aspekter af harpiks ydeevne, og i tilfælde af DFE opnåede vi et afkast på 105 ± 11% (± SD, n = 3) og en renhed på 97 ± 3% (± SD, n = 3), som er sammenlignelig med ydeevnen af benchmark protein A harpiks25 ,26. En anden vigtig Præstationsindikator for harpiks i almindelighed (og især for dem, der er baseret på Affinity ligands) er DBC ved 10% produkt gennembrud, fordi denne parameter påvirker mængden af harpiks, der kræves for en bestemt proces og dermed omkostningerne. For DFE ligand, den oprindelige DBC var ~ 4 g · L-1 harpiks, som er ~ 13% af den tilsvarende værdi for protein A under lignende betingelser (kun 2 min kontakttid)25,47 men ca. 15 gange højere sammenlignet med andre brugerdefinerede affinitet harpiks såsom anti-FSH-immun affinitet ligand bruger den samme opholdsperiode på 2 min48. Dfe'en af DFE faldt til 15% af startværdien efter 25 binde-og elute cyklusser, hvorimod der kræves mere end 50 cyklusser for samme tab af DBC i kommercielt protein A harpiks49. Det er dog vigtigt at bemærke, at vores luftfartsselskab endnu ikke er blevet optimeret i samme omfang som protein A, som er blevet grundigt undersøgt og forbedret i løbet af de sidste fire årtier8.
Hidtil har vi forbedret harpiks stabilitet og produkt genvinding ved at skifte fra en lav-pH elueringsbuffer til en høj koncentration af magnesiumchlorid (figur 3), som anbefalet i tidligere undersøgelser13. Den karakteristiske røde farve af affiniteten ligand ikke falmer væsentligt under de 25 binde-og-elute cyklusser, så vi spekulerer på, at endogene plante proteaser i de afklarede planteekstrakter31 kan have afkortet og dermed inaktiveret epitop af ligand. Derfor, designe proteaseresistente linkers til at forbinde bæreren og epitop kan bidrage til at opretholde den oprindelige DBC over et udvidet antal cyklusser. I betragtning af den hurtige og enkle ekspression og oprensning af DFE ligand, dens ligetil kobling til kommerciel kromatografi harpiks, og dens fremragende produkt udbytte og renhed, mener vi, at vores metode tilbyder et passende alternativ til protein A for rensning af mAbs og antistof derivater, som ikke binder sig til protein A, især hvis forbedringer af bæreren og linker kan forbedre DBC og ligand stabilitet. Denne antagelse blev understøttet af den lille forskel i dissociationskonstant af DFE-renset og protein A-renset 2F5 antistof5, hvilket indikerer, at vores nye affinitet ligand tillader genopretning af høj kvalitet MABS.
Fordele og nuværende begrænsninger af metoden
Produktion af affinitet ligand som en genetisk fusion med et bære protein øger Opløselighed i vandige buffere og dermed kompatibilitet med typiske ligand kobling betingelser. I modsætning hertil kan blind peptider afledt af fast fase peptidsyntese have begrænset opløselighed under disse forhold på grund af deres sekvens50, som ikke kan ændres, fordi det er dikteret af aminosyren sekvens af epitop anerkendt af Mab til renses. Andre har derfor brugt en on-harpiks syntese af peptidligands51. Den statiske bindings kapacitet for den resulterende harpiks var høj (~ 80 g · L-1), men processen med harpiks forberedelse er langvarig, en dynamisk bindende kapacitet blev ikke rapporteret, og den opnåede renhed og nyttiggørelse var lavere end i vores tilgang. En yderligere fordel ved en fusion protein ligand i laboratorieskala er, at ligand og varianter deraf kan hurtigt produceres, renses og testes med minimal indsats i en nem at bruge High-through Expression system52.
De to nuværende begrænsninger af den metode, der præsenteres her, er den lave dynamiske bindingsevne på 3 g · L-1 og dens 90% reduktion i løbet af 25 binde-og-elute cyklusser5. Disse begrænsninger kan håndteres i fremtiden ved at anvende mindre strenge laste betingelser og erstatte den nuværende DsRed carrier med en konstrueret, mere stabil variant hhv. For eksempel har en fordobling af den aktuelle kontakttid fra 2 til 4 minutter potentialet til at fordoble den dynamiske bindings kapacitet, som det blev vist for nogle proteiner A-harpiks26.
