Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

우리는 담배 발현 벡터를 제공하기 위한 형질전환 담배 식물과 토마스 라데마허 박사를 재배한 이브라힘 알 아메디(Ibrahim Al Amedi)에게 인정하고 싶습니다. 저자는 DFE 친화성 리간드 구조에 대한 유익한 토론에 대한 편집 지원과 마르쿠스 색 박사에게 감사하고 자합니다. 이 작품은 그랜트 번호에서 프라운 호퍼 - Gesellschaft 내부 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다. 125-600164를 유치하고 Leistungszentrum 부여 번호 423 "네트워크, 적응 생산"에서 노스 라인 - 웨스트 팔리아의 상태를 유치 할 수 있습니다. 이 작품은 연구 교육 그룹 "종양 표적 약물 전달"교부금 331065168의 프레임 워크에서 도이치 Forschungsgemeinschaft (DFG)에 의해 지원되었다. GE 헬스케어는 이 문서의 오픈 액세스 출판을 지원했습니다.

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

새로운 친화성 수지의 적용
우리는 mAb의 포획을 위한 사용자 정의 친화성 크로마토그래피 수지가 NHS 활성화된 가교 아가로즈에 mAb 특이적 에피토프를 포함하는 리간드를 고정시킴으로써 제조될 수 있음을 보여주었다. 이러한 수지를 설계하기 위해서는 에피토프 서열을 알고 선형 에피토프를 사용해야 했습니다. 생성된 수지는 잠재적으로 고가의 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계를 대체할 수 있기 때문에 mAbs의 포획에 유리하다. 우리의 사례 연구에서 2F5와 DFE 사이의 상호 작용은 에피토프-파라토프 결합에 의해 매개되었기 때문에, 우리의 리간드는 대부분의 뮤린과 인간 IgGs의 Fc 영역에 결합하는 단백질 A보다 더 선택적이어야 합니다. 개별 리간드가 각 mAb에 필요하기 때문에, 우리의 방법은 처음에 아주 큰 규모로 생성되는 항체를 위해 주로 적당한 것처럼 보일 수 있습니다. 그러나, 우리의 접근법과 신속한 식물 기반 과도 단백질 발현을 결합함으로써, 새로운 친화도 리간드를 최소한의 노력으로27주 이내에 제조할 수 있다28. 따라서, 이 방법은 또한 소규모 mAb 정제에 적합하다.
선호도 리간드의 생산 및 잠재적 개선
식물은 우리의 사례 연구에 등장하는 DFE 융합단백질과 같은 친화 리간드 5,29,30에대한 빠르고 안전한 생산 플랫폼을 제공합니다. 식물 재료를 희게하는 것은 한 단계로 숙주 세포 단백질의 양을 크게 감소시키고 표준 설명 루틴에 쉽게 통합되었습니다. 그러나, 리간드의 회수는 다른제품(31,32,33)에대해 보고된 바와 같이, 필터 층에 대한 적당한 열 안정성 및 일부 비특이적 결합으로 인해 현재 설정에서 낮았다. 열 안정성을 높이기 위해 담체를 엔지니어링하는 것은 말라리아 백신 후보CCT, 항종양 효소 PpADI 또는 중증 β-글루코시다아제(34)에 대해 설명한 바와 같이 향후 리간드 수율을 개선하는 데 도움이 될 수있다. 35,36. 단백질 공학이 필터 물질(37)에 대한 비특이적 결합을 감소시키는 데도움이 될 수 있는 깊이 여과 단계에 대해도 마찬가지입니다. DFE 및 유사한 리간드에 대한 생산 비용은 또한 응집제 또는 필터 첨가제를 사용하여 해명의 전반적인 효율을 향상시킴으로써 감소될 수 있었다38,39.
DsRed가 캐리어로 사용될 때, 그것은 테트라메릭 복합체를 형성한다. 이는 리간드당 에피토프의 수를 증가시키기 때문에 유리하지만, 또한 친화성 크로마토그래피 동안 분해 또는 변성에 더 취약한 리간드를 렌더링할 수 있다. mCherry와 같은 단모성 담체 단백질은 따라서 낮은 pH40에서안정하기 때문에 바람직할 수 있으며, 에피토프의 탠덤 반복을 포함하면 리간드의 열이도가 증가하고 따라서 수지 용량5를 증가시킬 수있습니다. 26세 , 41. 간단한 담체 에피토프 단백질 (즉, 이황화 결합 또는 번역 후 변형이없는 단백질)의 경우 미생물 생산 시스템은 제조 비용을 줄이고 단백질 A와 리간드를 더 경쟁력있게 만들 수 있습니다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질은 ~1 g/kg-1 바이오매스의 수율을 가진 세균 세포에서 발현되어 왔으며, 이는 리간드 생산 비용42를현저히 감소시킬 것이다.
발현 숙성에 관계없이, 수지 선택성 및 용량을 감소시킬 수 있는 숙주 세포 단백질 또는 매질 성분의 고정을 최소화하기 위해 커플링 동안 정제된 친화도 리간드가 요구되었다. IMAC 정제를 위한 폴리 히스티딘 태그의 포함은 순도를 한 단계에서 ~90%로 증가시키고, 신속하고저렴한 리간드 생산을 용이하게 하고,43,44. 그러나, 융합 태그의 위치는 에피토프 결합을 약체적으로 방해하거나 담체(45,46)로부터태그 또는 에피토프의 절단을 유도할 수 있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 중요하다.
