Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

We willen Ibrahim al Amedi graag erkennen voor het cultiveren van de transgene tabaksplanten en Dr. Thomas Rademacher voor het leveren van de tabaks uitdrukking vector. De schrijvers willen Dr. Richard M. Twyman bedanken voor redactioneel hulp en Markus Sack voor vruchtbare discussies over de ligand-structuur van de DFE-affiniteit. Dit werk werd deels gefinancierd door de interne Programma's van de Fraunhofer-Gesellschaft onder Grant No. Attract 125-600164 en de staat Noord-Rijnland-Westfalen onder het Leistungszentrum Grant No. 423 "netwerk, adaptieve productie". Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) in het kader van de onderzoeksgroep "tumor-gerichte medicijn bezorging" Grant 331065168. GE Healthcare ondersteunde de Open-Access publicatie van dit artikel.

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Toepassingen van de roman Affinity hars
We hebben aangetoond dat aangepaste affiniteits chromatografie harsen voor de inname van MABS kunnen worden vervaardigd door het immobiliseren van een ligand met een MAB-specifieke epitoop aan NHS-geactiveerde cross-linked agarose. Om zo'n hars te ontwerpen, was het noodzakelijk om de epitoop sequentie te kennen en een lineaire epitoop te gebruiken. De resulterende harsen zijn voordelig voor de inname van mAbs omdat ze mogelijk dure eiwitten een affiniteits chromatografie stappen zouden kunnen vervangen. De interactie tussen 2F5 en DFE in onze casestudy werd gemedieerd door epitope-paratope binding, dus onze ligand moet selectiever zijn dan proteïne A, die bindt aan de FC-regio van de meeste Murine en menselijke IgGs. Omdat individuele liganden nodig zijn voor elke mAb, kan onze methode in eerste instantie lijken vooral geschikt voor antilichamen die op zeer grote schaal worden geproduceerd. Door onze aanpak te combineren met een snelle, op planten gebaseerde, voorbijgaande eiwit expressie kunnen nieuwe affiniteits liganden echter in minder dan 2 weken27 worden bereid met minimale inspanning28. Daarom is de methode ook geschikt voor kleinschalige mAb-zuivering.
Productie en mogelijke verbeteringen van de affiniteit ligand
Planten bieden een snel en veilig productieplatform voor affiniteit liganden5,29,30, zoals de DFE Fusion Protein uit onze casestudy. Door het plantenmateriaal te blancheren werd de hoeveelheid celeiwitten in één stap sterk gereduceerd en werd het eenvoudig geïntegreerd in een standaard klarings routine. Echter, het herstel van de ligand was laag in de huidige setup, waarschijnlijk te wijten aan de gematigde thermische stabiliteit en sommige niet-specifieke binding aan de filter lagen, zoals gerapporteerd voor andere producten31,32,33. Engineering van de vervoerder om de thermische stabiliteit te verhogen kan daarom helpen om de ligand opbrengst in de toekomst te verbeteren, zoals beschreven voor de malaria vaccin kandidaat CCT, de antitumorale enzym PpADI of een mesophilische β-glucosidase34, 35,36. Hetzelfde geldt voor de diepte filtratie stap, waar de eiwit techniek kan helpen om niet-specifieke binding aan het filtermateriaal37te verminderen. De productiekosten voor DFE en soortgelijke liganden kunnen ook worden verlaagd door de algemene efficiëntie van verduidelijking met behulp van flocculanten of filter additieven38,39te verbeteren.
Wanneer dsred wordt gebruikt als een vervoerder, vormt het een tetramere complex. Dit is voordelig omdat het verhoogt het aantal epitopen per ligand, maar het kan ook de ligand meer vatbaar voor demontage of denaturatie tijdens de affiniteits chromatografie. Een monomerische dragerproteïne zoals mcherry kan daarom de voorkeur hebben, omdat het stabiel is bij lage pH40, en de opname van tandem herhalingen van de epitoop de avidity van de ligand zou verhogen en zo de hars capaciteit5zou verhogen, 26 , 41. voor eenvoudige drager-epitope eiwitten (d.w.z. mensen zonder bisulfide obligaties of post-translationele modificaties) kunnen microbiële productiesystemen de productiekosten verlagen en de liganden concurrerender maken met proteïne A. Zo is groen fluorescerend eiwit uitgedrukt in bacteriële cellen met een rendement van ~ 1 g · kg-1 biomassa, wat de ligand productiekosten aanzienlijk zou verminderen42.
