Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Wir möchten Ibrahim Al Amedi für den Anbau der transgenen Tabakpflanzen und Dr. Thomas Rademacher für die Bereitstellung des Tabakexpressionsvektors danken. Die Autoren danken Dr. Richard M. Twyman für die redaktionelle Unterstützung und Markus Sack für die fruchtbaren Diskussionen über die DFE-Affinitätsliganandstruktur. Diese Arbeit wurde zum Teil von der Fraunhofer-Gesellschaft Interne Programme unter Grant No. Attraktion 125-600164 und das Land Nordrhein-Westfalen unter dem Leistungszentrum Zuschuss Nr. 423 "Vernetzte, adaptive Produktion". Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des Forschungstrainings "Tumor-targeted Drug Delivery" gefördert. GE healthcare unterstützte die Open-Access-Veröffentlichung dieses Artikels.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Anwendungen des neuartigen Affinitätsharzes
Wir haben gezeigt, dass kundenspezifische Affinitätschromatographieharze für die Aufnahme von mAbs hergestellt werden können, indem ein Liganden, der ein mAb-spezifisches Epitop enthält, zu NHS-aktivierter vernetzter Agarose immobilisiert wird. Um ein solches Harz zu entwerfen, war es notwendig, die Epitopsequenz zu kennen und ein lineares Epitop zu verwenden. Die resultierenden Harze sind vorteilhaft für die Erfassung von mAbs, da sie möglicherweise teure Protein-A-Affinitätschromatographieschritte ersetzen könnten. Die Wechselwirkung zwischen 2F5 und DFE in unserer Fallstudie wurde durch Epitop-Paratopbindung vermittelt, daher sollte unser Liganden selektiver sein als Protein A, das an die Fc-Region der meisten murinen und menschlichen IgGs bindet. Da für jeden mAb individuelle Liganden benötigt werden, kann unsere Methode zunächst vor allem für Antikörper geeignet sein, die in sehr großem Maßstab produziert werden. Durch die Kombination unseres Ansatzes mit einer schnellen pflanzlichen transienten Proteinexpression können jedoch neue Affinitätsliganden in weniger als 2 Wochen27 mit minimalem Aufwand28zubereitet werden. Daher eignet sich das Verfahren auch für die kleinräumige mAb-Reinigung.
Produktion und mögliche Verbesserungen der Affinität Ligand
Pflanzen bieten eine schnelle und sichere Produktionsplattform für Affinitätsliganden5,29,30, wie das DFE-Fusionsprotein, das in unserer Fallstudie vorgestellt wird. Das Blanchieren des Pflanzenmaterials reduzierte die Menge an Wirtszellproteinen in einem einzigen Schritt erheblich und wurde problemlos in eine Standard-Klärungsroutine integriert. Allerdings war die Rückgewinnung des Liganden im aktuellen Aufbau gering, wahrscheinlich aufgrund seiner moderaten thermischen Stabilität und einiger unspezifischer Bindung an die Filterschichten, wie für andere Produkte berichtet31,32,33. Die Entwicklung des Trägers zur Erhöhung seiner thermischen Stabilität kann daher dazu beitragen, die Ligandenausbeute in Zukunft zu verbessern, wie für den Malaria-Impfstoff-Kandidaten CCT, das Antitumor-Enzym PpADI oder ein mesophiles 35,36. Dasselbe gilt für den Tiefenfiltrationsschritt, bei dem die Proteintechnik dazu beitragen kann, die unspezifische Bindung an das Filtermaterial37zu reduzieren. Die Produktionskosten für DFE und ähnliche Liganden könnten auch durch die Verbesserung der Gesamteffizienz der Klärung mit Flockungsmitteln oder Filterzusätzen38,39reduziert werden.
Wenn DsRed als Träger verwendet wird, bildet es einen tetramerischen Komplex. Dies ist vorteilhaft, da es die Anzahl der Epitope pro Liganden erhöht, aber es kann auch den Liganden anfälliger für Demontage oder Denaturierung während der Affinitätschromatographie machen. Ein monomeres Trägerprotein wie mCherry kann daher vorzuziehen sein, da es bei niedrigem pH-Wert40stabil ist und die Einbeziehung von Tandemwiederholungen des Epitops die Avidität des Liganden erhöhen und damit die Harzkapazität erhöhen würde5, 26 , 41. Bei einfachen Träger-Epitop-Proteinen (d. h. solchen ohne Disulfidbindungen oder posttranslationalen Modifikationen) können mikrobielle Produktionssysteme die Herstellungskosten senken und die Liganden mit Protein A wettbewerbsfähiger machen. Zum Beispiel wurde grünes fluoreszierendes Protein in Bakterienzellen mit einer Ausbeute von 1 g-kg-1 Biomasse exprimiert, was die Ligandenproduktionskosten deutlich senken würde42.