NHS 활성화 크로마토그래피 컬럼에서 친화성 리간드의 고정화
고정화는 수동으로 또는 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행되었다. 열당 버퍼 볼륨이 작아서 수동 처리(예: 최소 폐기물 볼륨으로 인해)가 선호되는 것처럼 보였습니다. 그러나 여러 개의 더 큰 컬럼이 필요한 경우 크로마토그래피 시스템은 커플링 조건을 보다 쉽게 제어할 수 있게 하고(예: 규제 된 유량) DBC 측면에서 재현 가능한 결과를 얻을 가능성이 높습니다. 우리의 데이터는 결합 버퍼와 pH가 결합 효율성과 전체 컬럼 비용에 중요한 영향을 미친다는 것을 시사합니다. 결합 반응에 영향을 미치는 스크리닝 인자와 각 담체 단백질(또는 각 담체-리간드 융합)에 대해 조정하면 결합 효율 및 수지 성능이 향상될 수 있으며 이 접근법을 권장합니다.
DFE 선호도 수지사용 2F5 절연 테스트
제품 수율 과 순도는 수지 성능의 중요한 측면이며, DFE의 경우 우리는 105 ± 11 % (±SD, n = 3)의 수율과 97 ± 3 % (±SD, n = 3)의 순도를 달성했으며, 이는 벤치 마크 단백질 A 수지25의 성능과 비교할 수 있습니다. ,26. 일반적으로 수지의 또 다른 핵심 성능 지표 (특히 선호도 리간드를 기반으로하는 경우)는 이 매개 변수가 특정 공정에 필요한 수지의 양과 따라서 비용에 영향을 미치기 때문에 10 % 제품 혁신에서 DBC입니다. DFE 리간드의 경우, 초기 DBC는 ~4 g·이었다. L-1 수지는 유사한 조건하에서 단백질 A에 대한 해당 값의 ~13%(접촉 시간 2분)인25,47, 또는 다른 맞춤형 선호도 수지에 비해 약 15배 더 높다. 반대로 FSH-면역affinity 리간드 2 분48의동일한 체류 시간을 사용하여. DFE의 DBC는 25번의 바인드 및 용질 주기 후에 시작 값의 15%로 감소하였고, 반면 상업적 단백질 A 수지49에서동일한 DBC 손실에 대해 50사이클 이상이 요구된다. 그러나, 우리의 운반체는 아직 포괄적인 조사하고 지난 4 년간 8에 걸쳐 향상된 단백질 A와 같은정도로 최적화되지 않았다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.
지금까지 우리는 이전 연구13에서권장하는 바와 같이 저pH 용출 완충제에서 고농도의 염화마그네슘으로 전환함으로써 수지 안정성 및 제품 회수를 향상시켜 있다(도 3). 친화성 리간드의 특징적인 적색은 25번의 바인드 앤 드 루트 사이클 동안 실질적으로 퇴색하지 않았기 때문에, 우리는 정제된 식물 추출물(31)에서 내인성 식물 프로테아제(31)가 잘리되어 에피토프를 불활성화시킬 수 있다고 추측한다. 리간드. 따라서 캐리어와 에피토프를 연결하는 프로테아제 내성 링커를 설계하면 연장된 수의 사이클에 걸쳐 초기 DBC를 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. DFE 리간드의 신속하고 간단한 발현 및 정제, 상업용 크로마토그래피 수지에 대한 간단한 결합, 우수한 제품 수율 및 순도를 감안할 때, 우리는 우리의 방법이 단백질 A에 적합한 대안을 제공한다고 믿습니다. 단백질 A에 결합하지 않는 mAbs 및 항체 유도체의 정제, 특히 담체 및 링커의 개선이 DBC 및 리간드 안정성을 향상시킬 수 있는 경우. 이러한 가정은 DFE-정제 및 단백질 A-정제 2F5 항체 5의 해리 상수의작은 차이에 의해 뒷받침되었으며, 이는 우리의 새로운 친화도 리간드가 고품질 mAbs의 회복을 허용함을 나타낸다.
방법의 이점 및 현재 제한 사항
반송파 단백질과 의 유전 적 융합으로 친화성 리간드를 제조하는 것은 수성 완충제에서 용해도를 증가시키고 따라서 전형적인 리간드 커플링 조건과의 호환성을 증가시킨다. 대조적으로, 고체 상 펩티드 합성으로부터 유래된 빈 펩타이드는 그들의 서열(50)으로 인해 이러한 조건 하에서 제한된 용해도를 가질 수 있으며, 이는 mAb에 의해 인식된 에피토프의 아미노산 서열에 의해 결정되기 때문에 변경될 수 없다. 정제될 수 있습니다. 그 외는 그러므로 펩티드 리간드(51)의 온-수지 합성을 사용하였다. 생성된 수지의 정적 결합 용량이 높았습니다(~80g· L-1)수지 제제의 과정은 길고, 동적 결합 용량은 보고되지 않았고, 얻어진 순도 및 회복은 우리의 접근법보다 낮았다. 실험실 규모에서 융합 단백질 리간드의 또 다른 장점은 리간드 및 이의 변이체가 사용하기 쉬운 고-경발시스템에서최소한의 노력으로 빠르게 생산, 정제 및 테스트될 수 있다는 것이다.
여기에 제시된 방법의 두 가지 현재 제한사항은 3g·의 낮은 동적 결합 용량이다. L-1 및 25 바인드 및 용출 주기 의 과정을 통해 90 % 감소5. 이러한 제한 사항은 보다 엄격한 적재 조건을 적용하고 현재 DsRed 캐리어를 각각 보다 안정적인 엔지니어링 변형으로 대체하여 향후 해결될 수 있습니다. 예를 들어, 현재 접촉 시간을 2~4분으로 두 배로 늘리면 일부 단백질 A 수지(26)에 대해 도시된 바와 같이 동적 결합 용량을 두 배로 늘릴 수 있다.