Ongeacht de expressie-host, een gezuiverde affiniteit ligand was vereist tijdens de koppeling om te minimaliseren van de immobilisatie van host-cel eiwitten of media-onderdelen die anderszins hars selectiviteit en capaciteit kunnen verminderen. De opname van een poly-histidine-tag voor de iMac-zuivering verhoogde de zuiverheid tot ~ 90% in één stap, waardoor snelle en goedkope ligand productie5,43,44werd vergemakkelijkt. De positie van de Fusion-tag is echter belangrijk omdat het de potentie heeft om de epitoop binding te hinderen of om het decolleté van de tag of de epitoop van de drager45,46te induceren.
Immobilisatie van de affiniteit ligand op de NHS-geactiveerde chromatografie kolommen
Immobilisatie werd handmatig uitgevoerd of met behulp van een chromatografie systeem. De kleine buffer volumes per kolom leken de handmatige behandeling te bevoordelen (bijvoorbeeld vanwege de minimale afvalvolumes). Als echter meerdere/grotere kolommen nodig zijn, maakt het chromatografie systeem de koppelings condities gemakkelijker te controleren (bijv. gereguleerde stromingssnelheden) en is het daarom waarschijnlijker dat er reproduceerbare resultaten worden bereikt in termen van DBC. Onze gegevens suggereren dat de koppelings buffer en pH een belangrijk effect hebben op de koppelings efficiëntie en de totale kolom kosten. Screening factoren die de koppelingsreactie beïnvloeden en deze aanpassen voor elk dragereiwit (of zelfs voor elke drager-ligand fusie) kunnen daarom de koppelings efficiëntie en de hars prestaties verbeteren, en we bevelen deze aanpak aan.
Testen van 2F5-isolatie met behulp van de DFE-affiniteits hars
Product opbrengst en zuiverheid zijn belangrijke aspecten van de hars prestaties, en in het geval van DFE bereikten we een rendement van 105 ± 11% (± SD, n = 3) en een zuiverheid van 97 ± 3% (± SD, n = 3), wat vergelijkbaar is met de prestaties van benchmark-eiwit A Resins25 ,26. Een andere belangrijke prestatie-indicator voor harsen in het algemeen (en in het bijzonder voor mensen op basis van affiniteits liganden) is de DBC met een product doorbraak van 10%, omdat deze parameter de hoeveelheid hars beïnvloedt die nodig is voor een specifiek proces en dus de kosten. Voor de DFE ligand was de eerste DBC ~ 4 g · L-1 hars, dat is ~ 13% van de overeenkomstige waarde voor proteïne A onder vergelijkbare omstandigheden (slechts 2 min contacttijd)25,47 maar ongeveer 15-voudige hoger in vergelijking met andere aangepaste affiniteit harsen zoals de anti-FSH-immunoaffinity ligand met dezelfde verblijfstijd van 2 min48. De DBC van DFE daalde tot 15% van de startwaarde na 25 BIND-en-elute cycli, terwijl meer dan 50 cycli nodig zijn voor hetzelfde verlies van DBC in commerciële eiwitten A Resins49. Echter, het is belangrijk op te merken dat onze vervoerder is nog niet geoptimaliseerd in dezelfde mate als proteïne A, die uitvoerig is onderzocht en verbeterd in de afgelopen vier decennia8.
Tot nu toe hebben we de hars stabiliteit en productterugwinning verbeterd door over te schakelen van een laagph-elutie buffer naar een hoge concentratie magnesium chloride (Figuur 3), zoals aanbevolen in eerdere studies13. De karakteristieke rode kleur van de affiniteit ligand niet aanzienlijk vervagen tijdens de 25 BIND-en-elute cycli, dus we speculeren dat endogene plant proteasen in de geklaarde plantenextracten31 mei zijn afgekapt en dus geïnactiveerd de epitoop van de ligand. Daarom kan het ontwerpen van protease bestendige linkers om de drager en epitoop aan te sluiten, helpen om de initiële DBC over een uitgebreid aantal cycli te handhaven. Gezien de snelle en eenvoudige expressie en zuivering van de DFE ligand, haar eenvoudige koppeling aan commerciële chromatografie harsen, en haar uitstekende Productopbrengst en zuiverheid, zijn wij van mening dat onze methode een geschikt alternatief biedt voor proteïne A voor de zuivering van mAbs en antilichaam derivaten die niet binden aan eiwitten A, vooral als verbeteringen aan de drager en linker de DBC en ligand stabiliteit kunnen verbeteren. Deze aanname werd ondersteund door het kleine verschil in de dissociatieconstante van DFE-gezuiverde en proteïne A-gezuiverde 2F5 antilichaam5, wat aangeeft dat onze nieuwe affiniteit ligand het herstel van kwalitatief hoogwaardige MABS mogelijk maakt.