Fejlfinding
Følgende tabel fremhæver potentielle problemer, der kan opstå i løbet af denne protokol, og giver tips til, hvordan du løser dem (tabel 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabel 1: potentielle problemer, der kan opstå, og mulige rettelser.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokol trin</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Retters</td>
			<td>Lave</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Planter vokser ikke</td>
			<td>Kompromitterede vækstbetingelser</td>
			<td>Kontroller pH og ledningsevne af gødning</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kontroller temperatur og lysforhold</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 og 3</td>
			<td>Store mængder af Host celle proteiner er til stede efter ekstraktion</td>
			<td>Ufuldstændig nedbør</td>
			<td>Kontroller temperaturen under blanchering</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kontroller omrøringen i blanchbadet</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 og 3</td>
			<td>Intet produkt fundet i plante ekstrakten</td>
			<td>Blanching temperatur for høj</td>
			<td>Kontroller temperatur og pH under blanchering</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH i blanchering buffer for lav</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Store stængel-eller bladdele forbliver efter ekstraktion</td>
			<td>Ufuldstændig blanding i Blender</td>
			<td>Sørg for, at plantematerialet ikke danner en prop i blenderen</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Hurtig trykstigning under dybde filtrering</td>
			<td>Forkert valg af filter og/eller retning</td>
			<td>Kontroller filtertype og-retning</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Lille fusionsprotein under eluering/en masse fusionsprotein i gennemstrømnings</td>
			<td>IMAC-harpiks blev ikke ladet med metalioner</td>
			<td>Kontroller, om IMAC-harpiksen er korrekt opladet med ioner</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Fusion protein mistede Affinity-tagget</td>
			<td>Undgå intens sollys og høje temperaturer under plantedyrkning</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Fusionsprotein tabt under koncentrationen</td>
			<td>Fusionsprotein bundet til membranen</td>
			<td>Kontroller membran typen</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sørg for, at koncentrationsfaktoren ikke var for høj</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Lav koblings ydelse</td>
			<td>Forkert sekvens af tilkoblings reagens tilsætning</td>
			<td>Kontroller reagenserne etiketter og sekvens af tilsætning</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Ukorrekt klargøring af kolonnerne før kobling</td>
			<td>Kontroller betingelserne for kolonne klargøringen</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 og 6</td>
			<td>Lav mAb-ydelse</td>
			<td>Lavt mAb-udtryk i plante biomassen</td>
			<td>Test mAb-udtryk i biomasse</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Lav ligand tæthed</td>
			<td>Kontrollere renheden af fusionsprotein præparatet</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Meget lave/høje proteinkoncentrationer i Bradford assay</td>
			<td>Bobledannelse under pipettering</td>
			<td>Check for bobler i 96-brønd palte</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Lav mAb-koncentration under SPR-måling</td>
			<td>Kompromitteret protein en chip</td>
			<td>Sammenlign med resultaterne af standard mAb med kendt koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Ukorrekt prøve fortynding</td>
			<td>Kontrollér fortyndings hastigheden og buffer-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: fejlfinding.

Biofarmaceutiske produkter er vigtige for behandlingen af et bredt spektrum af sygdomme i næsten alle grene af medicin1. Monoklonale antistoffer (mAbs) dominerer det biofarmaceutiske marked, med verdensomspændende salg forventes at nå næsten €110.000.000.000 i 20202. Den favoriserede udtryks platform for MABS er ovarie cellelinjer fra kinesisk hamster, som typisk producerer høje Mab-titre på op til 10 g ∙ L-1 i kultur supernatanten3,4. Men, produktionen af mAbs i pattedyr cellekulturer er dyrt på grund af de høje omkostninger ved mediet og behovet for steril gæring5. Alternative udtryks platforme såsom planter kan tilbyde en hurtigere, enklere, billigere og mere skalerbar tilgang til industriel produktion6,7.