문제 해결
다음 표에서는 이 프로토콜 중에 발생할 수 있는 잠재적인 문제를 중시하고 이를 해결하는 방법에 대한 힌트를 제공합니다(표 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">표 1: 발생할 수 있는 잠재적인 문제 및 가능한 수정.</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로토콜 단계</td>
			<td>문제</td>
			<td>Couse</td>
			<td>수정</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>식물은 성장하지 않습니다</td>
			<td>손상된 성장 조건</td>
			<td>비료의 pH 및 전도도 를 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>온도 및 조명 조건 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 및 3</td>
			<td>추출 후 대량의 숙주 세포 단백질이 존재합니다.</td>
			<td>불완전한 강수량</td>
			<td>희게하는 동안 온도 를 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>희게 목욕의 동요를 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 및 3</td>
			<td>식물 추출물에서 발견된 제품이 없습니다.</td>
			<td>온도가 너무 높음</td>
			<td>희게하는 동안 온도와 pH를 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>희게 버퍼의 pH가 너무 낮음</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>추출 후 큰 줄기 또는 잎 부품이 남아 있습니다.</td>
			<td>블렌더의 불완전한 혼합</td>
			<td>식물 재료가 블렌더에 플러그를 형성하지 않는지 확인하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>깊이 여과 중 빠른 압력 증가</td>
			<td>잘못된 필터 선택 및/또는 방향</td>
			<td>필터 유형 및 방향 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>용출 시 약간의 융합 단백질/많은 융합 단백질이 유입</td>
			<td>IMAC 수지는 금속 이온으로 충전되지 않았습니다.</td>
			<td>IMAC 수지가 이온으로 올바르게 충전되었는지 확인합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>융합 단백질은 친화성 태그를 분실</td>
			<td>식물 재배 중 강렬한 햇빛과 고온을 피하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>농축 중 손실된 융합 단백질</td>
			<td>막에 결합된 융합 단백질</td>
			<td>멤브레인 유형 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>농도 계수가 너무 높지 않은지 확인하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>낮은 커플링 수율</td>
			<td>결합 시약 추가의 잘못된 시퀀스</td>
			<td>시약 라벨 및 추가 순서 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>커플링 전에 열의 잘못된 준비</td>
			<td>열 예비의 조건을 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 및 6</td>
			<td>낮은 mAb 수율</td>
			<td>식물 바이오매스에서 의 낮은 mAb 발현</td>
			<td>바이오매스의 mAb 발현 테스트</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>낮은 리간드 밀도</td>
			<td>융합 단백질 제제의 순도 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>브래드포드 분석에서 매우 낮은 /고단백 농도</td>
			<td>파이펫팅 중 기포 형성</td>
			<td>96 웰 팔레트에서 거품 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>SPR 측정 중 낮은 mAb 농도</td>
			<td>손상된 단백질 A 칩</td>
			<td>표준 mAb의 결과와 알려진 농도 비교</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>잘못된 시료 희석</td>
			<td>희석 속도 및 버퍼 확인</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 트러블 슈팅.