Voordelen en huidige beperkingen van de methode
Het produceren van de affiniteit ligand als een genetische fusie met een dragereiwit verhoogt de oplosbaarheid in waterige buffers en dus compatibiliteit met typische ligand koppelings condities. In tegenstelling, lege peptiden afgeleid van Solid phase peptide synthese kan hebben beperkte oplosbaarheid onder deze omstandigheden als gevolg van hun sequentie50, die niet kan worden gewijzigd omdat het wordt bepaald door de aminozuursequentie van epitoop erkend door de MAB aan worden gezuiverd. Anderen hebben daarom een on-Resin synthese van peptide liganden51gebruikt. De statische binding capaciteit van de resulterende hars was hoog (~ 80 g · L-1), maar het proces van de voorbereiding van de hars is lang, een dynamische binding capaciteit werd niet gerapporteerd en de verkregen zuiverheid en herstel waren lager dan in onze aanpak. Een bijkomend voordeel van een fusie-eiwit ligand op laboratoriumschaal is dat de ligand en varianten daarvan snel kunnen worden geproduceerd, gezuiverd en getest met minimale inspanning in een eenvoudig te gebruiken High-through expressie systeem52.
De twee huidige beperkingen van de hier gepresenteerde methode zijn de lage dynamische binding capaciteit van 3 g · L-1 en zijn 90% reductie in de loop van 25 BIND-en-elute cycli5. Deze beperkingen kunnen in de toekomst worden aangepakt door minder strenge belastingsvoorwaarden toe te passen en de huidige DsRed Carrier te vervangen door een engineered, stabielere variant. Bijvoorbeeld, verdubbeling van de huidige contacttijd van 2 naar 4 minuten heeft de potentie om de dynamische binding capaciteit te verdubbelen zoals werd aangetoond voor sommige eiwitten A Resins26.
Probleemoplossing
In de volgende tabel worden mogelijke problemen belicht die tijdens dit protocol kunnen optreden en worden hints gegeven over het oplossen ervan (tabel 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabel 1: mogelijke problemen die kunnen worden aangetroffen en mogelijke correcties.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protocol stap</td>
			<td>Probleem</td>
			<td>Couse</td>
			<td>Fix</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Planten groeien niet</td>
			<td>Gecompromitteerde groei voorwaarden</td>
			<td>Controleer de pH en geleiding van de meststof</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Controleer de temperatuur en lichtomstandigheden</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 en 3</td>
			<td>Grote hoeveelheden host-celeiwitten zijn aanwezig na extractie</td>
			<td>Onvolledige neerslag</td>
			<td>Controleer de temperatuur tijdens het blancheren</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Controleer de opwinding in het blancheren bad</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 en 3</td>
			<td>Geen product gevonden in het plantenextract</td>
			<td>Blanching temperatuur te hoog</td>
			<td>Controleer de temperatuur en pH tijdens het blancheren</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH in blancheren buffer te laag</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Grote stuurpen-of blad delen blijven na extractie</td>
			<td>Onvolledige menging in Blender</td>
			<td>Zorg ervoor dat het plant materiaal geen stekker in de blender vormt</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Snelle drukverhoging tijdens diepte filtratie</td>
			<td>Onjuiste filter selectie en/of oriëntatie</td>
			<td>Het filtertype en de afdrukstand controleren</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Weinig fusie-eiwit tijdens elutie/veel fusie-eiwit in doorstroom</td>
			<td>IMAC Resin werd niet opgeladen met metaalionen</td>
			<td>Controleer of de IMAC Resin correct is opgeladen met ionen</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Fusie-eiwit verloor de affiniteits tag</td>
			<td>Vermijd intens zonlicht en hoge temperaturen tijdens de plantenteelt</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Fusie-eiwit verloren tijdens de concentratie</td>
			<td>Fusie-eiwit gebonden aan het membraan</td>
			<td>Controleer het membraan type</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Zorg ervoor dat de concentratiefactor niet te hoog is</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Lage koppelings opbrengst</td>
			<td>Onjuiste volgorde van toevoeging van koppelings reagens</td>
			<td>Controleer de reagentia labels en de volgorde van de toevoeging</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Onjuiste voorbereiding van de kolommen vóór koppeling</td>
			<td>Controleer de voorwaarden van kolom preparaiton</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 en 6</td>
			<td>Lage mAb-opbrengst</td>
			<td>Lage mAb-expressie in de planten biomassa</td>
			<td>Test mAb-expressie in biomassa</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Lage ligand dichtheid</td>
			<td>Controleer de zuiverheid van de fusie-eiwit voorbereiding</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Zeer lage/hoge eiwit concentraties in de Bradford-test</td>
			<td>Bellenvorming tijdens pipetteren</td>
			<td>Controleren op bubbels in de 96-well Blaha</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Lage mAb-concentratie tijdens de SPR-meting</td>
			<td>Gecompromitteerde eiwitten een chip</td>
			<td>Vergelijk met de resultaten van standaard mAb met bekende concentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Onjuiste monster verdunning</td>
			<td>Controleer de verdunningsgraad en de buffer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: probleemoplossing.

