Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Nous tenons à remercier Ibrahim Al Amedi pour avoir cultivé les plants de tabac transgéniques et le Dr Thomas Rademacher d'avoir fourni le vecteur d'expression du tabac. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Richard M. Twyman pour son aide éditoriale et Markus Sack pour les discussions fructueuses sur la structure de ligand d'affinité DFE. Ces travaux ont été financés en partie par les programmes internes Fraunhofer-Gesellschaft dans le cadre de la subvention no. Attirer 125-600164 et l'état de Rhénanie-du-Nord-Westphalie en vertu de la subvention Leistungszentrum no 423 "Production en réseau et adaptative". Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre de la subvention 331065168 du Research Training Group "Tumor-targeted Drug Delivery". GE Healthcare a soutenu la publication en libre accès de cet article.

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Applications de la résine d'affinité nouvelle
Nous avons montré que les résines de chromatographie d'affinité personnalisées pour la capture des mAbs peuvent être fabriquées en immobilisant un ligand contenant un épitope spécifique au mAb à l'agarose interconnectée activée par le NHS. Pour concevoir une telle résine, il était nécessaire de connaître la séquence de l'épitope et d'utiliser un épitope linéaire. Les résines résultantes sont avantageuses pour la capture des mAbs parce qu'elles pourraient potentiellement remplacer les étapes coûteuses de chromatographie d'affinité de protéine A. L'interaction entre 2F5 et DFE dans notre étude de cas a été négociée par la liaison d'épitope-paratope, ainsi notre ligand devrait être plus sélectif que la protéine A, qui se lie à la région de Fc de la plupart des IgGs murines et humains. Étant donné que des ligands individuels sont nécessaires pour chaque abor, notre méthode peut sembler d'abord adaptée principalement aux anticorps qui sont produits à très grande échelle. Cependant, en combinant notre approche avec l'expression rapide de protéine transitoire à base de plantes, de nouveaux ligands d'affinité peuvent être préparés en moins de 2 semaines27 avec un effort minimal28. Par conséquent, la méthode est également adaptée pour la purification à petite échelle mAb.
Production et améliorations potentielles du ligand d'affinité
Les plantes offrent une plate-forme de production rapide et sûre pour les ligands d'affinité5,29,30, comme la protéine de fusion DFE en vedette dans notre étude de cas. Blanchir le matériel végétal a considérablement réduit la quantité de protéines cellulaires hôtes en une seule étape et a été facilement intégré dans une routine de clarification standard. Cependant, la récupération du ligand a été faible dans la configuration actuelle, probablement en raison de sa stabilité thermique modérée et une certaine liaison non spécifique aux couches de filtre, comme indiqué pour d'autres produits31,32,33. L'ingénierie du transporteur pour augmenter sa stabilité thermique peut donc aider à améliorer le rendement ligand à l'avenir, comme décrit pour le vaccin antipaludique candidat CCT, l'enzyme antitumorale PpADI ou un mésophile -glucosidase34, 35,36. Il en va de même pour l'étape de filtration en profondeur, où l'ingénierie des protéines peut aider à réduire la liaison non spécifique au matériau filtrant37. Les coûts de production de DFE et de ligands similaires pourraient également être réduits en améliorant l'efficacité globale de la clarification à l'aide de flocculants ou d'additifs de filtre38,39.
Lorsque DsRed est utilisé comme transporteur, il forme un complexe tétratérique. Ceci est avantageux parce qu'il augmente le nombre d'épitopes par ligand, mais il peut également rendre le ligand plus susceptible de démontage ou de dénaturation pendant la chromatographie d'affinité. Une protéine porteuse monomérique telle que mCherry peut donc être préférable, parce qu'elle est stable à faible pH40, et l'inclusion de répétitions en tandem de l'épitopie augmenterait l'avidité du ligand et augmenterait ainsi la capacité de résine5, 26 Annonces , 41. Pour les protéines simples de porteur-épitope (c.-à-d., celles sans liaisons de disulfure ou modifications post-traductionnelles), les systèmes de production microbiennepeuvent peuvent réduire les coûts de fabrication et rendre les ligands plus compétitifs par rapport aux protéines A. Par exemple, la protéine fluorescente verte a été exprimée dans les cellules bactériennes avec un rendement de 1 gkg-1 biomasse, ce qui réduirait considérablement les coûts de production de ligand42 .
Indépendamment de l'hôte d'expression, un ligand purifié d'affinité a été exigé pendant l'accouplement pour réduire au minimum l'immobilisation des protéines de cellules d'hôte ou des composants de médias qui peuvent autrement réduire la sélectivité et la capacité de résine. L'inclusion d'une étiquette de poly-histidine pour la purification IMAC a augmenté la pureté à 90% en une seule étape, facilitant la production rapide et peu coûteuse de ligand5,43,44. Cependant, la position de l'étiquette de fusion est importante parce qu'elle a le potentiel d'entraver stérilement la liaison d'épitope ou d'induire le clivage de l'étiquette ou de l'épitope du porteur45,46.