바이오 의약품은 거의 모든 의학 분야에서 광범위한 질병 의 치료에중요합니다 1. 단일클론 항체(mAbs)가 바이오 의약품 시장을 장악하고 있으며, 2020년 전 세계 매출은 약 1,100억 유로에 달할 것으로 예상됩니다2. mAbs에 대한 선호하는 발현 플랫폼은 일반적으로 배양 상급3,4에서최대 10 g∙L-1의 높은 mAb 티터를 생성하는 중국 햄스터 난소 세포주이다. 그러나, 포유류 세포 배양물에서 mAbs의 생산은 배지의 높은 비용과 멸균 발효에대한 필요성 때문에 비싸다 5. 플랜트와 같은 대체 식 플랫폼은 잠재적으로 산업 제조를 위한 더 빠르고,간단하고, 저렴하고, 더 확장 가능한 접근 방식을 제공합니다 6,7.
포유류 세포 배양과 관련된 비용 외에도 제품 포획을 위한 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 광범위한 사용은 mAbs의 산업 생산을 위한 주요 비용 동인입니다. 단백질 A는 황색포도상구균 세포의 표면에서 자연적으로 발견되며 특정 뮤린 및 인간 항체의 결정화 물질(Fc) 영역에 결합하여, 체액성 면역 체계를회피하는 방어 메커니즘으로서 작용한다 8. 단백질 A는 세포 배양 과민제로부터 mAb의 포획을 위한 산업 금본위제가 되었으며, 또한 매우 선택적이기 때문에 연구 커뮤니티에서 널리사용되고 있으며, 전형적으로 단일 단계에서 ~95%의 mAb 순도를 달성한다. 당연히, 지난 2 년 동안 단백질 A의 판매는 밀접하게mAbs 8의 판매를 반영했다 . 생산 규모에 따라, 단백질 A의 비용은 총 공정 비용의 25 % 이상에 대응할 수 있으며, 그로 인하여 치료 mAbs의 시장 가격에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 최대 € 2,000 g-15,9일수 있습니다. 따라서, 유사한 정제 성능을 가진 대체 크로마토그래피 수지생산 비용을 실질적으로 절감할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 항체 기반 치료법을 더 많은 수의 환자에게 접근할 수 있도록하는10,11 ,12. 이러한 대안은 또한 잠재적으로 응집을 촉진 하는 형태 변화를 겪고 mAbs를 일으킬 수 있는 낮은 pH (일반적으로 <3.5)에서 가혹한 용출 조건을 포함 하 여 단백질 A 크로마토그래피의 단점을 우회할 수 있습니다13 . 중요한 것은, 단백질 A는 특정 IgG 서브클래스의 Fc 영역에 대해서만 선택적이므로 잘린 결합 도메인을 가진 비기능성 분자는 본래 제품5와병용화할 수 있는 반면, 단일 사슬 가변 단편과 같은 mAb 유도체는 단백질 A에 전혀 결합하지 마십시오.
여기서, 선형 에피토프 ELDKWA(1자 아미노산 코드)를 사용하여 HIV 중화 mAb 2F5의 포획을 위한 대체 친화성 크로마토그래피 수지를 5,14에기술한다. 우리는 2F5 에피토프를 운반체 및 리포터 분자로 작용한 형광 단백질 DsRed의 C-말단에 유전적으로 융합하고, 트랜스제닉담배에서 생성된 단백질 D sRed-2 F 5-E 피토프(DFE)를 생산했습니다. 니코티아나 타바쿰)식물. DFE는 단일 단계 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 정제되었다. 정제된 DFE 친화성 리간드를 가교 아가로즈 수지 상에 고정시켜 N-하이드록시수치니마이드(NHS)를 이용한 화학적 결합에 의해 달성되었다. 통계적 실험 설계는 그 후 고정 절차 및커플링 효율(15)을 최적화하는 데 사용되었다. mAb 2F5에 대한 정제 전략은 항체 순도, 수율 및 리간드 안정성 측면에서 평가되었다. Fc 영역을 결합하는 단백질 A와 는 달리, DFE는 2F5의 상보성 결정 영역에 결합되어, 손상되지 않은 파라토프를 가진 분자의 정제를 보장한다. 우리의 개념은 선형 에피토프를 가진 임의의 mAb또는 마이크로어레이 연구16에의해 용이하게 식별될 수 있는 다른 펩티드 계 친화도 리간드에 쉽게 적응될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> 도 1: 원유 식물 추출물 또는 세포 배양 과민제로부터 mAbs의 포획에 사용될 수 있는 에피토프 친화도 수지의 제조를 위한 공정 흐름 방식. (a) 친화성 리간드 DFE를 형질전환 담배 식물에서 발현하였다. 열 침전 단계(B)를 수확하기 전에 잎을 균질화(C)하기 전에 포함시켰다. (D) 조식물 추출물은 백 여과, 깊이 여과 및 0.2 μm 멸균 여과에 의해 정제되었다. (E) DFE는 IMAC에 의해 정제되었다. (F,G) 정제된 DFE 친화성 리간드는 EDC/NHS 활성화 가교 아가로즈 컬럼상에 고정화되었다. (H) T-DNA 인코딩 항체 2F5를 운반하는 세균 배양체는 식물론에서 자란 N. 벤타미아나 식물(I)에서 과도 발현을 위해 사용하였다. (J) 벤타미아나 잎을 D.(K) mAb 2F5에 기재된 바와 같이 수확 및 가공하여 DFE 친화성 컬럼(L)을 이용하여 정제된 추출물로부터 정제하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

