Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

היינו רוצים להכיר באיברהים אל-עמאדי על הטיפוח של צמחי הטבק הטרנסגניים וד ר תומס רדמאכר על מתן ביטוי הטבק וקטור. המחברים רוצים להודות לד ר ריצ'רד טוימאן לקבלת סיוע מערכתי ומרקוס סאק לדיונים פוריים על מבנה הזיקה של DFE. העבודה הזאת ממומנת בחלקו על ידי התוכניות הפנימיות של פראונהופר-גיסלסירכתיים תחת גרנט לא. מושכים 125-600164 ומדינת צפון-ריין-וסטפאליה תחת מענק לייאסטגשיום מעניק no. 423 "רשת, הפקה מסתגלת". עבודה זו נתמכה על ידי הגרמני Forsch, החברה במסגרת מערכת הכשרת מחקר "מסירת תרופות ממוקדות גידול" גרנט 331065168. ביטוח הבריאות של GE תמך בפרסום הגישה הפתוחה של מאמר זה.

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

יישומים של שרף הזיקה הרומן
הצגנו כי מותאם אישית הזיקה כרומטוגרפיה שרפים ללכידת mAbs יכול להיות מיוצר על ידי השתק ליגייט והמכיל אפירופה ספציפי Mabs לתוך הפעיל מקושרת מקושרת. כדי לעצב שרף כזה, היה צורך לדעת את רצף האפירופה ולהשתמש באפירופה לינארית. שרפים וכתוצאה מכך הם יתרון עבור לכידת mAbs כי הם יכולים להחליף חלבון יקר שלבים כרומטוגרפיה זיקה. האינטראקציה בין 2F5 ו-DFE במחקר שלנו היה בתיווך על ידי אפירופה – paratope כריכה, כך ליגאן שלנו צריך להיות סלקטיבי יותר מאשר חלבון A, אשר נקשר לאזור Fc של רוב מורלין והאיגים אנושיים. מכיוון שליגניות בודדות נדרשות עבור כל mAb, השיטה שלנו עשויה להיראות בתחילה מתאימה בעיקר לנוגדנים המיוצרים בקנה מידה גדול מאוד. עם זאת, על ידי שילוב הגישה שלנו עם ביטוי מהיר המבוסס על הצמח בחלבון ארעי, ליגנדס אהדה חדשה יכול להיות מוכן בתוך פחות מ 2 שבועות27 עם מאמץ מינימלי28. מכאן, השיטה מתאימה גם לטיהור בקנה מידה קטן mAb.
הפקה ושיפורים פוטנציאליים של הזיקה ליגולי
הצמחים מציעים פלטפורמת ייצור מהירה ובטוחה עבור ליגטרים5,29,30, כגון חלבון היתוך dfe מובלט במחקר שלנו מקרה. חולצ'ינג חומר הצמח הפחית במידה ניכרת את כמות החלבונים של תא מארח בצעד אחד והיה משתלב בקלות בשגרת הבהרה סטנדרטית. עם זאת, ההתאוששות של ליגנד היה נמוך ההתקנה הנוכחית, כנראה בשל היציבות תרמית מתון שלה כריכה מסוימת לא ספציפית לשכבות מסנן, כפי שדווחו עבור מוצרים אחרים31,32,33. הנדסה המוביל כדי להגדיל את היציבות התרמית שלה ולכן לסייע לשפר את התפוקה בעתיד, כפי שמתואר עבור המועמד החיסון נגד מלריה CCT, אנזים antitumor של הגידול או מβ lic-msm-glucosidase34, 35,36. אותו הדבר נכון גם לגבי שלב סינון העומק, שבו הנדסת חלבונים עשויים לסייע להפחית את הכריכה הלא ספציפית לחומר המסנן37. עלויות הייצור עבור dfe וליגטים דומים יכולים גם להיות מופחת על ידי שיפור היעילות הכוללת של הבהרה באמצעות flocculants או מסנן תוספים38,39.
כאשר DsRed משמש כמוביל, הוא יוצר קומפלקס tetrameric. זה יתרון כי זה מגדיל את מספר האפיסקופים ללימס, אבל זה עשוי גם להפוך את הליגולי רגישים יותר לפירוק או הדנטורציה במהלך כרומטוגרפיה של זיקה. חלבון הנושאת monomeric כגון mcherry יכול להיות עדיף, כי זה יציב ב-pH נמוך40, והכללת חוזר דו-מושביים יהיה להגדיל את האוויקות של ליגנד ובכך להגדיל את קיבולת שרף5, מיכל בן 26 , 41. מערכות הייצור הפשוטות של המוביל (כלומר, לאלה שאין להם קשרים דיאטוניים או שינויים שלאחר ההעברה) עשויים להפחית את עלויות הייצור ולהפוך את הליגשות לתחרותיות יותר בחלבון A. לדוגמה, חלבון פלורסנט ירוק כבר ביטא בתאים חיידקיים עם תשואה של ~ 1 גרם · ק"ג-1 ביומסה, אשר להפחית באופן משמעותי ליגוהייצור עלויות42.
ללא קשר למארח הביטוי, משיכה מטוהרים ליגורה היה נדרש במהלך הצימוד כדי למזער את השתק של חלבונים תא מארח או רכיבי מדיה שיכולים אחרת להפחית את הסלקטיביות שרף וקיבולת. הכללת תג פולי histidine עבור טיהור IMAC הגביר את הטוהר כדי ~ 90% בשלב אחד, הקלה ליגנד מהירה וזולה ייצור5,43,44. עם זאת, מיקומו של תג ההיתוך חשוב משום שיש לו את הפוטנציאל לעכב את הכריכה הקוסמית או לגרום למחשוף של התג או האפירופה מהמוביל45,46.
