Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Vi vil gjerne anerkjenne Ibrahim Al Amedi for dyrking av transgene tobakk planter og Dr. Thomas Rademacher for å gi tobakk uttrykket vektor. Forfatterne ønsker å takke Dr. Richard M. Twyman for redaksjonell bistand og Markus Sack for fruktbare diskusjoner om DFE affinitet ligand struktur. Dette arbeidet ble finansiert delvis av Fraunhofer-Gesellschaft interne programmer under Grant no. Tiltrekke seg 125-600164 og staten Nord-Rhinen-Westfalen under Leistungszentrum Grant no. 423 "nettverk, adaptive produksjon". Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) i rammen av Research Training Group "tumor-målrettede Drug Delivery" Grant 331065168. GE helsetjenester støttet Open-Access publisering av denne artikkelen.

1. dyrke de transgene Tobacco planter
Merk: Utformingen av DFE Fusion protein og generering av transgene planter er beskrevet andre steder5,17.
<ol><li>Spire de transgene tobakk frøplanter i jord. Vanne plantene med en 1,0 g · L-1 gjødsel løsning. Overfør plantene til singel, 100 mm x 100 mm x 60 mm (lengde, bredde, høyde) Potter når de vokser til en diameter på ~ 0,04 m.</li>
	<li>Dyrke de transgene tobakk plantene i et drivhus med en 16-h photoperiod (25/22 ° c lys/mørke temperatur regime), med 70% relativ fuktighet og automatisert befruktning med en 1,0 g · L-1 gjødsel løsning for 15 min hver time.</li>
	<li>Etter 7 uker, høste alle blader unntatt de fire cotyledon blader ved foten av plante stammen. Umiddelbart behandle høstes bladene som beskrevet nedenfor.</li>
</ol>2. Heat nedbør av Host Cell proteiner
<ol><li>Sett opp et vannbad med et arbeidsvolum på 20 liter i et oppvarmet fartøy i rustfritt stål (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m). I starten plasserer du en magnetisk pumpe i vannbadet for å agitere væsken permanent med en strøm på 5 L min-1. Monter en justerbar termostat på vannbadet for temperaturkontroll (trinn 2,4 og 2,8). Forsiktig: Alle de følgende trinnene opp til 2,10 involverer håndtering av varm væske. Bruk egnet personlig verneutstyr, inkludert termisk isolerte hansker og vernebriller.</li>
	<li>Tilsett 15 L av deionisert vann til vannbadet og varm opp væsken til 70 ° c.</li>
	<li>Plasser en bøtte på 10 liter fylt med 5 liter deionisert vann på en magnetisk rører. Tilsett natrium fosfat til en endelig konsentrasjon på 120 mM. Juster pH til 8,14 ved hjelp av 10 M saltsyre. Når alle komponentene er oppløst, legger du til den resulterende konsentrerte blanchering buffer (5 L) i vannbadet fra trinn 2,2.</li>
	<li>Agitere vannbadet til temperaturen når 70 ° c. Bruk 10 M saltsyre for å justere pH til 8,14 om nødvendig. Fortsett agitating i minst 15 minutter etter ønsket temperatur og pH er nådd for å sikre at hele forsamlingen er i termisk likevekt.</li>
	<li>Klargjør en 20 L bøtte (0,3 m x 0,3 m x 0,3 m) fylt med deionisert vann ved en temperatur på ~ 17 ° c (nødvendig for trinn 2,9).</li>
	<li>Forbered 400 g alikvoter av høstet tobakk blader fra trinn 1,3. Plasser en alikvot i en perforert kurv (0,2 m x 0,2 m x 0,2 m; en pore bredde på minst 0,02 m x 0,02 m). Unngå å overfylling kurven med plantemateriale eller Pakk bladene for stramt for å unngå skade på vevet.</li>
	<li>Fullt Senk kurven i den varme blanchering buffer fra trinn 2,4 og sørg for at alle bladene forblir under væskeoverflaten. Bruk en thermostable silikon skjeen til å holde bladene under overflaten om nødvendig.</li>
	<li>Ruge tobakk bladene for 1,5 min i blanchering væsken mens pumpen er fortsatt agitating væsken. Overvåk væske temperaturen under hele inkubasjonsperioden. Unngå å blokkere pumpeinntaket med tobakksblader.</li>
	<li>Fjern kurven av tobakk blader fra blanchering buffer og avløp gjenværende buffer fra bladene i 30 s. Overfør kurven til bøtte fylt med kaldt vann (fra trinn 2,5) og dyppe bladene i 30 s. Fjern kurven og Tøm restvannet fra Aves for 30 s før homogenisering (trinn 3).</li>
	<li>Gjenta trinn 2,6 til 2,9 med ferske alikvoter fra 2,6 til hele høstes biomasse er behandlet. Kontinuerlig overvåke og justere pH og temperaturen i blanchering buffer i vannbad. Merk: Forvellet plantemateriale kan lagres på isen i opptil 30 min når flere blanchering sykluser er nødvendig for å behandle hele biomasse. Forvellet blader kan også oppbevares i vakuum forseglede poser ved – 80 ° c i minst 3 uker. Imidlertid anbefales umiddelbar behandling fordi langvarig lagring kan redusere DFE yield.</li>
</ol>3. protein utvinning og avklaring
Forsiktig: Følgende trinn involverer en blender med roterende kniver. Ikke arbeid i blender beholderen når den er slått på eller montert på motorenheten.