Biofarmaceutische producten zijn belangrijk voor de behandeling van een breed spectrum van ziekten in bijna elke tak van geneeskunde1. Monoklonale antilichamen (mAbs) domineren de biopharmaceutische markt, waarbij de wereldwijde verkoop naar verwachting bijna €110.000.000.000 in 20202bereikt. De favoriete expressie platform voor MABS zijn Chinese Hamster ovarium cellijnen, die typisch produceren hoge MAB Antilichaamtiters tot 10 g ∙ L-1 in de cultuur supernatant3,4. De productie van mAbs in zoogdier celculturen is echter duur vanwege de hoge kosten van het medium en de noodzaak van steriele gisting5. Alternatieve uitdrukkings platformen zoals planten bieden mogelijk een snellere, eenvoudigere, goedkopere en meer schaalbare aanpak voor industriële productie van6,7.
Naast de kosten in verband met de celculturen van zoogdieren is het wijdverbreide gebruik van eiwitten een affiniteits chromatografie voor product opname een belangrijke kosten motor voor de industriële productie van mAbs. Eiwit A is van nature te vinden op het oppervlak van Staphylococcus aureus cellen en bindt zich aan het fragment kristalzable (FC) gebied van bepaalde Murine en menselijke antilichamen, waardoor fungeert als een afweermechanisme om het humorale immuunsysteem te omzeilen8. Proteïne A is uitgegroeid tot de industrie gouden standaard voor de inname van MABS uit de celcultuur supernatanten en wordt ook op grote schaal gebruikt door de onderzoeksgemeenschap omdat het zeer selectief, typisch bereiken MAB zuiverheid van ~ 95% in een enkele stap8. Niet verrassend, de verkoop van eiwitten in de afgelopen twee decennia hebben nauw gespiegeld de verkoop van mAbs8. Afhankelijk van de productieschaal kunnen de kosten van proteïne A overeenkomen met meer dan 25% van de totale proceskosten en daardoor de marktprijs van therapeutische MABS beïnvloeden, die tot €2.000 g-15,5kanzijn. Daarom hebben alternatieve chromatografie harsen met een vergelijkbare zuiverings prestatie het potentieel om de productiekosten aanzienlijk te verlagen, waardoor op antilichamen gebaseerde therapieën toegankelijk zijn voor een groter aantal patiënten van10,11 ,12. Dergelijke alternatieven kunnen ook de nadelen van eiwit een chromatografie omzeilen, met inbegrip van de strenge elutie-omstandigheden bij lage pH (typisch < 3.5) die kunnen leiden tot mAbs om conformationele veranderingen te ondergaan die aggregatie bevorderen13 . Belangrijk is dat proteïne A alleen selectief is voor de regio FC van bepaalde IgG-subklassen, zodat niet-functionele moleculen met afgeknotte bindings domeinen kunnen samenwerken met het intacte product5, terwijl MAB-derivaten, zoals enkele-keten-variabele fragmenten niet binden aan eiwitten A helemaal.
Hier beschrijven we een alternatieve affiniteits chromatografie hars voor de inname van de HIV-neutraliserende MAB 2f5 met behulp van de lineaire epitoop eldkwa (één letter aminozuur code)5,14. We genetisch fuseerden de 2f5 epitoop tot het C-eindpunt van het fluorescerende eiwit dsred, dat functioneerde als drager en reporter molecuul, en produceerde de resulterende proteïne Dsred-2F5-Epitope (DFE) in transgene tabak ( Nicotiana tabacum) planten. DFE werd gezuiverd door één-stap geïmmobiliseerde metaal-ion affiniteits chromatografie (IMAC). De immobilisatie van de gezuiverde DFE-affiniteit ligand op een kruisgebonden agarose-hars werd bereikt door chemische koppeling met behulp van N-hydroxysuccinimide (NHS)-geactiveerde kruisgebonden agarose-kolommen. Statistische experimentele ontwerpen werden vervolgens gebruikt om de immobilisatie procedure te optimaliseren en de koppelings efficiëntie15. De zuiverings strategie voor mAb 2F5 werd geëvalueerd in termen van zuiverheid van het antilichaam, opbrengst en ligand stabiliteit. In tegenstelling tot eiwit A, dat de FC-regio bindt, gebonden DFE aan de complementariteit-bepalende regio van 2F5, waardoor de zuivering van moleculen met een intact paratope. Ons concept kan eenvoudig worden aangepast aan elke MAB