שינזציה של הזיקה לליבטורים בעלי כרומטוגרפיה מופעלים
השתק בוצע באופן ידני או באמצעות מערכת כרומטוגרפיה. אמצעי האחסון של המאגר הקטן לעמודה נראו כבעד טיפול ידני (לדוגמה, עקב אמצעי האחסון המינימלי לפסולת). עם זאת, אם יש צורך בעמודות מרובות/יותר, מערכת הכרומטוגרפיה הופכת את תנאי הצימוד לקל יותר לשליטה (לדוגמה, שיעורי זרימה מוסדרים) ולכן סביר יותר להשיג תוצאות שונות במונחים של DBC. הנתונים שלנו מראים כי מאגר צימוד ו-pH יש השפעה חשובה על היעילות צימוד ועלויות העמודה הכוללת. גורמי הקרנה המשפיעים על תגובת הצימוד והתאמת החיבור שלהם לכל חלבון מוביל (או אפילו עבור כל נשאית-ליגיון) יכולים אפוא לשפר את יעילות הצימוד והביצועים של שרף, ואנו ממליצים על גישה זו.
בדיקת בידוד 2F5 באמצעות שרף של זיקה DFE
תשואה המוצר וטוהר הם היבטים חשובים של ביצועים שרף, ובמקרה של DFE השגנו תשואה של 105 ± 11% (± SD, n = 3) וטוהר של 97 ± 3% (± SD, n = 3), אשר דומה לביצועים של חלבון בחינת ביצועים שרפים25 ,26. עוד מחוון ביצועים מפתח עבור שרפים בכלל (ובמיוחד עבור אלה המבוססים על ליגניות אהדה) הוא DBC ב 10% פריצת מוצר, כי פרמטר זה משפיע על כמות השרף הנדרש עבור תהליך ספציפי ולכן את העלויות. עבור הליגאות DFE, DFE הראשונית היה ~ 4 g · L-1 שרף, שהוא ~ 13% מהערך המתאים עבור חלבון A בתנאים דומים (רק 2 זמן יצירת קשר)25,47 אבל על 15-קיפול גבוה יותר לעומת שרפים זיקה מותאם אישית אחרים כגון אנטי-FSH-זיקה חיסוני ליגו שימוש באותו זמן מגורים של 2 דקות48. DBC של DBC סירב 15% מהערך ההתחלתי לאחר 25 מחזורי bind ו-elute ואילו יותר מ 50 מחזורים נדרשים לאותו אובדן של DBC בחלבון מסחרי שרפים49. עם זאת, חשוב לציין כי המוביל שלנו עדיין לא היה מותאם באותה מידה כמו חלבון A, אשר נחקר באופן מקיף והשתפר בארבעת העשורים האחרונים8.
עד כה שיפרנו את היציבות שרף והתאוששות המוצר על ידי מעבר מ-pH נמוך מאגר לריכוז גבוה של מגנזיום כלוריד (איור 3), כמומלץ במחקרים קודמים13. הצבע האדום האופייני של ליגולי האהדה לא נמוג באופן משמעותי במהלך 25 לאגד-ו-elute מחזורים, כך אנו משערים כי הצמח האנדוסוגני בתמציות צמחים הבהיר31 אולי נחתך ובכך להשבית את האפירופה של הליו. לכן, עיצוב מחברים עמידים פרוטאז כדי לחבר את המנשא ואת האפירופה עשוי לסייע לשמור על DBC הראשונית על מספר מורחב של מחזורים. בהינתן הביטוי המהיר והפשוט והטיהור של הליגאפה DFE, הזיווג הישיר שלה לגבי שרפים כרומטוגרפיה מסחריים, והתשואה המעולה שלה למוצר וטוהר, אנו מאמינים כי השיטה שלנו מציעה חלופה מתאימה חלבון A עבור טיהור של mAbs ונגזרות נוגדן אשר לא לאגד חלבון A, במיוחד אם שיפורים המוביל והמקשר יכול לשפר את DBC ו ליגויציבות. הנחה זו היתה נתמכת על ידי ההבדל הקטן בקבוע הדיסוציאציה של DFE מטוהרים וחלבון A-מטוהרים 2F5 נוגדן5, המציין כי ליגתנו החדש זיקה מאפשר התאוששות mabs באיכות גבוהה.
הטבות ומגבלות נוכחיות של השיטה
הפקת ליגולי אהדה כמו היתוך גנטי עם הספק חלבון מגביר מסיסות במאגרים מימית ובכך תאימות עם התנאים האופייניים לליגנד צימוד. לעומת זאת, פפטידים ריקים נגזר סינתזה פפטיד הפאזה היציבה עשויה להיות מוגבלת מסיסות תחת תנאים אלה בשל הרצף שלהם50, אשר לא ניתן לשנות כי זה מוכתב על ידי רצף חומצת אמינו של אפירופה מוכר על ידי mab כדי ל לטוהר. אחרים השתמשו לפיכך סינתזה על שרף של פפטיד ליגנדס51. יכולת האיגוד הסטטי של שרף שנוצר היה גבוה (~ 80 g · L-1), אך תהליך ההכנה של שרף הוא ארוך, קיבולת מחייבת דינמית לא דווחה והטוהר וההחלמה שהושגו היו נמוכים מאשר בגישה שלנו. יתרון נוסף של חלבון היתוך ליגולי בקנה מידה הוא כי הליקלים והמשתנים שלהם יכול להיות מיוצר במהירות, מטוהרים ונבדק במאמץ מינימלי קל לשימוש מערכת ביטויים גבוהה-דרך52.