단일 클론 항체 (mAbs)의 정제는 일반적으로 전체 공정 비용의 최대 25 %를 차지 할 수있는 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 달성됩니다. 따라서 비용 효율적인 대안적인 캡처 단계는 대량의 단일 mAb가 생산되는 산업 규모의 제조에 유용합니다. 여기서 우리는 단백질 A를 사용하지 않고 원유 식물 추출물로부터 HIV 중화 항체 2F5의 선택적 포획을 허용하는 가교 아가로즈 수지로 DsRed 기반 에피토프 리간드의 고정화를 위한 방법을 제시한다. 선형 에피토프 ELDKWA는 먼저 형광 단백질 DsRed에 유전적으로 융합되었고 융합 단백질은 고정화 금속 이온 친화도 크로마토그래피에 의해 정제되기 전에 형질전환담배(Nicotiana tabacum)식물로 발현되었다. 또한, 활성화된 가교 아가로즈를 기반으로 하는 방법은 높은 리간드 밀도, 효율적인 커플링 및 저렴한 비용으로 최적화되었다. pH 및 완충제 조성물 및 수용성 리간드 농도는 커플링 절차 동안 가장 중요한 파라미터였으며, 이는 실험 설계 접근법을 사용하여 개선되었다. 생성된 친화성 수지는 조식물 추출물에서 표적 mAb를 선택적으로 결합하는 능력에 대해 시험되었고 용출 버퍼는 높은 mAb 회수, 제품 활성 및 친화성 수지 안정성을 위해 최적화되었다. 이 방법은 선형 에피토프를 가진 다른 항체에 용이하게 적응될 수 있다. 새로운 수지에서는 단백질 A보다 더 부드러운 용출 조건을 허용하고 mAb 생산을 위한 초기 포획 단계의 비용을 절감할 수 있습니다.