Immobilisation du ligand d'affinité sur les colonnes de chromatographie activées par le NHS
L'immobilisation a été effectuée manuellement ou à l'aide d'un système de chromatographie. Les petits volumes tampons par colonne semblaient favoriser la manipulation manuelle (par exemple, en raison des volumes de déchets minimes). Toutefois, si des colonnes multiples/plus grandes sont nécessaires, le système de chromatographie facilite le couplage des conditions de couplage (p. ex., les débits réglementés) et est donc plus susceptible d'obtenir des résultats reproductibles en termes de DBC. Nos données suggèrent que le tampon de couplage et le pH ont un effet important sur l'efficacité du couplage et les coûts globaux de la colonne. Les facteurs de dépistage qui influencent la réaction d'accouplement et leur ajustement pour chaque protéine porteuse (ou même pour chaque fusion transporteur-ligand) pourraient donc améliorer l'efficacité du couplage et la performance de la résine, et nous recommandons cette approche.
Test de l'isolement 2F5 à l'aide de la résine d'affinité DFE
Le rendement et la pureté du produit sont des aspects importants de la performance de la résine, et dans le cas de DFE, nous avons obtenu un rendement de 105 à 11 % (SD, n-3) et une pureté de 97 à 3 % (SD, n-3), ce qui est comparable à la performance des résines de référence de protéines A25. ,26. Un autre indicateur de performance clé pour les résines en général (et en particulier pour celles basées sur les ligands d'affinité) est le DBC à 10% percée du produit, parce que ce paramètre affecte la quantité de résine nécessaire pour un processus spécifique et donc les coûts. Pour le ligand DFE, le DBC initial était de 4 g La résine L-1, qui est de 13 % de la valeur correspondante de la protéine A dans des conditions similaires (seulement 2 min de temps de contact)25,47, mais environ 15 fois plus élevée par rapport à d'autres résines d'affinité personnalisées telles que le ligand anti-FSH-immunoaffinity utilisant le même temps de résidence de 2 min48. Le DBC de DFE a diminué à 15% de la valeur de départ après 25 cycles de liaison et d'elute, tandis que plus de 50 cycles sont nécessaires pour la même perte de DBC dans les résines commerciales de protéine A49. Cependant, il est important de noter que notre transporteur n'a pas encore été optimisé dans la même mesure que la protéine A, qui a fait l'objet d'une enquête approfondie et a été améliorée au cours des quatre dernières décennies8.
Jusqu'à présent, nous avons amélioré la stabilité de la résine et la récupération du produit en passant d'un tampon d'élution à faible pH à une forte concentration de chlorure de magnésium (Figure 3), comme recommandé dans les études antérieures13. La couleur rouge caractéristique du ligand d'affinité ne s'est pas fondue sensiblement pendant les 25 cycles de liaison-et-elute, ainsi nous spéculons que les protéases endogènes de plante dans les extraits clarifiés de plante31 ont pu tronqué et ainsi inactivé l'épitope de le ligand. Par conséquent, la conception de liaisons résistantes à la protéase pour connecter le transporteur et l'épitographe peut aider à maintenir le DBC initial sur un nombre prolongé de cycles. Compte tenu de l'expression rapide et simple et la purification de la ligand DFE, son couplage simple à des résines de chromatographie commerciale, et son excellent rendement du produit et la pureté, nous croyons que notre méthode offre une alternative appropriée à la protéine A pour le la purification des mAbs et des dérivés d'anticorps qui ne se lient pas à la protéine A, particulièrement si des améliorations au porteur et au lien peuvent améliorer la stabilité de DBC et de ligand. Cette hypothèse a été soutenue par la petite différence dans la constante de dissociation de DFE-purifié et protéine A-purifié 2F5 anticorps5, indiquant que notre nouvelle ligand d'affinité permet la récupération des mAbs de haute qualité.
Avantages et limites actuelles de la méthode
La production du ligand d'affinité comme fusion génétique avec une protéine porteuse augmente la solubilité dans les tampons aqueux et donc la compatibilité avec les conditions typiques de couplage ligand. En revanche, les peptides vides dérivés de la synthèse de peptide de phase solide peuvent avoir la solubilité limitée dans ces conditions dues à leur séquence50, qui ne peut pas être changée parce qu'elle est dictée par la séquence d'acide aminé de l'épitope identifiée par le mAb à être purifiés. D'autres ont donc utilisé une synthèse sur la résine des ligands peptides51. La capacité de liaison statique de la résine résultante était élevée (80 g L-1), mais le processus de préparation de la résine est long, une capacité de liaison dynamique n'a pas été signalée et la pureté et la récupération obtenues étaient inférieures à celles de notre approche. Un autre avantage d'un ligand de protéine de fusion à l'échelle de laboratoire est que le ligand et les variantes de celui-ci peuvent être rapidement produits, purifiés et éprouvés avec l'effort minimal dans un système d'expression à haute durée facile à utiliser52.