שתי המגבלות הנוכחיות של השיטה המוצגת כאן הן קיבולת הכריכה הדינמית הנמוכה של 3 גר' · L-1 והפחתת 90% שלה במהלך 25 מחזורי bind ו-elute5. ניתן לטפל במגבלות אלה בעתיד על-ידי החלת תנאי טעינה מחמירים פחות והחלפת הספק הנוכחי של DsRed באמצעות variant מהונדס ויציב יותר בהתאמה. לדוגמה, הכפלה של זמן יצירת הקשר הנוכחי מ-2 עד 4 דקות כוללת את הפוטנציאל להכפיל את קיבולת האיגוד הדינאמי כפי שהוצג עבור חלבון מסוים שרפים26.
פתרון בעיות
הטבלה הבאה מדגישה בעיות פוטנציאליות שבהן ניתן להיתקל במהלך פרוטוקול זה ומספקת רמזים על אופן הפתרונן (טבלה 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">טבלה 1: בעיות פוטנציאליות שניתן להיתקל בהן ותיקונים אפשריים.</td>
		</tr>
<tr>
<td>שלב הפרוטוקול</td>
			<td>עיה</td>
			<td>וודאי</td>
			<td>תקן</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>הצמחים לא גדלים</td>
			<td>תנאי הגדילה הפרוצים</td>
			<td>בדוק את ה-pH ואת המוליכות של הדשן</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>בדוק את הטמפרטורה ואת תנאי האור</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ו-3</td>
			<td>כמויות גדולות של חלבונים תא מארח נמצאים לאחר החילוץ</td>
			<td>משקעים לא גמורים</td>
			<td>בדוק את הטמפרטורה במהלך השמיכה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>בדוק את העצבנות באמבט השמיכה</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ו-3</td>
			<td>לא נמצא מוצר בתמצית הצמח</td>
			<td>הטמפרטורה החולצ'ינג גבוהה מדי</td>
			<td>בדיקת טמפרטורה pH במהלך השמיכה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH במאגר החולטים נמוך מדי</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>חלקי גבעול או עלים גדולים נותרים לאחר החילוץ</td>
			<td>ערבוב לא שלם בבלנדר</td>
			<td>ודא שחומר הצמח אינו יוצר תקע בבלנדר</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>עלייה בלחץ מהיר במהלך סינון עומק</td>
			<td>בחירת מסננים שגויה ו/או כיוון</td>
			<td>בדיקת סוג המסנן וכיוון הסינון</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>חלבון היתוך קטן במהלך הימנעות/הרבה חלבון היתוך בזרימה-דרך</td>
			<td>שרף IMAC לא הואשם ביוני מתכת</td>
			<td>בדוק אם שרף ה-IMAC הואשם כהלכה ביונים</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>חלבון היתוך איבד את התגית הקרבה</td>
			<td>הימנע מאור השמש האינטנסיבי וטמפרטורות גבוהות במהלך טיפוח הצמח</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>חלבון פיוז'ן שאבד במהלך הריכוז</td>
			<td>חלבון פיוז'ן מאוגד לקרום</td>
			<td>בדוק את סוג הממברנה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>ודא שגורם הריכוז לא היה גבוה מדי</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיכל 5</td>
			<td>תשואה נמוכה לצימוד</td>
			<td>רצף שגוי של תוספת מגיב צימוד</td>
			<td>בדוק את התוויות הריאגנטים ואת רצף החיבור</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>הכנה שגויה של העמודות לפני צימוד</td>
			<td>בדוק את התנאים של הוראות העמודה</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ו-6</td>
			<td>תשואה נמוכה של mAb</td>
			<td>ביטוי נמוך מ-mAb ביומסה הצמח</td>
			<td>מבחן mAb ביטוי ביומסה</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>ליגוצפיפות נמוכה</td>
			<td>בדוק את טוהר הכנת חלבון ההיתוך</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>ריכוז נמוך/חלבון גבוה מאוד בתוך שיטת ברדפורד</td>
			<td>היווצרות בועות במהלך העוגה</td>
			<td>בדוק אם בועות 96-ובכן palte</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>ריכוז נמוך של mAb במהלך SPR מדידה</td>
			<td>חלבון שנפרץ שבב</td>
			<td>השווה עם תוצאות של mAb סטנדרטי עם ריכוז ידוע</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>דילול לדוגמה שגויה</td>
			<td>בדיקת שיעור הדילול והחוצץ</td>
		</tr>
</tbody></table>שולחן 1: בעיות הירי.