Unabhängig vom Expressionswirt war während der Kopplung eine gereinigte Affinitätsligadeand erforderlich, um die Immobilisierung von Wirtszellproteinen oder Medienkomponenten zu minimieren, die ansonsten die Selektivität und Kapazität des Harzes reduzieren können. Die Aufnahme eines Polyhistidin-Tags für die IMAC-Reinigung erhöhte die Reinheit in einem einzigen Schritt auf 90 %, was eine schnelle und kostengünstige Ligandenproduktion5,43,44ermöglicht. Die Position des Fusionstags ist jedoch wichtig, da es das Potenzial hat, die Epitopbindung sterisch zu behindern oder die Spaltung des Tags oder des Epitops vom Träger45,46zu induzieren.
Immobilisierung des Affinitätsligandens auf NHS-aktivierten Chromatographiesäulen
Die Immobilisierung erfolgte manuell oder mit einem Chromatographiesystem. Die geringen Puffervolumina pro Kolonne schienen die manuelle Handhabung zu begünstigen (z.B. aufgrund der minimalen Abfallmengen). Wenn jedoch mehrere/größere Säulen benötigt werden, erleichtert das Chromatographiesystem die Steuerung der Kopplungsbedingungen (z. B. regulierte Durchflussraten) und ist daher eher zu reproduzierbaren Ergebnissen in Bezug auf DBC. Unsere Daten deuten darauf hin, dass der Kopplungspuffer und der pH-Wert einen wichtigen Einfluss auf die Kopplungseffizienz und die Gesamtsäulenkosten haben. Screening-Faktoren, die die Kopplungsreaktion beeinflussen und sie für jedes Trägerprotein (oder sogar für jede Träger-Ligand-Fusion) anpassen, könnten daher die Kopplungseffizienz und Harzleistung verbessern, und wir empfehlen diesen Ansatz.
Testen der 2F5-Isolierung mit dem DFE-Affinitätsharz
Produktausbeute und Reinheit sind wichtige Aspekte der Harzleistung, und bei DFE erreichten wir eine Ausbeute von 105 x 11 % (SD, n=3) und eine Reinheit von 97 x 3 % (SD, n=3), die mit der Leistung von Benchmark-Protein-A-Harzen25 vergleichbar ist. ,26. Ein weiterer wichtiger Leistungsindikator für Harze im Allgemeinen (und insbesondere für solche, die auf Affinitätsliganden basieren) ist der DBC bei 10% Produktdurchbruch, da dieser Parameter die für einen bestimmten Prozess benötigte Harzmenge und damit die Kosten beeinflusst. Für den DFE-Ligand betrug der anfangse DBC L-1 Harz, das unter ähnlichen Bedingungen 13 % des entsprechenden Wertes für Protein A beträgt (nur 2 min Kontaktzeit)25,47, aber etwa 15-fach höher im Vergleich zu anderen kundenspezifischen Affinitätsharzen wie Anti-FSH-Immunoaffinitätligand mit der gleichen Verweilzeit von 2 min48. Die DBC von DFE sank auf 15% des Startwertes nach 25 Bind-and-Elute-Zyklen, während mehr als 50 Zyklen für den gleichen Verlust von DBC in kommerziellen Protein A Harzen49erforderlich sind. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass unser Träger noch nicht im gleichen Maße optimiert wurde wie Protein A, das in den letzten vier Jahrzehnten umfassend untersucht und verbessert wurde8.
Bisher haben wir die Harzstabilität und Produktrückgewinnung verbessert, indem wir von einem niedrigen pH-Elutionspuffer auf eine hohe Konzentration von Magnesiumchlorid umgestellt haben (Abbildung 3), wie in früheren Studienempfohlen 13. Die charakteristische rote Farbe des Affinitätsligands verblasste während der 25 Binde-und-Elut-Zyklen nicht wesentlich, so dass wir spekulieren, dass endogene Pflanzenproteasen in den geklärten Pflanzenextrakten31 das Epitop von den Liganden. Daher kann das Entwerfen von proteaseresistenten Linkern, um den Träger und das Epitop zu verbinden, dazu beitragen, den anfänglichen DBC über eine längere Anzahl von Zyklen aufrechtzuerhalten. Angesichts der schnellen und einfachen Expression und Reinigung des DFE-Ligands, seiner einfachen Kopplung an kommerzielle Chromatographieharze und seiner hervorragenden Produktausbeute und -reinheit glauben wir, dass unsere Methode eine geeignete Alternative zu Protein A für die Reinigung von mAbs und Antikörperderivaten, die nicht an Protein A binden, insbesondere wenn Verbesserungen am Träger und Linker die DBC- und Ligandenstabilität verbessern können. Diese Annahme wurde durch den geringen Unterschied in der Dissoziationskonstante von DFE-gereinigtem und Protein A-gereinigtem 2F5-Antikörper5gestützt, was darauf hindeutet, dass unser neuer Affinitätsligand die Rückgewinnung hochwertiger mAbs ermöglicht.