<ol><li>Plasser 150 g (våt masse) av forvellet tobakk blader (trinn 2,9) i blender fartøyet og tilsett 450 mL utvinnings buffer (50 mM natrium fosfat, 500 mM natriumklorid, 10 mM natrium disulfite, pH 7,5). Lukk blender lokket tett for å hindre søl av plantemateriale eller buffer.</li>
	<li>Homogenisere bladene for 3x for 30 s, med 30 s pauser mellom hver puls. Sørg for at alle bladene er homogenisert og at ingen holde seg til toppen av blender fartøyet. Om nødvendig, åpne blenderen under pausene og skyv ned bladene som stikker på den øvre delen av fartøyet, ved hjelp av en ren silikon skjeen.</li>
	<li>Etter homogenisering, ta en 1,0 mL prøve av homogenate for påfølgende analyse (trinn 7).</li>
	<li>Samle homogenate i et fartøy med tilstrekkelig størrelse (for eksempel ved arbeid med en total biomasse på 1,0 kg, bruk et fartøy med en kapasitet på minst 5 liter). Gjenta trinn 3,1 til 3,3 til alle forvellet biomasse er homogenisert.</li>
	<li>Monter et posefilter i et filter feste og Plasser et annet fartøy med tilstrekkelig størrelse (se 3,4) under monteringen. Påfør homogenate på posen filteret med en hastighet på ~ 0,15 L min-1. Ta prøver av posen Filtrer etter hver liter for påfølgende analyse (trinn 7) og måle turbiditet av posen Filtrer bassenget som en 1:10 fortynning i utvinnings buffer ved hjelp av en turbidimeter eller lignende enhet.</li>
	<li>Ytterligere avklare posen Filtrer bassenget med 0,02 m2 av en K700 (øverst) og KS50 (nederst) dybde filterlag kombinasjon per liter bag Filtrer pool. Påfør en strømningshastighet på 3,0 L min-1· m-2 opp til et maksimalt Trykk på 0,2 MPA. Deretter fjerner du rester av partikler ved å sende avklart Filtrer gjennom et sterilt 0,2 μm-filter som tidligere beskrevet5.</li>
</ol>4. rensing av DFE affinitet ligand
<ol><li>Forbered et raskt protein flytende kromatografi system ved spyling med eluering buffer (10 mM natrium fosfat, 300 mM imidazole, pH 7,4), vaskebuffer (10 mM natrium fosfat, pH 7,4) og likevekts buffer (20 mM natrium fosfat, 500 mM natriumklorid, pH 7,4). Monter en kolonne som inneholder ~ 50 mL chelaterande tverrbundet agarose harpiks per kilo blad biomasse (~ 2,5 L dybde Filtrer).</li>
	<li>Lad kolonnen med nikkel-ioner ved å påføre 5 Kol onne volumer (CV) på 200 mM nikkel sulfat oppløsning og vask den med 5 CV av eluering buffer. Bruk en strømningshastighet på 50 cm h-1 og Overvåk UV-signalene ved 260, 280 og 558 NM for alle påfølgende kromatografi trinn.</li>
	<li>Likevekt kolonnen med 10 CV med likevekts buffer. Deretter laste 50 CV av avklart plante ekstrakt (fra trinn 3,6) på betinget kolonne.</li>
	<li>Vask kolonnen med 10 CV vaskebuffer. Eluere det DFE smelting protein med 5 CV eluering buffer og samle produktet som inneholder brøk når UV-signaler på 280 NM og 558 NM har økt til mer enn 5 mAU over Baseline.</li>
	<li>Ta en 0,2 mL prøve fra eluering brøkdel for å måle den totale løselig protein (TSP) konsentrasjon (trinn 7,1), DFE konsentrasjon (trinn 7,2 og 7,3), og DFE renhet (trinn 7,4).</li>
	<li>Monter en kolonne som inneholder ~ 50 mL tverrbundet dextran harpiks på et kromatografi system. Likevekt kolonnen med 5 CV koblings buffer (200 mM HEPES, 500 mM natriumklorid, pH 8,5). Injiser 10 mL av DFE eluering brøkdel (trinn 4,4) for buffer utveksling og Overvåk UV-absorbansen ved 280 og 558 NM.</li>
	<li>Samle DFE som inneholder brøk når UV-signaler på 280 NM og 558 NM har økt til mer enn 5 mAU over grunnlinjen. Ta en 0,2 mL prøve og Bestem TSP-konsentrasjonen, DFE-konsentrasjonen og DFE-renheten (trinn 7).</li>
	<li>Konsentrer renset DFE prøven (fra trinn 4,7) til 15 g L-1 ved hjelp av en sentrifugal munnstykket rør ved 3 000 x g ved 4 ° c i 30 min i en sentrifuge. Fortsett med koplings reaksjonen (trinn 5). Merk: Oppbevar DFE-løsningen ved 4 ° c Hvis konsentrasjonen eller koplings trinnene ikke kan utføres umiddelbart.</li>
</ol>5. kopling DFE til aktivert kryss-koblet Agarose harpiks
Merk: Ikke Erstatt isopropanol som brukes til lagring av NHS-aktiverte søyler, før alt utstyr og alle løsninger for kopling er klart. Aldri la kolonnene renne tørt.