המוצרים הביופרמצבטיקה חשובים לטיפול בספקטרום רחב של מחלות כמעט בכל ענף של רפואה1. נוגדנים חד שבטיים (mAbs) להשתלט על השוק הביופרמקולוגיה, עם מכירות ברחבי העולם צפויים להגיע כמעט €110,000,000,000 בתוך 20202. פלטפורמת הביטוי המועדף על mabs הם הסינית שחלות אוגר תאים קווי, אשר בדרך כלל לייצר גבוה mabs מגדל של עד 10 g ∙ L-1 בתרבות supernatant3,4. עם זאת, הייצור של mAbs בתרביות תאים היונקים הוא יקר בשל העלות הגבוהה של המדיום ואת הצורך תסיסה סטרילית5. פלטפורמות ביטוי חלופיות כגון צמחים העשויים להציע גישה מהירה יותר, פשוטה יותר, זולה יותר ומדרגית יותר עבור ייצור תעשייתי6,7.
בנוסף לעלויות הקשורות לתרבויות תאי היונקים, השימוש הנרחב בחלבון כרומטוגרפיה של זיקה ללכידת המוצר הוא מנהל התקן של עלות מרכזית עבור הייצור התעשייתי של mAbs. חלבון A נמצא באופן טבעי על פני השטח של התאים האורהוניים של סטיילולוקוקוס והוא מאגד את הרסיס crystallizable (Fc) באזור של murine מסוימים ונוגדנים אנושיים, ובכך מתנהג כמנגנון הגנה להתחמק המערכת החיסונית ומוראלית8. חלבון A הפך לתקן זהב תעשיית לכידת mAbs מן התרבות התאית סופר והוא גם בשימוש נרחב על ידי קהילת המחקר כי זה סלקטיבי מאוד, בדרך כלל להשיג Mabs purities של ~ 95% בשלב אחד8. באופן לא מפתיע, מכירות של חלבון A במהלך שני העשורים האחרונים יש שיקוף מקרוב את המכירות של mAbs8. בהתאם לסולם הייצור, העלויות של חלבון A יכול להתאים יותר 25% מעלויות התהליך הכולל ובכך להשפיע על מחיר השוק של mabs טיפולית, אשר יכול להיות עד €2,000 g-15,9. לכן, כרומטוגרפיה חלופית שרפים עם ביצועי טיהור דומה יש פוטנציאל להפחית באופן משמעותי את עלויות הייצור, ביצוע טיפולים נוגדנים מבוססי נגיש עבור מספר גדול יותר של חולים10,11 ,12. חלופות כאלה עלולות גם לעקוף את החסרונות של חלבון כרומטוגרפיה, כולל התנאים הקשים ביותר ב-pH נמוך (בדרך כלל < 3.5) העלולים לגרום ל-mAbs לעבור שינויים מתוניים המקדמים את הצבירה13 . וחשוב מכך, חלבון A סלקטיבי רק עבור אזור Fc של מחלקות IgG מסוימות, כך שאינם פונקציונליים מולקולות עם תחומים כריכה חתוכים עשוי לטהר עם המוצר ללא שינוי5, ואילו mab ליגוניות כגון קטעי שרשרת בודדת משתנה לא להיקשר לחלבון A בכלל.
כאן, אנו מתארים שרף כרומטוגרפיה של זיקה כרומטוגרפית ללכידת ה-HIV-נטרול mab 2f5 באמצעות האפיפפן הליניארי שלה eldkwa (אות אחת חומצת אמינו קוד)5,14. התחזרנו גנטית את האפיפי של 2F5 ל-C הטרמינוס של חלבון הפלורסנט DsRed, אשר פעלו כמולקולה המוביל והעיתונאי, והפיק את החלבון המתקבל Dsred-2F5-Epitope (dfe) בטבק הטרנסגניים ( צמחים טבק טבאקו). DFE היה מטוהר על ידי צעד אחד מקיבוע מתכת-יון זיקה כרומטוגרפיה (IMAC). השתק של האהדה הטהורה של הזיקה ליגולי אל שרף אגקם מקושר הושג על ידי צימוד כימי באמצעות N-הידרוקסיזינימיד (הארגון)-הופעלו מקושרות מוצלבות עמודים. עיצובים ניסיוניים סטטיסטיים שימשו אז כדי למטב את הליך השתק ויעילות צימוד15. אסטרטגיית טיהור עבור mAb 2F5 הוערך במונחים של טוהר נוגדנים, תשואה ליגויציבות. בניגוד לחלבון A, אשר מאגד את אזור Fc, DFE מאוגד לאזור הקבוע ביותר של 2F5, להבטיח טיהור של מולקולות עם paratope שלם. הקונספט שלנו יכול בקלות להיות מותאם לכל mAb עם אפירופה ליניארי או אחרים מבוססי פפטיד מבוסס ליגנדס אשר ניתן לזהות בקלות על ידי מחקרים microarray16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> איור 1: תהליך תזרים התהליכים להכנת שרפים אהדה אפירופה שניתן להשתמש בהם ללכידת mAbs מתמציות צמחים גולמי או סופרנטנמלים של תרבות התאים. (א) ליגו dfe האהדה התבטא במפעלי טבק טרנסגניים. צעד משקעים בחום (ב) נכלל לפני העלים שנקטפו היו הומוגניים (C). (ד) תמצית הצמח הגולמי הובהר על ידי סינון שקית, סינון עומק ו-0.2 יקרומטר סינון סטרילי. (ה) dfe טוהר לאחר מכן על ידי IMAC. (F, G) האהדה DFE מטוהרים ליגס היה מחובר על העמודים EDC/הפעילה החוצה המופעלות מחוצה. (ח) בתרבויות חיידקית הנושאות את הנוגדן לקידוד T-DNA 2F5 שימשו לביטוי חולף ב -N. benthamiana צמחים (I) גדל בפיטוטרון. (J) N. העלים נקצרו ועובדו כמתואר ב D. (K) mab 2f5 טוהר מן התמצית הבהיר באמצעות עמודות זיקה dfe (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