Vorteile und aktuelle Einschränkungen der Methode
Die Herstellung des Affinitätsligands als genetische Fusion mit einem Trägerprotein erhöht die Löslichkeit in wässrigen Puffern und damit die Kompatibilität mit typischen Liganden-Kopplungsbedingungen. Im Gegensatz dazu können blanke Peptide, die aus der Volumenphasenpeptidsynthese abgeleitet werden, aufgrund ihrer Sequenz50eine begrenzte Löslichkeit aufweisen, die nicht geändert werden kann, da sie durch die vom mAb erkannte Aminosäuresequenz des Epitops gereinigt werden. Andere haben daher eine On-Harz-Synthese von Peptid-Ligen51verwendet. Die statische Bindungskapazität des resultierenden Harzes war hoch (ca. 80 g L-1), aber der Prozess der Harzvorbereitung ist langwierig, eine dynamische Bindungskapazität wurde nicht gemeldet und die erhaltene Reinheit und Rückgewinnung waren niedriger als in unserem Ansatz. Ein weiterer Vorteil eines Fusionsproteinsligenden im Labormaßstab ist, dass der Ligand und dessen Varianten schnell in einem einfach zu bedienenden High-Through-Expressionssystem52mit minimalem Aufwand produziert, gereinigt und getestet werden können.
Die beiden aktuellen Einschränkungen der hier vorgestellten Methode sind die geringe dynamische Bindungskapazität von 3 L-1 und seine 90%ige Reduktion im Laufe von 25 Binde-und-Elut-Zyklen5. Diese Einschränkungen können in Zukunft durch weniger strenge Belastungsbedingungen und den Austausch des aktuellen DsRed-Trägers durch eine konstruierte, stabilere Variante behoben werden. Beispielsweise hat die Verdoppelung der aktuellen Kontaktzeit von 2 auf 4 Minuten das Potenzial, die dynamische Bindungskapazität zu verdoppeln, wie für einige Protein A Harze26gezeigt wurde.
Problembehandlung
In der folgenden Tabelle werden potenzielle Probleme aufgezeigt, die während dieses Protokolls auftreten können, und es werden Hinweise zur Lösung dieser Probleme (Tabelle1) angezeigt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabelle 1: Potenzielle Probleme, die auftreten können, und mögliche Korrekturen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokollschritt</td>
			<td>problem</td>
			<td>Couse</td>
			<td>Lösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Pflanzen wachsen nicht</td>
			<td>Gefährdete Wachstumsbedingungen</td>
			<td>Überprüfen Sie den pH-Wert und die Leitfähigkeit des Düngers</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Überprüfen Sie die Temperatur- und Lichtverhältnisse</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 und 3</td>
			<td>Große Mengen an Wirtszellproteinen sind nach der Extraktion vorhanden</td>
			<td>Unvollständiger Niederschlag</td>
			<td>Überprüfen Sie die Temperatur während des Blanchierens</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Überprüfen Sie die Rührung im Blanchierungsbad</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 und 3</td>
			<td>Kein Produkt im Pflanzenextrakt gefunden</td>
			<td>Blanchiertemperatur zu hoch</td>
			<td>Temperatur und pH-Wert beim Blanchieren prüfen</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH-Wert im Blanchierungspuffer zu niedrig</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Große Stamm- oder Blattteile bleiben nach der Extraktion</td>
			<td>Unvollständige Mischung im Mixer</td>
			<td>Stellen Sie sicher, dass das Pflanzenmaterial keinen Stecker im Mixer bildet</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Schnelle Druckerhöhung bei tiefen Filtration</td>
			<td>Falsche Filterauswahl und/oder Ausrichtung</td>
			<td>Überprüfen Sie den Filtertyp und die Ausrichtung</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Wenig Fusionsprotein während der Elution / viel Fusionsprotein im Durchfluss</td>
			<td>IMAC-Harz wurde nicht mit Metallionen aufgeladen</td>
			<td>Prüfen Sie, ob das IMAC-Harz korrekt mit Ionen aufgeladen wurde</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Fusion-Protein verlor das Affinitäts-Tag</td>
			<td>Vermeiden Sie intensives Sonnenlicht und hohe Temperaturen während des Pflanzenanbaus</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Fusionsprotein während der Konzentration verloren</td>
			<td>Fusionsprotein an die Membran gebunden</td>
			<td>Überprüfen Sie den Membrantyp</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stellen Sie sicher, dass der Konzentrationsfaktor nicht zu hoch war</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Geringe Kupplungsausbeute</td>
			<td>Falsche Reihenfolge der Kopplungreagenzzugabe</td>
			<td>Überprüfen Sie die Reagenzienetiketten und die Reihenfolge der</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Falsche Vorbereitung der Säulen vor der Kopplung</td>
			<td>Überprüfen Sie die Bedingungen der Säulenvorparaiton</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 und 6</td>
			<td>Niedriger mAb-Ertrag</td>
			<td>Niedrige mAb-Expression in der pflanzlichen Biomasse</td>
			<td>Test mAb-Expression in Biomasse</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Niedrige Ligandendichte</td>
			<td>Überprüfen Sie die Reinheit der Fusionsproteinzubereitung</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Sehr niedrige/hohe Proteinkonzentrationen in Bradford Assay</td>
			<td>Blasenbildung beim Pipetieren</td>
			<td>Prüfen Sie auf Blasen im 96-Well-Palte</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Niedrige mAb-Konzentration bei SPR-Messung</td>
			<td>Compromised Protein A Chip</td>
			<td>Vergleichen Sie mit den Ergebnissen der Standard-mAb mit bekannter Konzentration</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Falsche Probenverdünnung</td>
			<td>Überprüfen Sie die Verdünnungsrate und den Puffer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Trouble-Shooting.