Ud over de omkostninger, der er forbundet med pattedyrscelle kulturer, er den udbredte brug af protein en affinitets kromatografi til produkt opsamling en stor omkostningsfaktor for industriel produktion af mAbs. Protein A findes naturligt på overfladen af Staphylococcus aureus celler, og det binder sig til fragment crystallizable (FC) regionen af visse murine og humane antistoffer, og dermed fungere som en forsvarsmekanisme til at omgå det humorale immunsystem8. Protein A er blevet branchens guld standard for opsamling af MABS fra cellekultur supernatanter og er også meget udbredt af forskersamfundet, fordi det er meget selektivt, typisk opnå Mab renheds på ~ 95% i et enkelt trin8. Ikke overraskende har salget af protein A i løbet af de sidste to årtier nøje afspejlet salget af mAbs8. Afhængigt af produktions skalaen kan omkostningerne til protein A svare til mere end 25% af de samlede procesomkostninger og dermed påvirke markedsprisen for terapeutiske MABS, som kan være op til €2.000 g-15,9. Derfor har alternative kromatografi harpiks med en lignende rensnings evne potentiale til at reducere produktionsomkostningerne betydeligt, hvilket gør antistof baserede terapier tilgængelige for et større antal patienter10,11 ,12. Sådanne alternativer kan også omgå ulemperne ved protein en kromatografi, herunder de barske elueringsforhold ved lav pH-værdi (typisk < 3.5), der potentielt kan forårsage, at mAbs undergår konformationsmæssige ændringer, der fremmer sammenlægning13 . Det er vigtigt, at protein A kun er selektivt for FC-regionen i visse IgG-underklasser, så ikke-funktionelle molekyler med trunkerede bindings domæner kan være co-rense med det intakte produkt5, hvorimod Mab-derivater såsom enkelt kædede variable fragmenter må ikke binde til protein A overhovedet.
Her beskriver vi en alternativ affinitets kromatografi harpiks til opsamling af hiv-neutraliserende Mab 2f5 ved hjælp af sin lineære epitop eldkwa (et bogstav aminosyre kode)5,14. Vi genetisk smeltet 2f5 epitop til C-endestation af det fluorescerende protein dsred, som fungerede som en bærer og reporter molekyle, og producerede den resulterende protein Dsred-2F5-Epitope (DFE) i transgene tobak ( Nicotiana Nicotiana tabacum) planter. DFE blev renset ved en enkelt trins immobiliseret metalionaffinitets kromatografi (IMAC). Immobilisering af den rensede DFE affinitets ligand på en tværbundet agopat harpiks blev opnået ved kemisk kobling ved hjælp af N-hydroxysuccinimide (NHS)-aktiverede Cross-linked aghas kolonner. Statistiske eksperimentelle design blev derefter brugt til at optimere immobilisering procedure og kobling effektivitet15. Rensnings strategien for mAb 2F5 blev evalueret med hensyn til antistof renhed, udbytte og ligand-stabilitet. I modsætning til protein A, som binder FC-regionen, er DFE bundet til den komplementaritets bestemmende region 2F5, der sikrer rensning af molekyler med en intakt paratope. Vores koncept kan nemt tilpasses til enhver Mab med en lineær epitop eller til andre peptidbaserede affinitets-ligander, som let kan identificeres ved mikroarray undersøgelser16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Figur 1: proces flow skema til fremstilling af epitop affinitet harpiks, der kan anvendes til opsamling af MABS fra rå planteekstrakter eller cellekultur