Les deux limites actuelles de la méthode présentée ici sont la faible capacité de liaison dynamique de 3 g L-1 et sa réduction de 90% au cours de 25 cycles de liaison et d'elute5. Ces limitations peuvent être corrigées à l'avenir en appliquant des conditions de chargement moins strictes et en remplaçant le transporteur DsRed actuel par une variante modifiée et plus stable respectivement. Par exemple, doubler le temps de contact actuel de 2 à 4 minutes a le potentiel de doubler la capacité de liaison dynamique comme cela a été montré pour certaines résines de protéine A26.
dépannage
Le tableau suivant met en évidence les problèmes potentiels qui peuvent être rencontrés au cours de ce protocole et fournit des conseils sur la façon de les résoudre (tableau 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tableau 1 : Problèmes potentiels qui peuvent être rencontrés et solutions possibles.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Étape du protocole</td>
			<td>problème</td>
			<td>Couse</td>
			<td>réparer</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Les plantes ne poussent pas</td>
			<td>Conditions de croissance compromises</td>
			<td>Vérifier le pH et la conductivité de l'engrais</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vérifier la température et les conditions de lumière</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 et 3</td>
			<td>De grandes quantités de protéines cellulaires hôtes sont présentes après extraction</td>
			<td>Précipitations incomplètes</td>
			<td>Vérifier la température pendant le blanchiment</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vérifier l'agitation dans le bain blanchissant</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 et 3</td>
			<td>Aucun produit trouvé dans l'extrait de plante</td>
			<td>Température de blanchiment trop élevée</td>
			<td>Vérifier la température et le pH pendant le blanchiment</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH dans le tampon de blanchiment trop bas</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>De grandes parties de tige ou de feuille restent après extraction</td>
			<td>Mélange incomplet dans le mélangeur</td>
			<td>Assurez-vous que le matériel végétal ne forme pas de prise dans le mélangeur</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Augmentation rapide de la pression pendant la filtration de profondeur</td>
			<td>Sélection et/ou orientation incorrectes du filtre</td>
			<td>Vérifier le type de filtre et l'orientation</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Petite protéine de fusion pendant l'élution / beaucoup de protéine de fusion dans le flux à travers</td>
			<td>La résine IMAC n'a pas été accusée d'ions métalliques</td>
			<td>Vérifiez si la résine IMAC a été correctement chargée d'ions</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>La protéine de fusion a perdu l'étiquette d'affinité</td>
			<td>Évitez la lumière du soleil intense et les températures élevées pendant la culture des plantes</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Protéine de fusion perdue pendant la concentration</td>
			<td>Protéine de fusion liée à la membrane</td>
			<td>Vérifier le type de membrane</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Assurez-vous que le facteur de concentration n'était pas trop élevé</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Faible rendement d'accouplement</td>
			<td>Séquence incorrecte de l'ajout de réactif d'accouplement</td>
			<td>Vérifier les étiquettes des réactifs et la séquence d'ajout</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Préparation incorrecte des colonnes avant le couplage</td>
			<td>Vérifier les conditions de la colonne preparaiton</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 et 6</td>
			<td>Faible rendement mAb</td>
			<td>Faible expression de mAb dans la biomasse végétale</td>
			<td>Expression de mAb d'essai dans la biomasse</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Faible densité de ligands</td>
			<td>Vérifier la pureté de la préparation des protéines de fusion</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Concentrations de protéines très faibles/élevées dans l'état d'œil de Bradford</td>
			<td>Formation de bulle pendant le tuyauterie</td>
			<td>Vérifiez les bulles dans le 96-well palte</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Faible concentration de mAb pendant la mesure SPR</td>
			<td>Protéines compromises Une puce</td>
			<td>Comparer avec les résultats du mAb standard avec concentration connue</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilution incorrecte de l'échantillon</td>
			<td>Vérifier le taux de dilution et le tampon</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Dépannage.