친화성 리간드의 발현 및 정제
융합 단백질 DFE는 온실에서 자란 형질전환 담배 식물에서 발현되었다. 수율은 ~ 120 mg/kg-1 잎 질량이었고 식물당 평균 바이오매스는 ~130 g이었다. DFE 순도는 희게하기 전에 조식물 추출물에서 TSP의 <5%였지만, 1.5분 동안 70°C에서 열처리 후 ~40%로 증가하였고, 이는 숙주 세포 단백질의 >97%를 침전시켰다. 희게 하는 단계는 수확 및 추출 루틴에용이하게 통합되었고(도 1) 수조 설치를 포함하여 2시간 미만의 추가 시간이 걸렸습니다. DFE의 전반적인 회복은 23.5 mg kg1의 순도 >90%였다. 제품 손실을 담당하는 단계는 희게, 깊이 여과 및 IMAC였으며, 각각 40%, 27%, 45%의 특정 손실이 있었습니다. 깊이 필터 용량은 평균 135±36 Lm-2(±SD, n=3)였고, 따라서 문헌21에보고된 값의 상부 범위였다. DFE 수율은 식물 시대에따라 증가했습니다(그림 2).
NHS 활성화 크로마토그래피 컬럼에서 친화성 리간드의 고정화
초기 커플링 테스트 동안 HEPES 버퍼(pH 8.3)는 제조업체가 권장하는 중탄산염 완충제에 대해 78±9%(±SD, n=3)에 비해 결합 효율을 89±6%(±SD, n=3)로 증가시켰습니다. 따라서, HEPES는 모든 후속 커플링 실험에 사용되었다. DFE와 NHS 활성화 가교 아가로즈 수지의 결합 효율을 최적화하기 위한 DoE 접근법이 선택되었다. 수지에 고정화된 DFE의 절대량은 기둥에 주입되고 ~15 g에서 고원화된 DFE의 질량으로 증가한다· L-1은 커플링 수율이 더 많은 DFE가 주입됨에 따라 지속적으로 감소한 반면(도 2). 결합 수율은 또한 산성 완충액에서 >50% 더 낮았으며, 이는 사례별로 각 리간드에 적합한 결합 조건을 스크리닝할 필요성을 나타낸다. 결합 수율, 고정화 DFE 및 컬럼 비용의 절대 수량측면에서 이상적인 조건은 DoE 소프트웨어의 수치 최적화 도구를 사용하여 확인되었습니다. 가장 바람직한 조건(가교 아가로즈 수지의 1 mL당 DFE 의 pH 9.0 및 7.0 mg)은 큰 고원에 위치하여 견고하였다. DFE 분자는 커플링 후에도 적색 형광을 유지하고, 색 강도는 고정화 DFE의 총량에 해당하였다(도 2). 따라서 컬럼 색상은 커플링 효율 및 컬럼 품질을 추정하기 위한 간단한 품질 관리 매개 변수로 사용될 수 있습니다. 형광은 또한 DFE 융합 단백질이 네이티브 DsRed의 테트라메릭 상태에서 조립됨을 확인하.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> 도 2: NHS 활성화 가교 아가로즈 수지에 대한 DFE 고정화의 최적화. (A) LDS-PAA 젤은 불미스러운 형질전환 DFE 식물 추출물로부터 의 균질및 용출 샘플의 웨스턴 블롯 오버레이를 함유한다. 식물의 수확은 시종 후 38, 45 또는 52일 후에 수행되었다. 서양 얼룩은 항-그의 6-항체5를사용하여 수행되었다. (B) NHS 활성화 가교 아가로즈 컬럼에 주입된 정제된 DFE의 pH 및 전체 질량을 결합하는 경우 의존성에서 결합된 DFE 친화도 리간드의 총량. 빨간색 점은 응답 표면 모델을 작성하기 위해 수행된 실제 실험을 나타냅니다. (C) 커플링 절차 후 DFE 선호도 컬럼. 숫자는 패널 B. dps = 일 사후 시드에 강조 표시된 커플링 조건에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
DFE 선호도 수지사용 2F5 절연 테스트
재조합 2F5 항체는 식물론5에서 자란 니코티아나 벤타미아나 식물에서일시적으로 생산되었다. 조식물 추출물로부터 2F5의 포획을 ~7.0 mg 정제된 DFE와 결합된 친화성 컬럼을 사용하여 시험하였다(단계 6). 단백질 A 수지로부터의 용출은 일반적으로 산성 완충제(pH~3.3)(13)를 수반한다. 따라서, 우리는 처음에 DFE 컬럼에 대해 상이한 저pH 용출 버퍼(pH 0-3.25)를 평가하였다. 2F5의 용출은 pH 3.25에서 ~35%의 가장 높은 회수와 함께 4.5 이하의 pH 값에서 성공적이었다. 그러나, 저-pH 용출은 항체(SPR 분광법에 의해 확인된 바와 같이)와 DFE 리간드(색의 손실 및 하부 DBC, 도3)를 불활성화하였다. 후자는 pH & lt;4.022,23에서네이티브 DsRed 변성 주어진 예상되었다 . 제품 및 리간드 변성을 피하기 위해, 우리는 이전에 다른 친화도 수지(24)로부터mAbs를 용출하는 데 사용되었기 때문에 대체 용출제로 염화 마그네슘을 테스트했습니다. 염화마그네슘 농도가 1.25 M인 마그네슘 농도는 105±11% (±SD, n=3) 및 97±3%의 순도(±SD, n=3)의 회수와 함께 DFE 친화성 수지로부터 2F5를 용해시키기에 충분하였다. 이 성능은 단백질 A 수지25,26과비교되었다. DFE-정제된 2F5 항체와합성 리간드 푸제온의 평형 해리 상수(KD)는 791 pM이었던 반면, 단백질 A-정제 대응물의 경우 는 763 pM5였다. 더욱이, 총 25번의 바인드 및 용적 사이클에 걸쳐 수지에서 실질적인 색 손실이 관찰되지 않았다. DFE 친화성 수지의 DBC는 10% 2F5의 돌파구로 25사이클동안 선형적으로 감소하여 초기값의 ~15%로 떨어졌다(도 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> 그림 3: DFE 친화성 수지를 사용하여 정제된 식물 추출물로부터 2F5의 절연을 테스트합니다. (a) DFE 친화성 수지 는 pH 6.0에서 중화 단계 후 4.0-3.0 범위및 동일한 수지에서 상이한 pH 값을 가진 버퍼를 사용하여 1회 용출 사이클 후 수지. (B) DFE 친화성 수지 1 및 6 사이클 후 2F5 정제 1.25 M 또는 4.00 M 염화 마그네슘을 용리제로 사용한다. (C) 염화마그네슘을 용리물로 사용하여 DFE 수지의 주기 의존적 동적 결합 용량을 결정하기 위한 전두엽 하중 실험(브레이크스루 곡선)의 크로마토그램. 브레이크스루 곡선은 4.0 M 및 1.25 M 염화마그네슘 용출 완충제 및 다양한 사이클 번호로 측정되었다. (D) 염화마그네슘을 용리물로 사용하는 DFE의 주기 의존적 동적 결합 용량. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