supernatants. A) tilhørsforholdet LIGAND DFE blev udtrykt i transgene tobaksplanter. Et varme udfældnings trin (B) blev inkluderet, før de høstede blade blev homogeniseret (C). (D) den rå planteekstrakt blev præciseret ved posefiltre ring, dybde filtrering og 0,2 μm steril filtrering. (E) DFE blev derefter RENSET af iMac. (F, G) Den rensede DFE Affinity ligand blev immobiliseret på EDC/NHS-aktiverede Cross-linked aghas kolonner. (H) bakteriekulturer, der transporterer T-DNA-kodnings antistof 2F5, blev anvendt til forbigående ekspression i N. benthamiana -planter (i) dyrket i en phytotron. J) blade af N. benthamiana blev høstet og forarbejdet som beskrevet i D. (K) Mab 2f5 blev renset fra det afklarede uddrag ved hjælp af DFE-tilknytnings kolonnerne (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

Oprensning af monoklonale antistoffer (mAbs) opnås almindeligvis ved protein en affinitets kromatografi, som kan tegner sig for op til 25% af de samlede procesomkostninger. Alternative, omkostningseffektive fangst trin er derfor værdifulde for industriel produktion, hvor der produceres store mængder af en enkelt mAb. Her præsenterer vi en metode til immobilisering af en dsred-baserede epitop ligand til en cross-linked agopstået harpiks tillader selektiv opsamling af hiv-neutraliserende antistof 2f5 fra rå planteekstrakter uden at bruge protein a. Den lineære epitop eldkwa blev først genetisk smeltet til fluorescerende protein dsred og fusions proteinet blev udtrykt i transgene tobak (Nicotiana Nicotiana tabacum) planter før rensning ved immobiliseret metalionaffinitets kromatografi. Desuden blev en metode baseret på aktiveret tvær kædet agopstået optimeret til høj ligand tæthed, effektiv kobling og lave omkostninger. PH-og buffer sammensætningen og den opløselige ligand-koncentration var de vigtigste parametre under koblings proceduren, som blev forbedret ved hjælp af en metode til design af eksperimenter. Den resulterende affinitet harpiks blev testet for sin evne til selektivt binde Target mAb i en rå plante-ekstrakt og elueringsbuffer blev optimeret til høj mAb opsving, produkt aktivitet og affinitet harpiks stabilitet. Metoden kan let tilpasses andre antistoffer med lineære epitoper. De nye harpiks giver mulighed for blidere elueringsforhold end protein A og kan også reducere omkostningerne ved et indledende erobrings trin for Mab-produktion.

Udtryk og oprensning af affinitets ligand
Fusions proteinet DFE blev udtrykt i transgene tobaksplanter dyrket i et drivhus. Udbyttet var ~ 120 mg · kg-1 bladmasse med en gennemsnitlig biomasse på ~ 130 g pr. plante. DFE-renheden var < 5% af TSP i rå planteekstrakter før blanchering, men steg til ~ 40% efter varmebehandling ved 70 °C i 1,5 min, hvilket udfældede > 97% af værtscelle proteinerne. Den blanchering trin var let integreret i høst og udvinding rutine (figur 1) og tog mindre end 2 h ekstra tid, herunder opsætning af vandbad. Den samlede restitution af DFE var 23,5 mg kg1 med en renhed på > 90%. De trin, der er ansvarlige for produkt tabet, var blanching, dybde filtrering og IMAC med specifikke tab på henholdsvis 40%, 27% og 45%. Dybden filterkapaciteten var i gennemsnit 135 ± 36 L m-2 (± SD, n = 3) og dermed i det øvre område af værdier, som er rapporteret i litteraturen21. DFE-udbyttet steg med plantens alder (figur 2).