Biopharmazeutische Produkte sind wichtig für die Behandlung eines breiten Spektrums von Krankheiten in fast allen Bereichen der Medizin1. Monoklonale Antikörper (mAbs) dominieren den biopharmazeutischen Markt, der weltweite Umsatz soll 2020 fast 110 Milliarden Euroerreichen. Die bevorzugte Expressionsplattform für mAbs sind chinesische Hamster-Ovarialzelllinien, die typischerweise hohe mAb-Titer von bis zu 10 g-L-1 im Kulturüberstand3,4produzieren. Die Produktion von mAbs in Säugetierzellkulturen ist jedoch aufgrund der hohen Kosten des Mediums und der Notwendigkeit einer sterilen Fermentation5teuer. Alternative Ausdrucksplattformen wie Anlagen bieten potenziell einen schnelleren, einfacheren, kostengünstigeren und skalierbareren Ansatz für die industrielle Fertigung6,7.
Zusätzlich zu den Kosten, die mit Säugetierzellkulturen verbunden sind, ist die weit verbreitete Verwendung der Protein-A-Affinitätschromatographie für die Produkterfassung ein wichtiger Kostentreiber für die industrielle Produktion von mAbs. Protein A ist natürlicherweise auf der Oberfläche von Staphylococcus aureus Zellen gefunden und es bindet an die Fragment kristallisierbare (Fc) Region von bestimmten murinen und menschlichen Antikörpern, wodurch als Abwehrmechanismus, um das humorale Immunsystem zu umgehen8. Protein A hat sich zum Industriegoldstandard für die Erfassung von mAbs aus Zellkulturüberstand und ist auch weit verbreitet von der Forschungsgemeinschaft, weil es sehr selektiv ist, in der Regel erreichen mAb Reinheitvon 95% in einem einzigen Schritt8. Es überrascht nicht, dass der Verkauf von Protein A in den letzten zwei Jahrzehnten den Umsatz von mAbs8sehr genau widerspiegelte. Je nach Produktionsskala können die Kosten von Protein A mehr als 25% der gesamten Prozesskosten betragen und damit den Marktpreis von therapeutischen mAbs beeinflussen, der bis zu 2.000 g-15,9betragen kann. Daher haben alternative Chromatographieharze mit ähnlicher Reinigungsleistung das Potenzial, die Produktionskosten erheblich zu senken, wodurch Antikörper-basierte Therapien für eine größere Anzahl von Patienten zugänglich sind10,11 ,12. Solche Alternativen können auch die Nachteile der Protein-A-Chromatographie umgehen, einschließlich der harten Elutionsbedingungen bei niedrigem pH-Wert (typischerweise <3.5), die möglicherweise dazu führen können, dass mAbs konforme Veränderungen durchlaufen, die die Aggregation fördern13 . Wichtig ist, dass Protein A nur für die Fc-Region bestimmter IgG-Unterklassen selektiv ist, so dass nicht-funktionelle Moleküle mit abgeschnittenen Bindungsdomänen mit dem intakten Produkt5ko-reinigen können, während mAb-Derivaties wie einkettige variable Fragmente nicht an Protein A binden.
Hier beschreiben wir ein alternatives Affinitätschromatographieharz zur Erfassung des HIV-neutralisierenden mAb 2F5 mit seinem linearen Epitop ELDKWA (ein Buchstabe Aminosäurecode)5,14. Wir haben das 2F5-Epitop genetisch mit dem C-Terminus des fluoreszierenden Proteins DsRed verschmolzen, das als Träger- und Reportermolekül fungierte, und das resultierende Protein DsRed-2F5-EPitop (DFE) in transgenem Tabak ( Nicotiana tabacum) Pflanzen. DFE wurde durch einstufige immobilisierte Metall-Ionen-Affinitätschromatographie (IMAC) gereinigt. Die Immobilisierung des gereinigten DFE-Affinitätsligandes auf ein vernetztes Agaroseharz wurde durch chemische Kopplung mit N-Hydroxysuccinimid (NHS)-aktivierten vernetzten Agarosesäulen erreicht. Statistische Versuchsentwürfe wurden dann verwendet, um den Immobilisierungsverfahren und die Kopplungseffizienz15zu optimieren. Die Reinigungsstrategie für mAb 2F5 wurde in Bezug auf Antikörperreinheit, Ausbeute und Ligandenstabilität bewertet. Im Gegensatz zu Protein A, das die Fc-Region bindet, ist DFE an die komplementäritätsbestimmende Region 2F5 gebunden, um die Reinigung von Molekülen mit einem intakten Paratop zu gewährleisten. Unser Konzept lässt sich leicht an jedes mAb mit einem linearen Epitop oder an andere