이 절차에서, DsRed 계 에피토프 리간드는 단백질 A의 대안으로서 원유 식물 추출물 또는 세포 배양 과식제로부터 단일클론 항체를 포획하기 위한 고도로 선택적인 친화도 수지를 생성하기 위해 고도로 선택적인 친화도 수지를 생성한다.

선호도 크로마토그래피 수지의 신속한 개발을 위한 활성화된 상호 연결 아가로스 - 사례 연구로서의 항체 포획

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

단일 클론 항체는 바이오 의약품 시장을 지배하고 전형적으로 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된다. 에 따른 수지는 항체 기반 치료제의 가격에 영향을 미치는 생산 중 주요 비용 동인이다. 여기서 우리는 HIV 중화 항체 2F5의 선형 에피토프를 위한 담체로서 읽히는 형광 단백질을 기반으로 하는 새로운 친화성 리간드를 설명한다.일반적으로 우리의 방법은 단일 클론 항체의 캡처에 사용할 수있는 친화성 크로마토그래피 수지의 빠른 생성을 허용합니다. 우리는 원유 식물 추출물에서 항체 2F5를 포착하여 이러한 능력을 입증했습니다. 동적 바인딩 용량과 수지 재사용성을 개선하기 위해 캡처 조건및 솔루션 버퍼를 최적화했습니다.우리의 수지 단백질 A 보다 일반적으로 느슨한 조건을 허용 하 고 단일 클 론 항체의 정화 비용을 줄일 수 있는 잠재력을 가지고. 더욱이, 수지는 선형 에피토프에 결합하는 그밖 항체에 쉽게 적응될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 실험의 설계에 의해 정의된 대로 리터당 5~15그램의 범위에 있도록 준비된 친화성 리간드 용액의 농도를 조정한다.결합 반응이 준비될 때까지 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, DFE 용액으로 두 밀리리터 주사기를 채웁니다. 그리고 1 밀리리터의 침대 부피와 NHS 활성화 크로스 링크 아가로즈 컬럼에 주사기를 장착하는 어댑터를 준비합니다.커플링에 사용되는 10개의 컬럼마다 30밀리리터의 비활성화 솔루션, 30밀리리터의 낮은 pH 솔루션, 1밀리리터의 스토리지 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 튜브에 1 밀리머 염산의 20 밀리리터를 준비합니다. 그리고 적어도 20 분 동안 얼음에 배양.결합 반응 중에 모든 단계에 대해 분획을 통해 흐름을 모니터링하는 정밀 스케일을 준비합니다. 이 후 밀봉된 NHS 활성화 된 교차 연결된 아가로즈 열을 엽니 다. 공기가 열에 유입되는 것을 방지하기 위해 어댑터 입구에 버퍼 한 방울을 적용합니다.기둥 입구에 주사기 어댑터를 장착합니다. 차가운 1 밀리머 염산의 6 밀리리터로 컬럼을 씻어, 분당 1 밀리리터보다 적은 유량으로. 2 밀리 리터 주사기를 사용 하 여 즉시 분 당 1 밀리 리터 미만유량에 DFE 솔루션의 1.5 밀리 리터를 주입.그리고 후속 분석을 위해 정밀 척도에서 분획을 통해 흐름을 수집합니다. 양쪽 끝에서 열을 밀봉하고 섭씨 22도에서 15~45분 동안 배양합니다. 다음으로 활성화 용액의 6 밀리리터를 주입하고, 분당 1밀리리터 미만의 유량으로 6밀리리터의 낮은 pH 용액을 제거하고 수지에서 비공유 결합 리간드를 제거합니다.활성화 용액의 6 밀리리터를 주입하고 15분 동안 컬럼을 배양합니다. 이 후, 열에 낮은 pH 용액의 6 밀리리터를 주입. 그 다음으로 활성화 솔루션의 6밀리리터가 그 뒤를 잇습니다.그런 다음 낮은 pH 용액의 또 다른 6 밀리리터를 열에 주입합니다. 2 밀리리터의 저장 솔루션을 열에 주입하고 섭씨 4도에 저장합니다. 