Immobilisering af Affinity ligand på NHS-aktiverede kromatografikolonner
Under de indledende koblings tests konstaterede vi, at HEPES-buffer (pH 8,3) forøgede koblings effektiviteten til 89 ± 6% (± SD, n = 3) sammenlignet med 78 ± 9% (± SD, n = 3) for den bicarbonatbuffer, som producenten anbefalede. Derfor blev HEPES anvendt til alle efterfølgende koblings eksperimenter. En DoE tilgang blev valgt for at optimere koblings effektiviteten af DFE til NHS-aktiveret Cross-linked agopstået harpiks. Den absolutte mængde af DFE immobiliseret på harpiksen steg med massen af DFE injiceres i kolonnen og plateaued på ~ 15 g · L-1 mens koblings udbyttet faldt kontinuerligt, da der blev injiceret mere DFE (figur 2). Koblings udbyttet blev også > 50% lavere i en sur buffer, hvilket indikerer behovet for at screene for passende koblings betingelser for hvert ligand fra sag til sag. Ideelle betingelser med hensyn til koblings udbytte, absolut mængde af immobiliseret DFE og kolonne omkostninger blev identificeret ved hjælp af den numeriske optimering værktøj af DoE software. De mest ønskværdige betingelser (pH 9,0 og 7,0 mg DFE pr. 1 mL tværbundet agopstået harpiks) var placeret på et stort plateau og var derfor robuste. DFE-molekylerne bevarede deres røde fluorescens selv efter koblingen, og farveintensiteten svarede til den totale mængde immobiliseret DFE (figur 2). Derfor kan kolonne farve bruges som en simpel kvalitetskontrol parameter til at estimere koblings effektiviteten og kolonne kvaliteten. Fluorescensen bekræftede også, at DFE fusion protein samlet i den tetrameriske tilstand af indfødte DsRed.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Figur 2: optimering af DFE immobilisering til NHS-aktiveret tværbundet agopstået harpiks. A) LDS-paa gel med Western blot overlay af homogeniterings-og elueringsproever fra ublancherede og blancherede TRANSGENE DFE-planteekstrakter. Høst af planter blev udført 38, 45 eller 52 dage efter såning. Western blots blev udført ved hjælp af en anti-hans6-antistoffer5. B) samlet mængde koblet DFE-affinitets ligand i afhængighed, hvis koblings-ph og den samlede masse af renset DFE INJICERES på NHS-aktiverede tvær tilknyttede aghas-kolonner. Røde prikker angiver de faktiske eksperimenter, der er udført for at opbygge respons overflade modellen. (C) DFE-tilknytningskolonner efter koblings proceduren. Numrene svarer til de koblings betingelser, som er fremhævet i panel B. DPS = dage efter såning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Test 2F5 isolation ved hjælp af DFE affinitet harpiks
Det rekombinante 2F5-antistof blev transitivt fremstillet i Nicotiana benthamiana -planter dyrket i en phytotron5. Erobringen af 2F5 fra den rå planteekstrakt blev testet ved hjælp af affinitets kolonner kombineret med ~ 7,0 mg renset DFE (trin 6). Eluering fra protein A harpiks indebærer normalt en sur buffer (pH ~ 3,3)13. Derfor evaluerede vi i første omgang forskellige lavph-elueringsbuffere (pH 6.0 – 3,25) for DFE-kolonnerne. Elueringen af 2F5 lykkedes ved pH-værdier under 4,5 med den højeste bedring på ~ 35% ved pH 3,25. Imidlertid inaktiverede Low-pH eluering både antistoffet (som bekræftet af SPR spectrometri) og DFE ligand (som indikeret ved tab af farve og den nedre DBC, figur 3). Sidstnævnte blev forudset i betragtning af, at de indfødte dsred denaturerede ved pH < 4,022,23. For at undgå produkt-og ligand-denaturering testede vi magnesiumchlorid som et alternativt elueringsmiddel, fordi det tidligere er blevet brugt til at belyse mAbs fra andre affinitets harpiks24. En koncentration af magnesiumchlorid på 1,25 M var tilstrækkelig til at elueres 2f5 fra DFE affinitets harpiks med et opsving på 105 ± 11% (± SD, n = 3) og en renhed på 97 ± 3% (± SD, n = 3). Denne præstation var sammenlignelig med protein A harpiks25,26. Ligevægts dissociations konstanten (KD) af DFE-renset 2F5-antistof og det syntetiske ligand Fuzeon var 791 PM, hvorimod et protein a-renset modstykke var 763 PM5. Desuden blev der ikke observeret noget væsentligt farvesab i harpiksen over i alt 25 binde-og elutecyklusser. DBC af DFE affinitet harpiks ved 10% 2F5 gennembrud faldt lineært i løbet af 25 cyklusser til ~ 15% af den oprindelige værdi (figur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Figur 3: afprøvning af isoleringen af 2F5 fra afklarede planteekstrakter ved hjælp af DFE-affinitets harpiks. (A) DFE-affinitets harpiks efter en elueringscyklus med buffere med forskellige pH-værdier i området 4,0 – 3,0 og den samme harpiks efter et neutraliserings trin ved pH 6,0. B) DFE-affinitets harpiks efter en og seks cyklusser med 2F5 rensning med 1,25 m eller 4,00 m magnesiumchlorid som eluent. C) kromatogrammer af forsøg til frontal lastning (gennembryde kurver) til bestemmelse af den cyklus afhængige dynamiske bindingsevne for DFE-harpiks ved hjælp af magnesiumchlorid som eluent. De gennembrud kurver blev målt for 4,0 M og 1,25 M magnesiumchlorid elueringsbuffere og forskellige cyklus numre. D) cyklus afhængig dynamisk bindingsevne for DFE med 1,25 M magnesiumchlorid som eluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

I denne procedure, en dsred-baserede epitop ligand er immobiliseret til at producere en meget selektiv affinitet harpiks til opsamling af monoklonale antistoffer fra rå planteekstrakter eller cellekultur supernatants, som et alternativ til protein a.