Les produits biopharmaceutiques sont importants pour le traitement d'un large éventail de maladies dans presque toutes les branches de la médecine1. Les anticorps monoclonaux (mAbs) dominent le marché biopharmaceutique, avec des ventes mondiales qui devraient atteindre près de 110 milliards d'euros en 20202. La plate-forme d'expression favorisée pour les mAbs sont les lignées cellulaires d'ovaire sain de hamster chinois, qui produisent typiquement des titres élevés de mAb de jusqu'à 10 g-L-1 dans le supernatant de culture3,4. Cependant, la production de mAbs dans les cultures cellulaires de mammifères est coûteuse en raison du coût élevé du milieu et de la nécessité d'une fermentation stérile5. Les plates-formes d'expression alternatives telles que les usines offrent potentiellement une approche plus rapide, plus simple, moins chère et plus évolutive pour la fabrication industrielle6,7.
En plus des coûts associés aux cultures cellulaires de mammifères, l'utilisation répandue de la chromatographie d'affinité de protéine A pour la capture de produit est un moteur important de coût pour la production industrielle des mAbs. La protéine A se trouve naturellement à la surface des cellules de Staphylococcus aureus et elle se lie à la région cristallable fragment (Fc) de certains anticorps murins et humains, agissant ainsi comme un mécanisme de défense pour échapper au système immunitaire humoristique8. La protéine A est devenue l'étalon-or de l'industrie pour la capture des mAbs des supernatants de culture cellulaire et est également largement utilisée par la communauté de recherche parce qu'elle est très sélective, atteignant généralement des puretés de mAb de 95% en une seule étape8. Sans surprise, les ventes de protéines A au cours des deux dernières décennies ont étroitement reflété les ventes de mAbs8. Selon l'échelle de production, les coûts de la protéine A peuvent correspondre à plus de 25 % des coûts totaux du processus et affecter ainsi le prix du marché des mAbs thérapeutiques, qui peuvent atteindre 2 000 g-15,9. Par conséquent, les résines de chromatographie alternatives avec une performance de purification similaire ont le potentiel de réduire considérablement les coûts de production, rendant les thérapies à base d'anticorps accessibles à un plus grand nombre de patients10,11 ,12. De telles alternatives peuvent également contourner les inconvénients de la chromatographie de protéine A, y compris les conditions dures d'élution à bas pH (typiquement 'lt;3.5) qui peuvent potentiellement causer des mAbs pour subir des changements conformationnels qui favorisent l'agrégation13 . Fait important, la protéine A n'est sélective que pour la région Fc de certaines sous-classes IgG, de sorte que les molécules non fonctionnelles avec des domaines de liaison tronqués peuvent co-purifier avec le produit intact5, tandis que les dérivés mAb tels que les fragments variables à chaîne unique ne se lient pas du tout à la protéine A.
Ici, nous décrivons une résine de chromatographie alternative d'affinité pour la capture du mAb 2F5 HIV-neutralisant utilisant son épitope linéaire ELDKWA (code d'acide aminé d'une lettre)5,14. Nous avons génétiquement fusionné l'épitope 2F5 au terminus C de la protéine fluorescente DsRed, qui a fonctionné comme une molécule porteuse et reporter, et produit la protéine résultante DsRed-2F5-Epitope (DFE) dans le tabac transgénique ( Nicotiana tabacum) plantes. DFE a été purifié par la chromatographie immobilisée d'affinité métal-ion immobilisée d'une seule étape (IMAC). L'immobilisation de la ligand d'affinité d'AFE purifiée sur une résine d'agarose transversale a été réalisée par couplage chimique utilisant des colonnes d'agarose croisées activées par N-hydroxysuccinimide (NHS). Des conceptions expérimentales statistiques ont ensuite été utilisées pour optimiser la procédure d'immobilisation et l'efficacité du couplage15. La stratégie de purification du mAb 2F5 a été évaluée en termes de pureté des anticorps, de rendement et de stabilité du ligand. Contrairement à la protéine A, qui lie la région de Fc, DFE lié à la région de complémentarité-déterminante de 2F5, assurant la purification des molécules avec un paratope intact. Notre concept peut facilement être adapté à n'importe quel mAb avec un épitope linéaire ou à d'autres ligands d'affinité à base de peptides qui peuvent être facilement identifiés par les études de microarray16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma de flux de processus pour la préparation de résines d'affinité épitope qui peuvent être utilisées pour la capture de mAbs à partir d'extraits de plantes brutes ou de supernatants de culture cellulaire. (A) Le ligand d'affinité DFE a été exprimé dans les usines transgéniques de tabac. Une étape de précipitation de chaleur (B) a été incluse avant que les feuilles récoltées soient homogénéisées (C). (D) L'extrait brut de l'usine a été clarifié par filtration de sac, filtration de profondeur et filtration stérile de 0,2 m. (E) DFE a ensuite été purifié par l'IMAC. (F, G) Le ligand d'affinité d'EdFE purifié a été immobilisé sur les colonnes d'agarose croisées activées par EDC/NHS. (H) Les cultures bactériennes portant l'anticorps anticodage T-ADN 2F5 ont été utilisées pour l'expression transitoire dans les plantes De. benthamiana (I) cultivées dans un phytotron. (J) Les feuilles de N. benthamiana ont été récoltées et traitées comme décrit dans D. (K) mAb 2F5 a été purifiée à partir de l'extrait clarifié à l'aide des colonnes d'affinité DFE (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