טיהור של נוגדנים חד שבטיים (mAbs) מושגת בדרך כלל על ידי חלבון כרומטוגרפיה זיקה, אשר יכול להסביר עד 25% מעלויות התהליך הכולל. אלטרנטיבי, שלבי הלכידה החסכונית הם אפוא רב ערך עבור ייצור בקנה מידה תעשייתי, שבו כמויות גדולות של mAb יחיד מיוצרים. כאן אנו מציגים שיטה עבור השתק של האפיפי המבוססת על הצלב האדום המבוסס על שרף משני מקושר המאפשר לכידת סלקטיבית של הנוגדן לנטרול האיידס 2F5 מפני תמציות צמחים גולמי מבלי להשתמש בחלבון A. האפיפי הליניארי ELDKWA היה התמזגו לראשונה גנטית לחלבון הפלורסנט DsRed וחלבון ההיתוך התבטא בטבק טרנסגניים (טבק טבאקו) צמחים לפני טיהור על ידי קיבוע מתכת-יון כרומטוגרפיה זיקה. יתר על כן, שיטה המבוססת על התקפה צולבת מקושרת שהופעלה הייתה ממוטבת לדחיסות גבוהה, לצימוד יעיל ולעלויות נמוכות. הרכב ה-pH והאגירה והריכוז המיסיסים היו הפרמטרים החשובים ביותר במהלך הליך הצימוד, ששופר באמצעות גישת עיצוב-ניסויים. שרף האהדה שנוצר נבדק על יכולתה לאגד באופן סלקטיבי את mAb היעד בתמצית צמח גולמי המאגר ממוטב עבור התאוששות גבוהה mAb, פעילות המוצר ויציבות שרף אהדה. השיטה יכולה בקלות להיות מותאמת לנוגדנים אחרים עם אפיסקופים ליניאריים. האפוקסידיות החדשות מאפשרות הגבלות על המצב העדין יותר מאשר חלבון A ויכול גם להקטין את העלויות של שלב הלכידה הראשונית עבור ייצור mAb.