Aktiveret tvær kædet Agopstået for den hurtige udvikling af affinitets kromatografi harpiks-antistof opsamling som et casestudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Monoklonale antistoffer dominerer det biofarmaceutiske marked og renses typisk af Protein A-kromatografi. Den ifølge harpiks er en stor omkostningsdriver under produktionen påvirker prisen på antistof-baserede terapeutiske. Her beskriver vi en ny affinitetsligand baseret på det fluorescerende protein, der læses som bærer for den lineære epitop af HIV-neutraliserende antistof 2F5.Generelt vores metode tillader hurtig generation af affinitetkromatografi harpikser, som kan bruges til optagelse af monoklonale antistoffer. Vi demonstrerede denne evne ved at opfange antistof 2F5 fra rå planteekstrakt. Vi optimerede opsamlingsbetingelserne og løsningsbufferen for at forbedre den dynamiske bindingskapacitet og reususabilityen af harpiksen.Vores harpiks tillader generelt løsere forhold end Protein A og har potentiale til at reducere rensningsomkostningerne for monoklonale antistoffer. Desuden kan harpiksen nemt tilpasses til andre antistoffer, der binder sig til lineære epitoper. For at begynde denne procedure, justere koncentrationen af den forberedte affinitet ligand løsning, så det er i intervallet 5 til 15 gram per liter som defineret ved udformningen af eksperimenter.Opbevar opløsningen på is, indtil koblingsreaktionen er klar. Dernæst fyldes en to millilitersprøjte med DFE-opløsningen. Og forberede en adapter til at montere sprøjterne på NHS-aktiverede cross-link agarose kolonner med en seng volumen på en milliliter.For hver 10 kolonner, der anvendes til kobling, klargør 30 milliliter deaktiveringsopløsning, 30 milliliter lav pH-opløsning og en milliliter opbevaringsopløsning. Derefter forberedes 20 milliliter en millimolar saltsyre i et rør. Og inkuber det på is i mindst 20 minutter.Forbered en præcisionsskala for at overvåge flowet gennem brøker for alle trin under koblingsreaktionen. Derefter skal du åbne en forseglet NHS-aktiveret krydslinket agarosekolonne. Anvend en dråbe buffer på adapterindgangen for at forhindre luft i at trænge ind i kolonnen.Monter sprøjteadapteren ved søjleindgangen. Kolonnen vaskes med seks milliliter iskold saltsyre med en millimolarchlorsyre med en strømningshastighed på under 1 milliliter pr. minut. Ved hjælp af en to millilitersprøjte skal der straks injiceres 1,5 milliliter DFE-opløsning ved en strømningshastighed på mindre end en milliliter pr. minut.Og opsaml flowet gennem brøk på en præcisionsskala til efterfølgende analyse. Sænk kolonnen i begge ender og inkuber i 15 til 45 minutter ved 22 grader Celsius. Dernæst injiceres seks milliliter af aktiveringsopløsningen efterfulgt af seks milliliter lav pH-opløsning ved en strømningshastighed på mindre end en milliliter pr. minut, og de ikke kovalert bundne ligander fjernes fra harpiksen.Indsprøjt seks milliliter af aktiveringsopløsningen, og inkuber kolonnen i 15 minutter. Derefter injiceres der seks milliliter lav pH-opløsning i kolonnen. Efterfulgt af seks milliliter af aktiveringsopløsningen.Derefter injiceres yderligere seks milliliter lav pH-opløsning i kolonnen. Injicer to milliliter opbevaringsopløsning i kolonnen, og opbevar den ved fire grader Celsius. Først forberedes 100 milliliter enten det afklarede planteekstrakt indeholdende 2F5 eller supernatanten til det foretrukne cellebaserede ekspressionssystem, som også indeholder 2F5.Derefter forberedes ækvilibreringsbufferen og illusionbufferen med høj jern-styrke som beskrevet i tekstprotokollen. Skyl kromatografisystemet med