Peptid-basierte Affinitätsliganden anpassen, die durch Mikroarray-Studien leicht identifiziert werden können16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Abbildung 1: Prozessflussschema zur Herstellung von Epitop-Affinitätsharzen, die für die Erfassung von mAbs aus Rohpflanzenextrakten oder Zellkulturüberstandverwendetern verwendet werden können. (A) Die Affinität Ligand DFE wurde in transgenen Tabakpflanzen ausgedrückt. Ein Wärmefällschritt (B) wurde vor der Homogenisierung der geernteten Blätter (C )einbezogen. (D) Der Rohpflanzenextrakt wurde durch Beutelfiltration, Tiefenfiltration und 0,2 m sterile Filtration geklärt. (E) DFE wurde dann von IMAC gereinigt. (F, G) Die gereinigte DFE-Affinitätsliganand wurde auf EDC/NHS-aktivierten vernetzten Agarosesäulen immobilisiert. (H) Bakterienkulturen mit T-DNA-kodierender Antikörper 2F5 wurden zur transienten Expression in N. benthamiana Pflanzen (I) verwendet, die in einem Phytotron angebaut wurden. (J) N. Benthamiana Blätter wurden geerntet und verarbeitet, wie in D. (K) mAb 2F5 beschrieben wurde aus dem geklärten Extrakt mit den DFE-Affinitätssäulen gereinigt (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

Die Reinigung monoklonaler Antikörper (mAbs) wird üblicherweise durch Protein-A-Affinitätschromatographie erreicht, die bis zu 25 % der gesamten Prozesskosten ausmachen kann. Alternative, kostengünstige Erfassungsschritte sind daher wertvoll für die industrielle Fertigung, bei der große Mengen eines einzelnen mAb produziert werden. Hier stellen wir eine Methode zur Immobilisierung eines DsRed-basierten Epitopligands zu einem vernetzten Agaroseharz vor, das den selektiven Abfang des HIV-neutralisierenden Antikörpers 2F5 aus Rohpflanzenextrakten ohne Verwendung von Protein A ermöglicht. Das lineare Epitop ELDKWA wurde zunächst genetisch mit dem fluoreszierenden Protein DsRed verschmolzen und das Fusionsprotein wurde in transgenen Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) vor der Reinigung durch immobilisierte Metall-Ionen-Affinitätschromatographie exprimiert. Darüber hinaus wurde ein Verfahren auf Basis aktivierter vernetzter Agarose für hohe Ligandendichte, effiziente Kopplung und geringe Kosten optimiert. Die pH- und Pufferzusammensetzung und die lösliche Ligandenkonzentration waren die wichtigsten Parameter während des Kopplungsverfahrens, das durch einen Versuchsansatz verbessert wurde. Das resultierende Affinitätsharz wurde auf seine Fähigkeit getestet, das Ziel mAb selektiv in einem Rohpflanzenextrakt zu binden, und der Elutionspuffer wurde für hohe mAb-Rückgewinnung, Produktaktivität und Affinitätsharzstabilität optimiert. Die Methode kann leicht an andere Antikörper mit linearen Epitopen angepasst werden. Die neuen Harze ermöglichen schonendere Elutionsbedingungen als Protein A und könnten auch die Kosten eines ersten Erfassungsschritts für die mAb-Produktion senken.

Ausdruck und Reinigung der Affinität Liganden
Das Fusionsprotein DFE wurde in transgenen Tabakpflanzen exprimiert, die in einem Gewächshaus angebaut wurden. Der Ertrag betrug 120 mg-kg-1 Blattmasse mit einer durchschnittlichen Biomasse von 130 g pro Pflanze. Die DFE-Reinheit betrug vor dem Blanchieren <5% des TSP in Rohpflanzenextrakten, erhöhte sich aber nach einer Wärmebehandlung bei 70 °C für 1,5 min auf 40 %, wodurch >97% der Wirtszellproteine ausgefällt wurden. Der Blanchierungsschritt wurde leicht in die Ernte- und Extraktionsroutine integriert (Abbildung 1) und benötigte weniger als 2 h zusätzliche Zeit, einschließlich des Aufbaus des Wasserbades. Die Gesamterholung von DFE betrug 23,5 mg kg1 mit einer Reinheit von >90%. Die für den Produktverlust verantwortlichen Schritte waren Blanchierung, Tiefenfiltration und IMAC mit spezifischen Verlusten von 40 %, 27 % bzw. 45 %. Die Tiefenfilterkapazität betrug durchschnittlich 135 x 36 l m-2 (SD, n=3) und damit im oberen Wertebereich, der in der Literatur21berichtet wurde. Der DFE-Ertrag stieg mit dem Pflanzenalter (Abbildung 2).