La purification des anticorps monoclonaux (mAbs) est généralement réalisée par la chromatographie d'affinité de protéine A, qui peut expliquer jusqu'à 25% des coûts globaux de processus. D'autres étapes de capture rentables sont donc précieuses pour la fabrication à l'échelle industrielle, où de grandes quantités d'un seul maquillage sont produites. Nous présentons ici une méthode pour l'immobilisation d'un ligand épitope à base de DsRed à une résine d'agarose transversale permettant la capture sélective de l'anticorps neutralisant le VIH 2F5 à partir d'extraits de plantes brutes sans utiliser de protéines A. L'épitope linéaire ELDKWA a d'abord été génétiquement fusionné à la protéine fluorescente DsRed et la protéine de fusion a été exprimée dans le tabac transgénique (Nicotiana tabacum) plantes avant la purification par la chromatographie d'affinité métal-ion immobilisée. En outre, une méthode basée sur l'agarose interconnectée activée a été optimisée pour une densité de ligand élevé, un couplage efficace et des coûts faibles. Le pH et la composition tampon et la concentration soluble de ligand étaient les paramètres les plus importants pendant la procédure d'accouplement, qui a été améliorée en utilisant une approche de conception d'expériences. La résine d'affinité résultante a été testée pour sa capacité à lier sélectivement le mAb cible dans un extrait de plante brute et le tampon d'élution a été optimisé pour la récupération élevée de mAb, l'activité du produit et la stabilité de résine d'affinité. La méthode peut facilement être adaptée à d'autres anticorps avec des épitopes linéaires. Les nouvelles résines permettent des conditions d'élution plus douces que les protéines A et pourraient également réduire les coûts d'une première étape de capture pour la production de mAb.