bufferne. Monter en DFE-affinitetskolonne på kromatografisystemet.Og ligevægt med fem CV af ækvilibrering buffer, med en strømningshastighed på en milliliter per minut. UV-absorbansen ved 280 nanometer. Derefter indlæses 80 milliliter enten det afklarede planteekstrakt eller supernatanten på kolonnen med en strømningshastighed på 5 milliliter pr. minut.For at garantere en kontakttid på to minutter. Opsaml strømmen gennem prøver i to milliliter fraktioner eller gennembrud kurve rekonstruktion. Flowet opbevares gennem prøverne ved fire grader Celsius, hvis det ikke er muligt at foretage en øjeblikkelig prøveanalyse.Herefter vaskes kolonnen med 6CV ækvilibreringsbuffer. Der udtages en prøve i begyndelsen, midten og slutningen af vasken. MAB2F5 fortyndes med fem volumener af illusionbuffer med høj ionstyrke.Indsaml DFE-fraktionen, når UV-signalet ved 280 nanometer er steget til fem milli absorbansenheder over basislinjen. Optimer illusionsbufferen for hvert epitop-antistofpar som beskrevet i tekstprotokollen. Fusionsproteinet DFE udtrykkes i transgene tobaksplanter, der dyrkes i et drivhus.Den samlede genopretning af DFE er 23,5 mg/ kg. Med en renhed på over 90%Den absolutte mængde DFE immobiliseret på harpiksen stiger med massen af DFE injiceres i kolonnen, og plateauer på omkring 15 gram per liter, mens koblingen udbytte falder kontinuerligt som mere DFE injiceres. DFE molekyler ses at bevare deres røde florescence, selv efter kobling.Farveintensiteten svarer til den samlede mængde immobiliseret DFE. Derfor kan kolonnefarve bruges som en simpel kvalitetskontrolparameter til at estimere koblingseffektiviteten og kolonnekvaliteten. Det rekombinante 2F5 antistof produceres transiently i Nicotiana benthamiana planter dyrket i en phytotron.Fangsten af 2F5 fra den rå planteekstrakt, testes ved hjælp af affinitet kolonner, kombineret med cirka syv milligram renset DFE. En magnesiumchloridkoncentration på 1,25 molar er tilstrækkelig til at fremkalde 2F5 fra DFE-affinitets-harpiksen med et opsving tæt på 100% og en renhed på ca. 97%, som kan sammenlignes med Protein A-harpiks. DBC af DFE affinitet harpiks på 10% 2F5 gennembrud, falder lineært i løbet af de 25 cyklusser, til omkring 15% af den oprindelige værdi.Vi brugte et design af eksperimenter tilgang til at optimere kobling kapaciteten af vores affinitet ligand. Disse betingelser kan finjusteres til andre ligaander i fremtiden. Vores metode bruger florescent protein til at tråd en sub carrier protein for produktet specifikke ligand.Samtidig blot tilføje funktioner som en visuel kvalitet indikator for mobilisering procedure, der giver en øjeblikkelig og intuitiv feedback til operatøren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile og effektiv tilgang til fremkaldelse af reversibel disulfid Cross-forbundne Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

En filtreringsbaseret metode til fremstilling af højkvalitetsnuclei fra tværbundet skeletsmuskel til chromatinimmunpræcipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobiliseret Metal affinitet kromatografi, rekonstitution og analyse af en Polyhistidine mærkede Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Hurtig bestemmelse af antistof-antigen affinitet ved massefotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellefri produktion af proteoliposomer til funktionel analyse og antistofudvikling rettet mod membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Udvikling af en Lateral Flow immunokromatisk strimmel til hurtig og kvantitativ påvisning af små molekyleforbindelser

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...