Immobilisierung des Affinitätsligandens auf NHS-aktivierten Chromatographiesäulen
Bei ersten Kopplungstests stellten wir fest, dass der HEPES-Puffer (pH 8.3) den Kopplungs-Wirkungsgrad auf 89 x 6 % (SD, n=3) im Vergleich zu 78 x 9 % (SD, n=3) für den vom Hersteller empfohlenen Bicarbonatpuffer erhöhte. Daher wurde HEPES für alle nachfolgenden Kopplungsexperimente eingesetzt. Ein DoE-Ansatz wurde gewählt, um die Kopplungseffizienz von DFE mit NHS-aktiviertem vernetztem Agaroseharz zu optimieren. Die absolute Menge an DFE, die auf dem Harz immobilisiert wurde, erhöhte sich mit der Masse von DFE, die in die Säule injiziert und bei 15 g hochgeschraubt wurde. L-1 während die Kopplungsausbeute kontinuierlich zurückging, da mehr DFE injiziert wurde (Abbildung 2). Die Kopplungsausbeute war auch in einem sauren Puffer um >50 % niedriger, was darauf hindeutet, dass für jeden Liganden von Fall zu Fall geeignete Kopplungsbedingungen geprüft werden müssen. Mit dem numerischen Optimierungstool der DoE-Software wurden ideale Bedingungen in Bezug auf Kopplungsausbeute, absolute Menge an immobilisierten DFE und Säulenkosten ermittelt. Die wünschenswertesten Bedingungen (pH 9,0 und 7,0 mg DFE pro 1 ml vernetztes Agaroseharz) lagen auf einem großen Plateau und waren daher robust. Die DFE-Moleküle behielten ihre rote Fluoreszenz auch nach der Kopplung bei, und die Farbintensität entsprach der Gesamtmenge der immobilisierten DFE (Abbildung 2). Daher kann die Spaltenfarbe als einfacher Qualitätskontrollparameter verwendet werden, um die Kopplungseffizienz und Spaltenqualität zu schätzen. Die Fluoreszenz bestätigte auch, dass DFE-Fusionsprotein im tetramerischen Zustand der nativen DsRed zusammengebaut wurde.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Abbildung 2: Optimierung der DFE-Immobilisierung auf NHS-aktiviertes vernetztes Agaroseharz. (A) LDS-PAA Gel mit Western Blot Overlay von Homogenats- und Elutionsproben aus unblanched transgenen DFE-Pflanzenextrakten. Die Ernte der Pflanzen erfolgte 38, 45 oder 52 Tage nach der Aussaat. Westliche Flecken wurden mit einemAnti-His 6-Antikörper5durchgeführt. (B) Gesamtmenge der gekoppelten DFE-Affinitätsliganden in Abhängigkeit, wenn der pH-Wert und die Gesamtmasse des gereinigten DFE auf NHS-aktivierte vernetzte Agarosesäulen injiziert werden. Rote Punkte geben die tatsächlichen Experimente an, die zum Erstellen des Antwortoberflächenmodells durchgeführt wurden. (C) DFE-Affinitätssäulen nach dem Kopplungsverfahren. Die Zahlen entsprechen den Innungsbedingungen, die in Panel B hervorgehoben sind. dps = Tage nach der Aussaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Testen der 2F5-Isolierung mit dem DFE-Affinitätsharz
Der rekombinante 2F5-Antikörper wurde vorübergehend in Nicotiana Benthamiana-Pflanzen hergestellt, die in einem Phytotron5angebaut wurden. Die Erfassung von 2F5 aus dem Rohpflanzenextrakt wurde mit Affinitätssäulen in Verbindung mit 7,0 mg gereinigtem DFE (Schritt 6) getestet. Die Elution aus Protein-A-Harzen beinhaltet in der Regel einen sauren Puffer (pH 3,3)13. Daher haben wir zunächst verschiedene Low-pH-Elutionspuffer (pH 6.0–3.25) für die DFE-Spalten ausgewertet. Die Elution von 2F5 war bei pH-Werten unter 4,5 erfolgreich, wobei die höchste Erholung s35% bei pH 3,25 betrug. Allerdings inaktivierte die Low-pH-Elution sowohl den Antikörper (wie durch SPR-Spektrometrie bestätigt) als auch den DFE-Ligand (wie durch den Farbverlust und den unteren DBC angezeigt, Abbildung 3). Letzteres wurde erwartet, da native DsRed denaturiert bei pH <4.022,23. Um eine Produkt- und Ligandendenaturierung zu vermeiden, haben wir Magnesiumchlorid als alternatives Elutionsmittel getestet, da es zuvor verwendet wurde, um mAbs aus anderen Affinitätsharzen zu entkernen24. Eine Magnesiumchloridkonzentration von 1,25 m reichte aus, um 2F5 aus dem DFE-Affinitätsharz mit einer Rückgewinnung von 105 x 11 % (SD, n=3) und einer Reinheit von 97 x 3 % (SD, n=3) zu entkernen. Diese Leistung war vergleichbar mit Protein A Harzen25,26. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (KD) des DFE-gereinigten 2F5-Antikörpers und des synthetischen Ligandfuzeons betrug 791 pM, während das eines Protein A-gereinigten Gegenstücks 763 pM5betrug. Darüber hinaus wurden im Harz über insgesamt 25 Binde- und Elutezyklen kein nennenswerter Farbverlust beobachtet. Der DBC des DFE-Affinitätsharzes bei 10% 2F5 Durchbruch sank linear im Laufe von 25 Zyklen auf 15% des Ausgangswertes (Abbildung 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Abbildung 3: Testen der Isolierung von 2F5 aus geklärten Pflanzenextrakten mit den DFE-Affinitätsharzen. (A) DFE-Affinitätsharze nach einem Elutionszyklus mit Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten im Bereich 4.0–3.0 und den gleichen Harzen nach einem Neutralisationsschritt bei pH 6.0. (B) DFE-Affinitätsharze nach einem und sechs Zyklen 2F5-Reinigung mit 1,25 m oder 4,00 m Magnesiumchlorid als Eluent. (C) Chromatogramme von Frontalbelastungsexperimenten (Durchbrüche), um die zyklusabhängige dynamische Bindungskapazität von DFE-Harz unter Verwendung von Magnesiumchlorid als Eluent zu bestimmen. Die Durchbrüche wurden für 4,0 M und 1,25 M Magnesiumchlorid-Elutionspuffer und verschiedene Zykluszahlen gemessen. (D) Zyklusabhängige dynamische Bindungskapazität von DFE mit 1,25 M Magnesiumchlorid als Eluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Bei diesem Verfahren wird ein DsRed-basierter Epitopligand immobilisiert, um als Alternative zu Protein A ein hochselektives Affinitätsharz für den Abscheidung monoklonaler Antikörper aus rohen Pflanzenextrakten oder Zellkulturüberbleibsanten herzustellen.

Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinity Chromatography Resins - Antikörpererfassung als Fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Monoklonale Antikörper dominieren den biopharmazeutischen Markt und werden typischerweise durch Protein-A-Chromatographie gereinigt. Das befolgende Harz ist ein wichtiger Kostentreiber während der Produktion, der sich auf den Preis von Antikörper-basierten Therapeutika auswirkt. Hier beschreiben wir einen neuen Affinitätsligand, der auf dem fluoreszierenden Protein basiert, das als Träger für das lineare Epitop des HIV-neutralisierenden Antikörpers 2F5 gelesen wird.Im Allgemeinen ermöglicht unsere Methode die schnelle Erzeugung von Affinitätschromatographieharzen, die für die Erfassung monoklonaler Antikörper verwendet werden können. Wir haben diese Fähigkeit demonstriert, indem wir Antikörper 2F5 aus Rohpflanzenextrakt eingefangen haben. Wir haben die Aufnahmebedingungen und den Lösungspuffer optimiert, um die dynamische Bindungskapazität und die Harzwiederverwendbarkeit zu verbessern.Unser Harz ermöglicht in der Regel lockerere Bedingungen als Protein A und hat das Potenzial, die Reinigungskosten monoklonaler Antikörper zu senken. Darüber hinaus kann das Harz leicht an andere Antikörper angepasst werden, die an lineare Epitope binden. Um dieses Verfahren zu beginnen, passen Sie die Konzentration der vorbereiteten Affinität Stadelandlösung so an, dass sie im Bereich von 5 bis 15 Gramm pro Liter liegt, wie im Versuchsdesign definiert.Bewahren Sie die Lösung auf Eis auf, bis die Kupplungsreaktion bereit ist. Als nächstes füllen Sie eine Zwei-Milliliter-Spritze mit der DFE-Lösung. Und bereiten Sie einen Adapter vor, um die Spritzen auf NHS-aktivierten Kreuzlink-Agarosesäulen mit einem Bettvolumen von einem Milliliter zu montieren.Für 10 Säulen, die für die Kopplung verwendet werden, bereiten Sie 30 Milliliter Deaktivierungslösung, 30 Milliliter Niedrig-pH-Lösung und einen Milliliter Speicherlösung vor. Dann 20 Milliliter einer Millimolaren Salzsäure in einem Rohr zubereiten. Und brüten Sie es mindestens 20 Minuten auf Eis.Bereiten Sie eine Präzisionsskala vor, um den Durchfluss durch Brüche für alle Schritte während der Kopplungsreaktion zu überwachen. Öffnen Sie danach eine versiegelte NHS-aktivierte vernetzte Agarosesäule. Tragen Sie einen Puffertropfen auf den Adaptereinlass auf, um zu verhindern, dass Luft in die Spalte gelangt.Montieren Sie den Spritzenadapter am Säuleneinlass. Waschen Sie die Säule mit sechs Millilitereeiskalteine Millimolar-Salzsäure, bei einer Durchflussrate weniger als ein Milliliter pro Minute. Mit einer Zwei-Milliliter-Spritze sofort 1,5 Milliliter DFE-Lösung bei einem Durchfluss von weniger als einem Milliliter pro Minute injizieren.Und sammeln Sie den Durchfluss durch Fraktion auf einer Präzisionsskala für die nachfolgende Analyse. Versiegeln Sie die Säule an beiden Enden und brüten Sie für 15 bis 45 Minuten bei 22 Grad Celsius. Als nächstes injizieren Sechs Milliliter der Aktivierungslösung, gefolgt von sechs Millilitern niedriger pH-Lösung, bei einer Durchflussrate von weniger als einem Milliliter pro Minute, entfernen Sie nicht kovalent gebundene Liganden aus dem Harz.Injizieren Sie sechs Milliliter der Aktivierungslösung, und inkubieren Sie die Säule für 15 Minuten. Danach sechs Milliliter Niedrig-pH-Lösung in die Säule injizieren. Gefolgt von sechs Millilitern der Aktivierungslösung.Dann weitere sechs Milliliter niedrig pH-Lösung in die Säule injizieren. In jizieren Sie zwei Milliliter Speicherlösung in die Säule, und speichern Sie sie bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie zunächst 100 Milliliter des geklärten Pflanzenextrakts vor, der 2F5 enthält, oder des Überstandes für das