met een lineaire epitoop of aan andere op peptide gebaseerde affiniteits liganden die gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door Microarray studies16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Figuur 1: processtroom schema voor de bereiding van epitoop affiniteit harsen die kunnen worden gebruikt voor de inname van MABS van ruwe plantenextracten of celkweek supernatants. A) de affiniteit LIGAND DFE werd uitgedrukt in transgene tabaksplanten. Een hitte precipitatie stap (B) werd opgenomen voordat geoogst blad werden gehomogeniseerd (C). D) het ruwe plantaardige extract werd verduidelijkt door filtratie van de zak, diepte filtratie en 0,2 μm steriele filtratie. (E) DFE werd vervolgens gezuiverd door iMac. (F, G) De gezuiverde DFE-affiniteit ligand werd geïmmobiliseerd op EDC/NHS-geactiveerde kruisgebonden agarose-kolommen. H) bacteriële culturen met T-DNA-codering antilichaam 2F5 werden gebruikt voor voorbijgaande expressie in N. benthamiana -planten (I) gekweekt in een phytotron. J) N. benthamiana -bladeren werden geoogst en verwerkt zoals beschreven in D. (K) MAB 2f5 werd gezuiverd uit het opgehelderd extract met behulp van de DFE-affiniteits kolommen (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

De zuivering van monoklonale antilichamen (mAbs) wordt vaak bereikt door proteïne een affiniteits chromatografie, die tot 25% van de totale proceskosten kan verwerken. Alternatieve, kosteneffectieve Vang stappen zijn daarom waardevol voor productie op industriële schaal, waarbij grote hoeveelheden van één mAb worden geproduceerd. Hier presenteren we een methode voor de immobilisatie van een op dsred gebaseerde epitoop ligand aan een kruisgebonden agarose hars waardoor de selectieve inname van het HIV-neutraliserende antilichaam 2f5 uit ruwe plantenextracten zonder gebruik van proteïne a. De lineaire epitoop eldkwa werd eerst genetisch gesmolten tot het fluorescerende eiwit Dred en het fusie-eiwit werd uitgedrukt in transgene tabak (Nicotiana tabacum) planten vóór zuivering door geïmmobiliseerde metaal-ion affinity chromatografie. Verder werd een methode gebaseerd op geactiveerde kruisgebonden agarose geoptimaliseerd voor hoge ligand dichtheid, efficiënte koppeling en lage kosten. De pH en buffer samenstelling en de oplosbare ligand concentratie waren de belangrijkste parameters tijdens de koppelingsprocedure, die werd verbeterd met behulp van een ontwerp-van-experimenten aanpak. Het resulterende affiniteits hars werd getest op zijn vermogen om het doel mAb selectief te binden in een ruw plantenextract en de elutie buffer werd geoptimaliseerd voor hoge mAb-terugwinning, product activiteit en de stabiliteit van de affiniteits hars. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere antilichamen met lineaire epitopes. De nieuwe harsen maken zachtere elutie-condities mogelijk dan proteïne A en kunnen ook de kosten van een initiële opname stap voor mAb-productie verminderen.

Expressie en zuivering van de affiniteit ligand
Het fusie-eiwit DFE werd uitgedrukt in transgene tabaksplanten geteeld in een kas. De opbrengst was ~ 120 mg · kg-1 blad massa met een gemiddelde biomassa van ~ 130 g per plant. De zuiverheid van DFE was < 5% van TSP in ruwe plantenextracten vóór blancheren, maar steeg tot ~ 40% na warmtebehandeling bij 70 °c gedurende 1,5 min, wat neerkwam op > 97% van de host-celeiwitten. De blancheren stap was eenvoudig te integreren in de oogst-en extractie routine (Figuur 1) en duurde minder dan 2 uur extra tijd, inclusief het instellen van het waterbad. Het totale herstel van DFE was 23,5 mg kg1 met een zuiverheid van > 90%. De stappen die verantwoordelijk zijn voor productverlies waren Blanching, diepte filtratie en IMAC, met specifieke verliezen van respectievelijk 40%, 27% en 45%. De diepte-filtercapaciteit was gemiddeld 135 ± 36 L m-2 (± SD, n = 3) en dus in het bovenste bereik van waarden gerapporteerd in de literatuur21. De DFE-opbrengst steeg met de plant leeftijd (Figuur 2).