먼저 2F5를 함유하는 정제된 식물 추출물 또는 2F5를 포함하는 바람직한 세포 기반 발현 시스템에 대한 상퍼를 100밀리리터를 준비한다.다음으로 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 평형 버퍼및 고철 X 강도 환상 버퍼를 준비합니다. 버퍼로 크로마토그래피 시스템을 플러시합니다. 크로마토그래피 시스템에 DFE 선호도 컬럼을 마운트합니다.그리고 분당 1 밀리리터의 유량으로 평형 버퍼의 5 CV와 평형. 280 나노미터에서 UV 흡광도를 모니터링합니다. 그런 다음 정제된 식물 추출물 또는 1분당 5밀리리터의 유량으로 기둥에 상수체를 80밀리리터로 적재합니다.2분의 접점 시간을 보장합니다. 두 밀리리터 분획 또는 획기적인 곡선 재구성으로 샘플을 통해 흐름을 수집합니다. 즉각적인 샘플 분석이 불가능한 경우 샘플을 통해 4도에서 흐름을 저장합니다.이 후 평형 버퍼의 6CV로 열을 세척합니다. 세척의 시작, 중간 및 끝에 샘플을 수집합니다. 5권의 고이온 강도 환상 버퍼로 MAB2F5를 희석시다.280 나노미터의 UV 신호가 기준선 위의 5밀리 광흡수장치로 증가했을 때 DFE 분획을 수집한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 에피토프 항체 쌍에 대한 환상 버퍼를 최적화합니다. 융합 단백질 DFE는 온실에서 자란 형질전환 담배 식물에서 발현된다.DFE의 전반적인 복구는 킬로그램 당 23.5 밀리 그램. 90% 이상의 순도와 함께 수지에 고정된 DFE의 절대 양은 열에 주입된 DFE질량과 함께 증가하고, 고원은 리터당 약 15그램으로 증가하지만, 더 많은 DFE가 주입됨에 따라 결합 수율은 지속적으로 감소합니다. DFE 분자는 커플링 후에도 붉은 꽃집을 유지하는 것으로 보입니다.색상 강도는 고정된 DFE의 총 양에 해당합니다. 따라서 컬럼 색상은 커플링 효율 및 컬럼 품질을 추정하기 위해 간단한 품질 관리 매개 변수로 사용할 수 있습니다. 재조합 2F5 항체는 니코티아나 벤타미안 식물에서 식물성에서 자란 과도하게 생산된다.원유 식물 추출물에서 2F5를 포획한 후 친화성 컬럼을 사용하여 약 7밀리그램의 정제된 DFE를 사용하여 테스트됩니다. 염화물 농도가 1.25인 경우 DFE 친화성 수지로부터 2F5를 100%에 가까운 회복과 단백질 A 수지와 비교할 수 있는 약 97%의 순도로 충분하다. DFE 선호도 수지의 DBC는 10%2F5 돌파구로, 25사이클 동안 선형적으로 감소하여 초기 가치의 약 15%로 감소합니다.우리는 우리의 친화성 리간드의 결합 용량을 최적화하기 위해 실험 접근 방식의 디자인을 사용했다. 이러한 조건은 미래에 다른 리간드에 대해 미세 조정할 수 있습니다. 우리의 방법은 제품 특정 리간드에 대한 서브 캐리어 단백질을 스레드에 꽃 단백질을 사용합니다.동시에 동원 절차의 시각적 품질 표시기로 함수를 추가하여 작업자에게 즉각적이고 직관적인 피드백을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

연구

생화학

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

벤치탑 움직일 금속 친화성 크로마토그래피, 재구성 및 학부 실험실의 분석 결과 Polyhistidine의 태그 Metalloenzyme

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

소분자 화합물의 신속하고 정량적 검출을 위한 측면 흐름 면역크로모그래피 스트립 개발

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...