Expression et purification du ligand d'affinité
La protéine de fusion DFE a été exprimée dans les plants de tabac transgéniques cultivés dans une serre. Le rendement était de 120 mg-kg-1 masse de feuilles avec une biomasse moyenne de 130 g par plante. La pureté de DFE était de 5 % du TSP dans les extraits de plantes brutes avant le blanchiment, mais elle est passée à 40 % après traitement thermique à 70 oC pendant 1,5 min, ce qui a précipité les protéines des cellules hôtes. L'étape de blanchiment a été facilement intégrée dans la routine de récolte et d'extraction (figure 1) et a pris moins de 2 h de temps supplémentaire, y compris la mise en place du bain d'eau. La récupération globale de DFE a été de 23,5 mg kg1 avec une pureté de 'gt;90%. Les étapes responsables de la perte de produit ont été blanchissant, filtration de profondeur et IMAC, avec des pertes spécifiques de 40%, 27% et 45%, respectivement. La capacité de filtre de profondeur était en moyenne de 135 à 36 L m-2 (SD, n-3) et donc dans la fourchette supérieure des valeurs rapportées dans la littérature21. Le rendement du DFE a augmenté avec l'âge des plantes (figure 2).
Immobilisation du ligand d'affinité sur les colonnes de chromatographie activées par le NHS
Au cours des premiers tests d'accouplement, nous avons constaté que le tampon HEPES (pH 8.3) a augmenté l'efficacité du couplage à 89 à 6 % (SD, n-3) comparativement à 78 à 9 % (SD, n-3) pour le tampon de bicarbonate recommandé par le fabricant. Par conséquent, HEPES a été utilisé pour toutes les expériences de couplage ultérieures. Une approche DoE a été choisie pour optimiser l'efficacité de couplage de DFE à la résine d'agarose interconnectée activée par le NHS. La quantité absolue de DFE immobilisée sur la résine a augmenté avec la masse de DFE injectée dans la colonne et plafonnée à 15 g L-1 alors que le rendement du couplage a diminué continuellement à mesure que davantage de DFE était injecté (figure 2). Le rendement de couplage a également été plus faible dans un tampon acide, ce qui indique la nécessité de filtrer les conditions d'accouplement appropriées pour chaque ligand au cas par cas. Des conditions idéales en termes de rendement d'accouplement, de quantité absolue de DFE immobilisé et de coûts de colonne ont été identifiées à l'aide de l'outil d'optimisation numérique du logiciel DoE. Les conditions les plus souhaitables (pH 9,0 et 7,0 mg de DFE par 1 ml de résine d'agarose transversale) étaient situées sur un grand plateau et étaient donc robustes. Les molécules DFE ont conservé leur fluorescence rouge même après le couplage, et l'intensité des couleurs correspondait à la quantité totale de DFE immobilisé (figure2). Par conséquent, la couleur de colonne peut être employée comme paramètre simple de contrôle de qualité pour estimer l'efficacité et la qualité de colonne d'accouplement. La fluorescence a également confirmé que la protéine de fusion DFE assemblé dans l'état tétramérique de DsRed indigène.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Figure 2 : Optimisation de l'immobilisation du DFE à la résine d'agarose interconnectée activée par le NHS. (A) Gel LDS-PAA avec superpose de taches occidentales d'échantillons d'homogénéisme et d'élution provenant d'extraits transgéniques non blanchis et blanchis de plantes DFE. La récolte des plantes a été effectuée 38, 45 ou 52 jours après l'ensemencement. Des taches occidentales ont été exécutées utilisant un anti-His6-anticorps5. (B) Quantité totale de ligand d'affinité Couplé d'Affinité de DFE dans la dépendance si le pH de couplage et la masse globale de DFE purifié injecté sur les colonnes d'agarose croisées ACTIVÉes par LE NHS. Les points rouges indiquent les expériences réelles effectuées pour construire le modèle de surface de réponse. (C) Colonnes d'affinité DFE après la procédure de couplage. Les nombres correspondent aux conditions d'accouplement mises en évidence dans le panneau B. dps - jours après l'ensemencement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Test de l'isolement 2F5 à l'aide de la résine d'affinité DFE
L'anticorps recombinant 2F5 a été produit avec transitoire dans les plantes Detritiennes de Nicotiana cultivées dans un phytotron5. La capture de 2F5 de l'extrait brut de la plante a été testée à l'aide de colonnes d'affinité couplées à un DFE purifié de 7,0 mg (étape 6). L'élution des résines protéinées A implique généralement un tampon acide (pH 3,3)13. Par conséquent, nous avons initialement évalué différents tampons d'élution à faible pH (pH 6.0-3.25) pour les colonnes DFE. L'élution de 2F5 a été couronnée de succès à des valeurs de pH inférieures à 4,5 avec la plus forte reprise de 35% à 3,25 pH. Cependant, l'élution à faible pH a inactivé à la fois l'anticorps (comme confirmé par la spectrométrie SPR) et le ligand DFE (comme indiqué par la perte de couleur et le DBC inférieur, Figure 3). Ce dernier était prévu étant donné que les dénatures natifs DsRed à pH 'lt;4.022,23. Pour éviter la dénaturation de produit et de ligand, nous avons examiné le chlorure de magnésium comme agent alternatif d'élution parce qu'il a précédemment été employé pour elute mAbs d'autres résines d'affinité24. Une concentration de chlorure de magnésium de 1,25 M était suffisante pour éliuter 2F5 de la résine d'affinité DFE avec une récupération de 105 à 11 % (SD, n-3) et une pureté de 97 à 3 % (SD, n-3). Cette performance était comparable à la protéine A résines25,26. La dissociation d'équilibre constante (KD) de l'anticorps DFE purifié 2F5 et le ligand synthétique Fuzeon était de 791 pM alors que celle d'une protéine A purifiée homologue était 763 pM5. En outre, aucune perte de couleur substantielle n'a été observée dans la résine sur un total de 25 cycles de liaison et d'elute. Le DBC de la résine d'affinité DFE à 10% 2F5 percée a diminué linéairement au cours de 25 cycles à 15% de la valeur initiale (Figure 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Figure 3 : Tester l'isolement de 2F5 à partir d'extraits de plantes clarifiés à l'aide des résines d'affinité DFE. (A) Résines d'affinité DFE après un cycle d'élution utilisant des tampons avec différentes valeurs de pH dans la plage 4.0-3.0 et les mêmes résines après une étape de neutralisation au pH 6.0. (B) Résines d'affinité DFE après un et six cycles de purification 2F5 en utilisant 1,25 M ou 4,00 M de chlorure de magnésium comme élude. (C) Chromatogrammes d'expériences de chargement frontal (courbes de rupture) pour déterminer la capacité de liaison dynamique dépendante du cycle de la résine DFE utilisant le chlorure de magnésium comme élude. Les courbes de percée ont été mesurées pour 4,0 M et 1,25 M de tampons d'élution de chlorure de magnésium et divers nombres de cycle. (D) Capacité de liaison dynamique dépendante du cycle de DFE en utilisant 1,25 M de chlorure de magnésium comme élu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Dans cette procédure, un ligand épitope à base de DsRed est immobilisé pour produire une résine d'affinité très sélective pour la capture d'anticorps monoclonaux à partir d'extraits de plantes brutes ou de supernatants de culture cellulaire, comme alternative à la protéine A.