Immobilisatie van de affiniteit ligand op de NHS-geactiveerde chromatografie kolommen
Tijdens de eerste koppelings tests constateerden we dat HEPES-buffer (pH 8,3) de koppelings efficiëntie verhoogde tot 89 ± 6% (± SD, n = 3) vergeleken met 78 ± 9% (± SD, n = 3) voor de bicarbonaat buffer die door de fabrikant wordt aanbevolen. Daarom werd HEPES gebruikt voor alle daaropvolgende koppelings experimenten. Er werd gekozen voor een DoE-aanpak om de koppelings efficiëntie van DFE te optimaliseren voor door NHS geactiveerde gecrosskoppelde agarose-hars. De absolute hoeveelheid DFE geïmmobiliseerd op de hars steeg met de massa van DFE geïnjecteerd in de kolom en plateaued op ~ 15 g · L-1 terwijl de koppelings opbrengst continu daalde naarmate er meer DFE werd geïnjecteerd (Figuur 2). De koppelings opbrengst was ook > 50% lager in een zure buffer, wat aangeeft dat voor elke ligand per geval moet worden voorzien in geschikte koppelings condities. Ideale omstandigheden in termen van koppelings rendement, absolute hoeveelheid geïmmobiliseerde DFE-en kolom kosten werden geïdentificeerd met behulp van de numerieke optimalisatie tool van de DoE-software. De meest wenselijke omstandigheden (pH 9,0 en 7,0 mg DFE per 1 mL kruisgebonden agarose hars) bevonden zich op een groot plateau en waren daarom robuust. De DFE-moleculen behouden hun rode fluorescentie, zelfs na de koppeling, en de kleurintensiteit kwam overeen met de totale hoeveelheid geïmmobiliseerde DFE (Figuur 2). Daarom kan kolom kleur worden gebruikt als een eenvoudige parameter voor kwaliteitscontrole om de koppelings efficiëntie en kolom kwaliteit te schatten. De fluorescentie bevestigde ook dat DFE fusie eiwit geassembleerd in de tetramerische staat van inheemse DsRed.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Figuur 2: optimalisering van DFE-immobilisatie naar door NHS geactiveerde gecrosskoppelde agarose-hars. A) LDS-paa gel met een Western Blot-overlay van homogenaat-en elutie monsters van onblancheerde en geblancheerde TRANSGENE DFE-plantenextracten. Oogst van planten werd uitgevoerd 38, 45 of 52 dagen na seeding. Westerse blots werden uitgevoerd met behulp van een anti-his6-antilichamen5. B) het totale bedrag aan gekoppelde DFE-affiniteit ligand in afhankelijkheid van de pH-koppeling en de totale massa van GEZUIVERDE DFE GEÏNJECTEERD op NHS-geactiveerde kruislings gekoppelde agarose-kolommen. Rode stippen geven de werkelijke experimenten aan die zijn uitgevoerd om het antwoord oppervlak model te bouwen. (C) DFE-affiniteits kolommen na de koppelingsprocedure. De getallen corresponderen met de koppelings condities die zijn gemarkeerd in paneel B. DPS = Days post seeding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Testen van 2F5-isolatie met behulp van de DFE-affiniteits hars
Het recombinant 2f5 antilichaam werd transitief geproduceerd in Nicotiana benthamiana planten geteeld in een Fytotron5. De inname van 2F5 uit het ruwe plantaardige extract werd getest met behulp van affiniteits kolommen in combinatie met ~ 7,0 mg gezuiverde DFE (stap 6). Elutie van proteïne A Resins gaat meestal gepaard met een zure buffer (pH ~ 3,3)13. Daarom evalueerden we in eerste instantie verschillende laagph-elutie buffers (pH 6.0 – 3,25) voor de DFE-kolommen. De elutie van 2F5 was succesvol bij pH-waarden onder 4,5 met het hoogste herstel van ~ 35% bij pH 3,25. Echter, lage-pH elutie geïnactiveerd zowel het antilichaam (zoals bevestigd door de SPR-spectrometrie) en de DFE ligand (zoals aangegeven door het verlies van de kleur en de onderste DBC, Figuur 3). De laatste werd verwacht gezien het feit dat inheemse dsred denatureert bij pH < 4.022,23. Om product-en ligand denaturatie te voorkomen, testten we magnesium chloride als alternatief elutie-middel omdat het eerder is gebruikt om MABS te Elueer van andere affiniteits harsen24. Een magnesium chloride-concentratie van 1,25 M was voldoende om 2F5 uit de DFE-affiniteits hars te eldelen met een terugwinning van 105 ± 11% (± SD, n = 3) en een zuiverheid van 97 ± 3% (± SD, n = 3). Deze voorstelling was vergelijkbaar met proteïne A Resins25,26. De constante van de evenwichts dissociatie (KD) van het DFE-gezuiverde 2F5-antilichaam en de synthetische ligand Fuzeon was 791 pM, terwijl die van een proteïne a-gezuiverde tegenhanger 763 pm5was. Bovendien werd geen substantieel kleurverlies waargenomen in de hars over een totaal van 25 BIND-en-elute cycli. De DBC van de DFE-affiniteits hars bij 10% 2F5 doorbraak daalde lineair in de loop van 25 cycli tot ~ 15% van de initiële waarde (Figuur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Figuur 3: testen van de isolatie van 2F5 uit geklaarde plantenextracten met behulp van de DFE-affiniteits harsen. A) DFE-affiniteits harsen na één elutie cyclus met buffers met verschillende pH-waarden in het bereik 4,0 – 3,0 en dezelfde harsen na een neutralisatie stap bij pH 6,0. B) DFE-affiniteits harsen na één en zes cycli van 2F5-zuivering met 1,25 m of 4,00 m magnesium chloride als eluent. C) chromatogrammen van frontale belastingsexperimenten (Doorbreek curven) om de cyclus afhankelijke dynamische bindingscapaciteit van DFE-hars met magnesium chloride als eluent te bepalen. De Doorbreek curven werden gemeten voor 4,0 M en 1,25 M magnesium chloride elutie buffers en verschillende cyclus nummers. D) cyclus afhankelijke dynamische bindingscapaciteit van DFE met 1,25 M magnesium chloride als eluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

In deze procedure, een dsred gebaseerde epitoop ligand is geïmmobiliseerd om een zeer selectieve affiniteit hars voor de inname van monoklonale antilichamen van ruwe plantenextracten of celkweek supernatants produceren, als een alternatief voor eiwit a.

Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Monoklonale antilichamen domineren de biofarmaceutische markt en worden meestal gezuiverd door Protein A chromatografie. De volgens hars is een belangrijke kostenfactor tijdens de productie die de prijs van antilichaamgebaseerde therapieën beïnvloedt. Hier beschrijven we een nieuwe affiniteit ligand op basis van de fluorescerende eiwit dat wordt gelezen als een drager voor de lineaire epitoop van HIV neutraliserende antilichaam 2F5.In het algemeen maakt onze methode het mogelijk om snel affiniteitschromatografie harsen te genereren die kunnen worden gebruikt voor het vangen van monoklonale antilichamen. We hebben dit vermogen aangetoond door het vastleggen van antilichaam 2F5 uit ruw plantenextract. We hebben de afvangomstandigheden en oplossingsbuffer geoptimaliseerd om de dynamische bindingscapaciteit en de herbruikbaarheid van de hars te verbeteren.Onze hars maakt over het algemeen lossere omstandigheden dan Eiwit A en heeft het potentieel om de zuiveringskosten van monoklonale antilichamen te verlagen. Bovendien kan de hars gemakkelijk worden aangepast aan andere antilichamen die zich binden aan lineaire epitopen. Om deze procedure te beginnen, pas de concentratie van de voorbereide affiniteit ligand oplossing, zodat is in het bereik van 5 tot 15 gram per liter, zoals gedefinieerd door het ontwerp van experimenten.Bewaar de oplossing op ijs totdat de koppelingsreactie klaar is. Vul vervolgens een twee milliliter spuit met de DFE-oplossing. En bereid een adapter voor om de spuiten op NHS-geactiveerde cross-link agarose kolommen met een bed volume van een milliliter monteren.Voor elke 10 kolommen die worden gebruikt voor koppeling, bereid 30 milliliter deactivering oplossing, 30 milliliter lage pH-oplossing, en een milliliter opslag oplossing. Bereid vervolgens 20 milliliter van een millimolar zoutzuur in een buis. En broed het minstens 20 minuten op ijs.Bereid een precisieschaal voor om de stroom door breuken te controleren voor alle stappen tijdens de koppelingsreactie. Open hierna een verzegelde door NHS geactiveerde kruisgekoppelde agarosekolom. Breng een druppel buffer aan op de adapterinlaat, om te voorkomen dat er lucht in de kolom komt.Monteer de spuitadapter op de kolominlaat. Was de kolom met zes milliliter ijskoud een millimolar zoutzuur, met een stroomsnelheid minder dan een milliliter per minuut. Met behulp van een twee milliliter spuit, onmiddellijk injecteren 1,5 milliliter van DFE oplossing met een stroomsnelheid minder dan een milliliter per minuut.En verzamel de stroom door de fractie op een precisieschaal voor latere analyse. Verzegel de kolom aan beide uiteinden en broed gedurende 15 tot 45 minuten, bij 22 graden Celsius. Vervolgens injecteren zes milliliter van de activeringsoplossing, gevolgd door zes milliliter lage pH-oplossing, met een stroomsnelheid van minder dan een milliliter per minuut, verwijder niet-covalent gebonden liganden uit de hars.Injecteer zes milliliter van de activeringsoplossing en ontcubeer de kolom gedurende 15 minuten. Injecteer hierna zes milliliter lage pH-oplossing in de kolom. Gevolgd door zes milliliter van de activeringsoplossing.Injecteer vervolgens nog eens zes milliliter lage pH-oplossing in de kolom. Injecteer twee milliliter opslagoplossing in de kolom en bewaar deze op vier graden Celsius. Bereid eerst 100 milliliter van het geklaarde plantenextract met 2F5, of het supernatant voor het voorkeurscelgebaseerde expressiesysteem, dat ook 2F5 bevat.Vervolgens de balansbuffer en de illusiebuffer met een hoge ijzeren X-sterkte voorbereiden, zoals beschreven in het tekstprotocol. Spoel het chromatografiesysteem door met de buffers. Monteer een DFE-affiniteitskolom op het chromatografiesysteem.En equilibrate met vijf CV van evenwichtsbuffer, bij een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Controleer