ביטוי וטיהור של הזיקה ליגולי
DFE חלבון היתוך ביטא בצמחי טבק טרנסגניים גדל בחממה. התשואה היה ~ 120 mg · ק"ג-1 עלה המסה עם ביומסה ממוצע של ~ 130 g לכל צמח. הטוהר DFE היה < 5% של כפית תמציות צמחים גולמי לפני השמיכה אבל עלה ל ~ 40% לאחר הטיפול בחום ב 70 ° c עבור 1.5 דקות, אשר זירז > 97% של החלבונים תא מארח. הצעד השוטף היה משולב בקלות לתוך שגרת הקציר והחילוץ (איור 1) ולקח פחות מ 2 h של זמן נוסף, כולל הקמת אמבט מים. ההתאוששות הכללית של DFE היה 23.5 mg ק"ג1 עם טוהר של > 90%. השלבים האחראיים על אובדן המוצר היו מחולטים, עומק סינון ו-IMAC, עם הפסדים ספציפיים של 40%, 27% ו 45%, בהתאמה. קיבולת מסנן עומק היה בממוצע 135 ± 36 L m-2 (± SD, n = 3) ולכן בטווח העליון של ערכים שדווחו בספרות21. התשואה של DFE גדלה עם גיל הצמח (איור 2).
שינזציה של הזיקה לליבטורים בעלי כרומטוגרפיה מופעלים
במהלך בדיקות צימוד הראשונית, מצאנו כי מאגר HEPES (pH 8.3) הגביר את היעילות צימוד ל 89 ± 6% (± SD, n = 3) לעומת 78 ± 9% (± SD, n = 3) עבור מאגר ביקרבונט מומלץ על ידי היצרן. לכן, HEPES שימש עבור כל הניסויים הבאים צימוד. גישה DoE נבחרה כדי למטב את היעילות הצימוד של DFE לתוך שרף המופעל חוצה מקושרת מקושרת. כמות מוחלטת של DFE קיבוע על שרף גדל עם מסה של DFE מוזרק לתוך העמודה ו plateaued ב ~ 15 g · L-1 ואילו התשואה הצימוד נדחתה ברציפות כמו dfe הוזרק יותר (איור 2). התשואה הצימוד היתה גם > 50% נמוך יותר במאגר חומצי, המציין את הצורך למסך עבור תנאי צימוד מתאימים לכל ליגעל בסיס מקרה אחר. התנאים האידיאליים במונחים של תשואה צימוד, כמות מוחלטת של מקיבוע DFE ועלויות עמודה זוהו באמצעות כלי אופטימיזציה מספריים של התוכנה DoE. התנאים הרצויים ביותר (pH 9.0 ו 7.0 mg של DFE עבור 1 מ ל של שרף מקושר החוצה) היו ממוקמים על מישור גדול היו ולכן חזקים. מולקולות DFE שמר את הזריחה האדומה שלהם גם לאחר צימוד, ואת עוצמת הצבע התכתב הסכום הכולל של מקיבוע DFE (איור 2). לפיכך, ניתן להשתמש בצבע עמודה כפרמטר בקרת איכות פשוט כדי להעריך את יעילות הצימוד ואיכות העמודה. הזריחה אישרה גם כי חלבון היתוך DFE התאספו במצב tetrameric של מקורי DsRed.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> איור 2: אופטימיזציה של DFE השתק המופעל מקושרת החוצה שרף agarose. (א) הצפות ג'ל עם כיסוי בציפוי מערבי של דגימות הומוגניות והימנעות מתמציות צמחים dfe בלתי מאוגדים ומתיגנים. קציר של צמחים בוצע 38, 45 או 52 ימים לאחר זריעה. בלוטים מערביים בוצעו באמצעותשישהנוגדנים5. (ב) הסכום הכולל של ביחד אהדה dfe ובתלות אם צימוד pH ומסה כוללת של dfe מטוהרים מוזרק על עמודים המופעל חוצה מקושרות. נקודות אדומות מציינות את הניסויים בפועל שבוצעו כדי לבנות את מודל פני התגובה. (ג) dfe מעמודות אהדה לאחר הליך הצימוד. המספרים תואמים לתנאי הצימוד המסומנים בלוח B. dps = ימים שלאחר זריעה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בדיקת בידוד 2F5 באמצעות שרף של זיקה DFE
הנוגדן רקומביננטי 2F5 הופק באכזריות טבק benthamiana צמחים גדל ב פיטוטרון5. לכידת 2F5 מתוך תמצית צמח גולמי נבדק באמצעות עמודות אהדה ביחד עם ~ 7.0 mg מטוהרים DFE (שלב 6). הימנעות חלבון שרפים בדרך כלל כרוך מאגר חומצי (pH ~ 3.3)13. לכן, בתחילה הערכנו מאגרי הימנעות מסוגים שונים של pH (pH 6.0 – 3.25) עבור עמודות DFE. הימנעות של 2F5 היה מוצלח ב-pH ערכים מתחת 4.5 עם ההתאוששות הגבוהה ביותר של ~ 35% ב-pH 3.25. עם זאת, משחרל-pH נמוך מופעל הן את הנוגדן (כפי שאושר על ידי spr ספקטרומטריה) ו-dfe ליגנד (כפי שמצוין על ידי אובדן של צבע ו dfe התחתון, איור 3). האחרון הוענק לאחר שהדוברים המקומיים בשנת pH < 4.022,23. כדי למנוע מוצר וליגציה, בדקנו מגנזיום כלוריד כסוכן מתחמק חלופי משום שהוא בעבר השתמשו כדי elute mAbs מאשר שרפים אהדה אחרים24. ריכוז מגנזיום כלוריד של 1.25 M היה מספיק כדי elute 2F5 מתוך שרף של זיקה DFE עם שחזור של 105 ± 11% (± SD, n = 3) וטוהר של 97 ± 3% (± SD, n = 3). הופעה זו הייתה דומה לחלבון שרפים25,26. קבוע הדיסוציאציה של שיווי משקל (KD) של dfe מטוהרים 2F5 נוגדן ו ליגלון סינתטי ו fuzeon היה 791 pM ואילו של מקבילה חלבון A-מטוהרים היה 763 pM5. יתר על כן, אובדן צבע משמעותי נצפתה בשרף על סך של 25 מחזורי bind ו-elute. DBC של שרף של זיקה DBC ב 10% 2F5 פריצת דרך ירד בצורה לינארית במהלך 25 מחזורים ל ~ 15% מהערך ההתחלתי (איור 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> איור 3: בדיקת הבידוד של 2F5 מתוך תמציות צמחים מובהר באמצעות שרפים זיקה DFE. (א) האהדה dfe שרפים לאחר מחזור אחד הימנעות באמצעות מאגרים עם ערכי pH שונים בטווח 4.0 – 3.0 ושרפים אותו לאחר שלב ניטרול ב-ph 6.0. (ב) dfe שרפים אהדה אחרי אחד ושישה מחזורים של טיהור 2F5 באמצעות 1.25 m או 4.00 m מגנזיום כלוריד. (ג) כרומטוגרמות של ניסויי העמסה פרונטלית (עקומות פריצה) כדי לקבוע את יכולת האיגוד הדינמי התלוי במחזור של שרף dfe באמצעות מגנזיום כלוריד כחומק. עקומות הפריצה נמדדו עבור 4.0 M ו 1.25 מאגרי מגנזיום כלוריד M ו מספרי מחזור שונים. (ד) מחזור התלוי ביכולת האיגוד הדינאמי של dfe באמצעות 1.25 מ' מגנזיום כלוריד כחומק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