Agarose interconnectée activée pour le développement rapide des résines de chromatographie d'affinité - Capture d'anticorps comme étude de cas

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Les anticorps monoclonaux dominent le marché biopharmaceutique et sont généralement purifiés par la chromatographie des protéines A. La résine selon est un facteur de coût majeur pendant la production affectant le prix des thérapeutiques à base d’anticorps. Nous décrivons ici un nouveau ligand d’affinité basé sur la protéine fluorescente qui est lue comme porteur de l’épitope linéaire de l’anticorps neutralisant le VIH 2F5.En général, notre méthode permet la génération rapide de résines chromatographie d’affinité qui peuvent être utilisées pour la capture d’anticorps monoclonaux. Nous avons démontré cette capacité en capturant l’anticorps 2F5 à partir d’extraits de plantes brutes. Nous avons optimisé les conditions de capture et le tampon de solution afin d’améliorer la capacité de liaison dynamique et la réutilisation de la résine.Notre résine permet des conditions généralement plus lâches que la protéine A et a le potentiel de réduire les coûts de purification des anticorps monoclonaux. En outre, la résine peut facilement être adaptée à d’autres anticorps qui se lient aux épitopes linéaires. Pour commencer cette procédure, ajuster la concentration de la solution ligand affinité préparée de sorte que c’est dans la gamme de 5 à 15 grammes par litre tel que défini par la conception des expériences.Conservez la solution sur la glace jusqu’à ce que la réaction de couplage soit prête. Ensuite, remplissez une seringue de deux millilitres avec la solution DFE. Et préparez un adaptateur pour monter les seringues sur les colonnes d’agarose à liaison croisée activées par le NHS avec un volume de lit d’un millilitre.Pour chaque 10 colonnes utilisées pour le couplage, préparez 30 millilitres de solution de désactivation, 30 millilitres de solution à faible pH et une millilitre de solution de stockage. Ensuite, préparez 20 millilitres d’acide chlorhydrique millimolaire dans un tube. Et l’incuber sur la glace pendant au moins 20 minutes.Préparez une échelle de précision pour surveiller le flux à travers les fractions pour toutes les étapes pendant la réaction de couplage. Après cela, ouvrez une colonne d’agarose croisée scellée activée par le NHS. Appliquez une goutte de tampon sur l’entrée de l’adaptateur, pour empêcher l’air d’entrer dans la colonne.Montez l’adaptateur de seringue à l’entrée de colonne. Lavez la colonne avec six millilitres d’acide chlorhydrique froid et millimolaire, à un débit inférieur à un millilitre par minute. À l’aide d’une seringue de deux millilitres, injectez immédiatement 1,5 millilitres de solution DFE à un débit inférieur à un millilitre par minute.Et recueillir le flux à travers la fraction sur une échelle de précision pour une analyse ultérieure. Sceller la colonne aux deux extrémités et incuber pendant 15 à 45 minutes, à 22 degrés Celsius. Injectez ensuite six millilitres de la solution d’activation, suivis de six millilitres de solution de pH faible, à un débit inférieur à un millilitre par minute, retirez les ligands non liés de façon covalente de la résine.Injectez six millilitres de la solution d’activation et incubez la colonne pendant 15 minutes. Après cela, injectez six millilitres de solution à faible pH dans la colonne. Suivi de six millilitres de la solution d’activation.Injectez ensuite six millilitres de solution à faible pH dans la colonne. Injectez deux millilitres de solution de stockage dans la colonne et rangez-la à quatre degrés Celsius. Préparez d’abord 100 millilitres de l’extrait végétal clarifié contenant 2F5, ou du supernatant pour le système d’expression cellulaire préféré, qui contient également 2F5.Ensuite, préparez le tampon d’équilibrage, et le tampon d’illusion de force X de fer élevé, tel que décrit dans le protocole de texte. Rincer le système de chromatographie avec les tampons. Montez une colonne d’affinité DFE sur le système de chromatographie.Et équilibrer avec cinq CV de tampon d’équilibrage, à un débit d’un millilitre par minute. Surveillez l’absorption uv à 280 nanomètres. Chargez ensuite 80 millilitres de l’extrait végétal clarifié ou du supernatant sur la colonne à un débit de 5 millilitres par minute.Pour garantir un temps de contact de deux minutes. Recueillir le