de UV-absorptie op 280 nanometer. Laad vervolgens 80 milliliter van het geklaarde plantenextract, of het supernatant op de kolom met een stroomsnelheid van 5 milliliter per minuut.Om een contacttijd van twee minuten te garanderen. Verzamel de stroom door monsters in twee milliliter fracties of doorbraak curve reconstructie. Bewaar de stroom door monsters op vier graden Celsius, als onmiddellijke monsteranalyse niet mogelijk is.Na deze wasbeurt de kolom met 6CV van evenwichtsbuffer. Verzamel een monster aan het begin, midden en einde van de was. Verdun de MAB2F5 met vijf volumes van hoge ionische sterkte illusie buffer.Verzamel de DFE-fractie wanneer het UV-signaal op 280 nanometer is toegenomen tot vijf milli-absorptie-eenheden boven de basislijn. Optimaliseer de illusiebuffer voor elk epitoop-antilichaampaar, zoals beschreven in het tekstprotocol. Het fusie-eiwit DFE komt tot uiting in transgene tabaksplanten, geteeld in een kas.Het totale herstel van DFE is 23,5 milligram per kilogram. Met een zuiverheid van meer dan 90%De absolute hoeveelheid DFE geïmmobiliseerd op de hars neemt toe met de massa van DFE geïnjecteerd in de kolom, en plateaus op ongeveer 15 gram per liter, terwijl de koppeling opbrengst daalt voortdurend als meer DFE wordt geïnjecteerd. De DFE moleculen worden gezien om hun rode florescentie te behouden, zelfs na koppeling.De kleurintensiteit komt overeen met de totale hoeveelheid geïmmobiliseerde DFE. Daarom kolomkleur kan worden gebruikt als een eenvoudige parameter voor kwaliteitscontrole om de koppelingsefficiëntie en kolomkwaliteit te schatten. Het recombinant 2F5-antilichaam wordt van voorbijgaande aard geproduceerd in Nicotiana benthamiana-planten die in een fytotron worden geteeld.De vangst van 2F5 uit het ruwe plantenextract, wordt getest met behulp van affiniteitskolommen, gekoppeld aan ongeveer zeven milligram gezuiverde DFE. Een magnesiumchlorideconcentratie van 1,25 molair is voldoende om 2F5 uit de DFE-affiniteits hars te ontlasten met een terugwinning van bijna 100%en een zuiverheid van ongeveer 97%, vergelijkbaar met eiwit A-harsen. De DBC van de DFE affiniteit hars op 10%2F5 doorbraak, daalt lineair in de loop van de 25 cycli, tot ongeveer 15% van de oorspronkelijke waarde.We gebruikten een ontwerp van experimenten aanpak om de koppeling capaciteit van onze affiniteit ligand te optimaliseren. Deze voorwaarden kunnen worden afgestemd voor andere liganden in de toekomst. Onze methode maakt gebruik van fluorescerend eiwit om een subcarriereiwit te rijgen voor de productspecifieke ligand.Tegelijkertijd gewoon functies toevoegen als een visuele kwaliteitsindicator van de mobilisatieprocedure, het verstrekken van een onmiddellijke en intuïtieve feedback aan de exploitant.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Een Facile en efficiënte aanpak voor de productie van omkeerbare Disulfide Cross-linked micellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Een filtratie-gebaseerde methode om hoogwaardige kernen uit kruisgebonden skeletspier voor chromatine immunoprecipitatie te bereiden

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop geïmmobiliseerd Metal affiniteitchromatografie, reconstitutie en kwantitatieve analyse van een Polyhistidine gecodeerde Metalloenzyme voor de Undergraduate laboratorium

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Snelle bepaling van antilichaam-antigeen affiniteit door massa fotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Celvrije productie van proteoliposomen voor functionele analyse en antilichaamontwikkeling gericht op membraaneiwitten

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Ontwikkeling van een laterale flow immunochromatografische strip voor snelle en kwantitatieve detectie van kleine molecuulverbindingen

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...