בהליך זה, מבוסס על מעטפת המבוססת על DsRed-בסיס להפקת שרף מיוחד בררני ללכידת נוגדנים חד-שבטיים מתמציות צמחים גולמי או סופרנטנמלים של תרבות התאים, כחלופה לחלבון A.

הופעל מקושרת צולבת מקושרת לפיתוח מהיר של שרפים כרומטוגרפיה של אהדה-לכידת נוגדן כמחקר מקרה

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

נוגדנים חד שבטיים שולטים בשוק הביופארמה ומטוהרים בדרך כלל על ידי כרומטוגרפיה של Protein A. על פי שרפין הוא נהג עלות מרכזי במהלך הייצור המשפיעים על המחיר של טיפולים מבוססי נוגדנים. כאן אנו מתארים ליגנד זיקה חדש המבוסס על חלבון פלואורסצנטי שנקרא כנשא עבור האפיטופ ליניארי של HIV נטרול נוגדן 2F5.באופן כללי השיטה שלנו מאפשרת את הדור המהיר של שרפי כרומטוגרפיה זיקה אשר ניתן להשתמש בהם ללכידת נוגדנים חד שבטיים. הדגמנו יכולת זו על ידי לכידת נוגדן 2F5 מתמצית צמחים גולמיים. יטבנו את תנאי הלכידה ואת מאגר התניות כדי לשפר את קיבולת הכריכה הדינמית ואת יכולת השימוש מחדש של האם.שרף שלנו מאפשר בדרך כלל תנאים רופפים יותר מאשר חלבון A ויש לו פוטנציאל להפחית את עלויות הטיהור של נוגדנים חד שבטיים. יתר על כן, ניתן להתאים את האשף בקלות לנוגדנים אחרים שנקשרים לאפיטופים ליניאריים. כדי להתחיל בהליך זה, להתאים את הריכוז של פתרון ליגנד זיקה מוכן, כך שהוא בטווח של 5 עד 15 גרם לליטר כפי שהוגדר על ידי תכנון הניסויים.אחסן את הפתרון בקרח עד שתגובת הצימוד תהיה מוכנה. לאחר מכן, מלא מזרק אחד של שני מיליליטר בפתרון DFE. ולהכין מתאם כדי לטעון את המזרקים על עמודי אגרוז מופעל NHS עם נפח המיטה של מיליליטר אחד.עבור כל 10 עמודות המשמשות לת צימוד, הכן 30 מיליליטר של פתרון השבתה, 30 מיליליטר של פתרון pH נמוך, ופתרון אחסון של מיליליטר אחד. ואז להכין 20 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית מילימולרית אחת בצינור. ולהחגירה אותו על קרח לפחות 20 דקות.הכן קנה מידה מדויק כדי לפקח על הזרימה דרך שברים עבור כל השלבים במהלך תגובת הצימוד. לאחר מכן, פתחו עמוד אגרוז אטום המופעל על ידי NHS. החל טיפת מאגר על כניסת המתאם, כדי למנוע כניסת אוויר לעמודה.תן את מתאם המזרק בהיכנס העמודה. לשטוף את העמוד עם שישה מיליליטר של קרח קר חומצה הידרוכלורית מילימולרית אחת, בקצב זרימה פחות ממיליליטר לדקה. באמצעות מזרק שני מיליליטר, מיד להזריק 1.5 מיליליטר של פתרון DFE בקצב זרימה פחות ממיליליטר לדקה.ולאסוף את הזרימה דרך שבר בסולם דיוק לניתוח הבא. אוטמים את העמוד בשני הקצוות ו דגירה במשך 15 עד 45 דקות, ב 22 מעלות צלזיוס. הבא להזריק שישה מיליליטר של פתרון ההפעלה, ואחריו שישה מיליליטר של פתרון pH נמוך, בקצב זרימה פחות ממיליליטר לדקה, להסיר ליגנדים שאינם קשורים באופן קווולנטי מן השף.להזריק שישה מיליליטר של פתרון ההפעלה, ולהחדיר את העמודה במשך 15 דקות. לאחר מכן, להזריק שישה מיליליטר של פתרון pH נמוך לתוך העמודה. ואחריו שישה מיליליטר של פתרון ההפעלה.ואז להזריק עוד שישה מיליליטר של פתרון pH נמוך לתוך העמודה. להזריק שני מיליליטר של פתרון אחסון לתוך העמוד, ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. ראשית להכין 100 מיליליטר של תמצית הצמח המובהר המכיל 2F5, או supernatant עבור מערכת ביטוי מבוסס תא המועדף, אשר מכיל גם 2F5.