flux à travers des échantillons en deux fractions millilitres ou la reconstruction de la courbe de percée. Stockez le débit à travers les échantillons à quatre degrés Celsius, si l’analyse immédiate de l’échantillon n’est pas possible.Après cela laver la colonne avec 6CV de tampon d’équilibrage. Recueillir un échantillon au début, au milieu et à la fin du lavage. Diluer le MAB2F5 avec cinq volumes de tampon d’illusion de résistance ionique élevée.Recueillir la fraction DFE lorsque le signal UV à 280 nanomètres a augmenté à cinq milli unités d’absorption au-dessus de la ligne de base. Optimisez le tampon d’illusion pour chaque paire epitope-anticorps, tel que décrit dans le protocole texte. La protéine de fusion DFE est exprimée dans les plants de tabac transgéniques, cultivés dans une serre.La récupération globale du DFE est de 23,5 milligrammes par kilogramme. Avec une pureté de plus de 90%La quantité absolue de DFE immobilisée sur la résine augmente avec la masse de DFE injectée dans la colonne, et plafonne à environ 15 grammes par litre, tandis que le rendement de couplage diminue continuellement à mesure que plus de DFE est injecté. Les molécules DFE sont considérées comme conservant leur florescence rouge, même après couplage.L’intensité de la couleur correspond à la quantité totale de DFE immobilisé. Par conséquent, la couleur de la colonne peut être utilisée comme un paramètre simple de contrôle de la qualité pour estimer l’efficacité du couplage, et la qualité de la colonne. L’anticorps recombinant 2F5 est produit de façon transitoire dans les plantes nicotiana benthamiana cultivées dans un phytotron.La capture de 2F5 à partir de l’extrait brut de la plante, est testée à l’aide de colonnes d’affinité, couplées à environ sept milligrammes de DFE purifié. Une concentration de chlorure de magnésium de 1,25 molaire est suffisante pour exténuer 2F5 de la résine d’affinité DFE avec une récupération proche de 100% et une pureté d’environ 97%, ce qui est comparable aux résines de protéine A. Le DBC de la résine d’affinité DFE à 10%2F5 percée, diminue linéairement au cours des 25 cycles, à environ 15% de la valeur initiale.Nous avons utilisé une approche de conception d’expériences pour optimiser la capacité de couplage de notre ligand affinité. Ces conditions peuvent être affinées pour d’autres ligands à l’avenir. Notre méthode utilise des protéines florescentes pour enfiler une protéine sous-transporteur pour le ligand spécifique au produit.Dans le même temps il suffit d’ajouter des fonctions comme un indicateur de qualité visuelle de la procédure de mobilisation, fournissant une rétroaction immédiate et intuitive à l’opérateur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Recherche

Biochimie

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Une approche efficace et Facile pour la production de micelles réversible Disulfure réticulés

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilisation de Scaffold Liposomes à Reconstituer interactions protéine-protéine Lipid-proximal<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Détermination de l&#39;anticorps-antigène à haute affinité de liaison Kinetics En utilisant quatre plates-formes biocapteurs

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Une méthode à base de filtration pour la préparation de noyaux de haute qualité à partir d&#39;un muscle squelettique réticulé pour l&#39;immunoprécipitation de la chromatine

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobilisé par chromatographie d’affinité métallique, Reconstitution et analyse d’un Polyhistidine tag métalloenzyme pour le laboratoire d’études de premier cycle

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Chromatographie liquide non ciblée-Analyse métabolomique basée sur la spectrométrie de masse du grain de blé

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Détermination rapide de l’affinité anticorps-antigène par photométrie de masse

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Production acellulaire de protéoliposomes pour l’analyse fonctionnelle et le développement d’anticorps ciblant les protéines membranaires

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Développement d’une bande immunochromatographique à flux latéral pour la détection rapide et quantitative de composés de petites molécules

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...