bevorzugte zellbasierte Expressionssystem, das auch 2F5 enthält.Als nächstes bereiten Sie den Ausgleichspuffer und den Illusionspuffer mit hoher Eisen-X-Stärke vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Spülen Sie das Chromatographiesystem mit den Puffern. Montieren Sie eine DFE-Affinitätsspalte auf dem Chromatographiesystem.Und gleichgewichten mit fünf CV Ausgleichspuffer, mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute. Überwachen Sie die UV-Absorption mit 280 Nanometern. Dann laden Sie entweder 80 Milliliter des geklärten Pflanzenextrakts oder des Überstandes mit einer Durchflussrate von 5 Millilitern pro Minute auf die Säule.Um eine Kontaktzeit von zwei Minuten zu garantieren. Sammeln Sie den Durchfluss durch Proben in zwei Milliliter-Fraktionen oder bahnbrechende Kurvenrekonstruktion. Bewahren Sie den Durchfluss durch Proben bei vier Grad Celsius auf, wenn eine sofortige Probenanalyse nicht möglich ist.Danach die Säule mit 6CV Ausgleichspuffer waschen. Sammeln Sie eine Probe am Anfang, in der Mitte und am Ende der Wäsche. Verdünnen Sie den MAB2F5 mit fünf Volumen mit hohem Ionenstärke-Illusionspuffer.Sammeln Sie die DFE-Fraktion, wenn das UV-Signal bei 280 Nanometer auf fünf Milli-Absorptionseinheiten über der Basislinie angestiegen ist. Optimieren Sie den Illusionspuffer für jedes Epitop-Antikörper-Paar, wie im Textprotokoll beschrieben. Das Fusionsprotein DFE wird in transgenen Tabakpflanzen exprimiert, die in einem Gewächshaus angebaut werden.Die Gesamterholung von DFE beträgt 23,5 Milligramm pro Kilogramm. Bei einer Reinheit von über 90% Die absolute Menge an DFE, die auf dem Harz immobilisiert wird, steigt mit der Masse von DFE, die in die Säule injiziert wird, und Plateaus bei etwa 15 Gramm pro Liter, während die Kopplungsausbeute kontinuierlich abnimmt, wenn mehr DFE injiziert wird. Die DFE-Moleküle behalten ihre rote Blütenpracht auch nach der Kopplung.Die Farbintensität entspricht der Gesamtmenge der immobilisierten DFE. Daher kann die Spaltenfarbe als einfacher Qualitätskontrollparameter verwendet werden, um die Kopplungseffizienz und die Spaltenqualität zu schätzen. Der rekombinante 2F5-Antikörper wird vorübergehend in Nicotiana Benthamiana-Pflanzen hergestellt, die in einem Phytotron angebaut werden.Die Erfassung von 2F5 aus dem Rohpflanzenextrakt wird mit Affinitätssäulen getestet, gekoppelt mit etwa sieben Milligramm gereinigtem DFE. Eine Magnesiumchloridkonzentration von 1,25 Mol reicht aus, um 2F5 aus dem DFE-Affinitätsharz mit einer Erholung von fast 100% und einer Reinheit von ca. 97%, die mit Protein-A-Harzen vergleichbar ist, zu entkernen. Der DBC des DFE-Affinitätsharzes bei 10%2F5 Durchbruch sinkt linear im Laufe der 25 Zyklen auf etwa 15% des Ausgangswertes.Wir haben einen Versuchsansatz verwendet, um die Kopplungskapazität unseres Affinitätsligands zu optimieren. Diese Bedingungen können in Zukunft auf andere Liganden abgestimmt werden. Unsere Methode verwendet floreszierendes Protein, um ein Sub-Carrier-Protein für den produktspezifischen Liganden zu fädeln.Fügen Sie gleichzeitig einfach Funktionen als visuellen Qualitätsindikator für den Mobilisierungsvorgang hinzu und geben Sie dem Bediener ein sofortiges und intuitives Feedback.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Tischplatte immobilisiert Metall Affinitätschromatographie, Rekonstitution und Assay ein Polyhistidine getaggt Metalloenzyme für das Grundstudium Labor

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Schnelle Bestimmung der Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Entwicklung eines Lateral Flow Immunochromatographic Strip für den schnellen und quantitativen Nachweis niedermolekularer Verbindungen

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...