לאחר מכן הכינו את מאגר האקוויוויליגציה ואת מאגר האשליות בעל חוזק X מברזל גבוה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. רוקן את מערכת הכרומטוגרפיה עם המאגרים. תן עמודת זיקה ל- DFE במערכת הכרומטוגרפיה.ולהאזין עם חמישה קורות חיים של חיץ שיווי משקל, בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לפקח על ספיגת UV ב 280 ננומטר. לאחר מכן לטעון 80 מיליליטר של תמצית הצמח הבהיר, או על טבעי על העמוד בקצב זרימה של 5 מיליליטר לדקה.כדי להבטיח זמן יצירת קשר של שתי דקות. לאסוף את הזרימה דרך דגימות בשני שברים מיליליטר או שחזור עקומה פריצת דרך. לאחסן את הזרימה דרך דגימות בארבע מעלות צלזיוס, אם ניתוח מדגם מיידי אינו אפשרי.לאחר מכן לשטוף את העמודה עם 6CV של מאגר שיווי משקל. לאסוף מדגם בתחילת, באמצע ובסוף לשטוף. לדלל את MAB2F5 עם חמישה כרכים של חיץ אשליה חוזק יוני גבוה.לאסוף את שבר DFE כאשר אות UV ב 280 ננומטר גדל לחמש יחידות ספיגה מילי מעל קו הבסיס. מטב את מאגר האשליות עבור כל זוג נוגדני אפיטופ, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חלבון ההיתוך DFE מתבטא בצמחי טבק מהו מהודרים, הגדלים בחממה.ההתאוששות הכוללת של DFE היא 23.5 מיליגרם לקילוגרם. עם טוהר של מעל 90%הכמות המוחלטת של DFE משותק על בשרף עולה עם המסה של DFE מוזרק לתוך העמודה, ומישורים בסביבות 15 גרם לליטר, ואילו התשואה צימוד יורדת ברציפות כמו DFE יותר מוזרק. מולקולות DFE נראים כדי לשמור על florescence האדום שלהם, גם לאחר צימוד.עוצמת הצבע תואמת לכמות הכוללת של DFE משותק. לכן צבע העמודה יכול לשמש כמטר בקרת איכות פשוט כדי להעריך את יעילות הצימוד ואת איכות העמודה. נוגדן 2F5 רקומביננטי מיוצר באופן חולף בצמחי Nicotiana benthamiana הגדלים בפיטוטרון.לכידת 2F5 מתמצית הצמח הגולמי, נבדק באמצעות עמודות זיקה, יחד עם כ 7 מיליגרם של DFE מטוהרים. ריכוז מגנזיום כלוריד של 1.25 טוחנת מספיק כדי לחמק 2F5 מן שרפי הזיקה DFE עם התאוששות קרוב 100%ו טוהר של כ 97%אשר דומה שרפי חלבון A. DBC של שרפי זיקה DFE ב 10%2F5 פריצת דרך, יורד באופן ליניארי במהלך 25 מחזורים, על כ 15% מהערך הראשוני.השתמשנו בגישה של ניסויים כדי לייעל את יכולת הצימוד של ליגנד הזיקה שלנו. תנאים אלה יכולים להיות מכוונים היטב עבור ליגנדים אחרים בעתיד. השיטה שלנו משתמשת בחלבון פלורסנט כדי להשחיל חלבון נושא משנה עבור ליגנד ספציפי למוצר.יחד עם זאת פשוט להוסיף פונקציות כאינדיקטור איכות חזותית של הליך הגיוס, מתן משוב מיידי ואינטואיטיבי למפעיל.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

גישה קלילה ויעילה לייצור ההפיך דיסולפיד צולב Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop. מרותק למיטה כרומטוגרפיית זיקה מתכת, שיחזור ותייגת וזמינותו של Polyhistidine Metalloenzyme עבור המעבדה לתואר ראשון

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

נחישות מהירה של זיקה נוגדנים אנטיגן על ידי פוטומטריה המונית

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

ייצור ללא תאים של פרוטאוליפוזומים לניתוח פונקציונלי ופיתוח נוגדנים המכוונים לחלבוני ממברנה

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

פיתוח רצועה חיסונית של זרימה רוחבית לגילוי מהיר וכמותי של תרכובות מולקולות קטנות

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...