<ol><li>Setup en design av eksperimenter (DoE) modell for å optimalisere koplingen av DFE til den aktiverte harpiks, med pH, buffer sammensetning og DFE konsentrasjon som faktorer. Detaljene for DoE metoden er beskrevet andre steder15.</li>
	<li>Klargjør affinitet ligand løsning (fra trinn 4,8) i et konsentrasjons område fra 0,5 – 15 g · L-1 eller som definert i Doe og oppbevar den på isen til koplings reaksjonen er klar (trinn 5,5). Fyll minst 10 mL sprøyter med DFE-løsningen og klargjør en adapter for montering av sprøyter på NHS-aktiverte tverr tilknyttede agarose søyler med et Senge volum på 1,0 mL.</li>
	<li>For hver 10-kolonne som brukes til kopling, klargjør du 30 mL deaktivering løsning (0,5 M ethanolamine, 0,5 M natriumklorid, pH 8,3), 30 mL lav pH-oppløsning (0,1 M natrium acetate, 0,5 M natriumklorid, pH 4,0) og 10 mL lagringsløsning (0,05 M Disodium fosfat , 0,1% (m/v) natrium Natriumazid, pH 7,0).</li>
	<li>Forbered 20 mL 1 mM saltsyre i et rør og ruge den på is i minst 20 min. Forbered en presisjons skala for å overvåke gjennomstrømnings brøker for alle trinn under koplings reaksjonen (trinn 5,7).</li>
	<li>Åpne en forseglet NHS-aktivert tverrbundet agarose-kolonne og Monter sprøyte adapteren ved spalte inntaket. Unngå at luft går inn i kolonnen ved å bruke en dråpe buffer på adapter innløpet før du kobler den til sprøyten.</li>
	<li>Vask kolonnen med 6 mL iskald 1 mM saltsyre (fra trinn 5,4) med en strømningshastighet på < 1 mL min-1 og Fortsett umiddelbart til trinn 5,7.</li>
	<li>Injiser 1,5 mL DFE oppløsning (trinn 5,2) ved hjelp av en 2 mL sprøyte ved en strømningshastighet på < 1 mL min-1 og samle den gjennomstrømnings fraksjonen på en presisjons skala (trinn 5,4) for påfølgende analyse (trinn 7). Forsegle søylen i begge ender og ruge i 15 – 45 min ved 22 ° c, avhengig av oppsettet av DoE.</li>
	<li>Injiser 6 mL deaktivering løsning etterfulgt av 6 mL lav pH-oppløsning ved en strømningshastighet på < 1 mL min-1 for å fjerne ikke-covalently bundet ligander fra harpiks. Injiser deretter 6 mL deaktivering løsning og ruge kolonnen i 15 min.</li>
	<li>Injiser 6 mL lav pH-oppløsning i kolonnen, etterfulgt av 6 mL deaktivering løsning. Injiser deretter ytterligere 6 mL lav pH-oppløsning i kolonnen.</li>
	<li>Injiser 2 mL lagringsløsning i søylen og oppbevares ved 4 ° c.</li>
</ol>6. testing av rensing av mAbs fra avklart planter ekstrakter
<ol><li>Forbered 100 mL avklart plante ekstrakt som inneholder 2F55 eller supernatanten fra det foretrukne celle-baserte uttrykks systemet, som også inneholder 2F5.</li>
	<li>Forbered likevekts buffer (20 mM natrium fosfat, 500 mM natriumklorid, pH 7,4), lav pH eluering buffer (0,05 M citrate, 0,05 M natriumklorid, pH 4.0 – 3.25), og høy-ioniske-styrke eluering buffer (1,0 – 4,0 M magnesium klorid, 0,1 M HEPES, pH 8,0)</li>
	<li>Skyll kromatografi systemet med buffere. Monter en DFE affinitet kolonne (fra trinn 5,10) på kromatografi systemet og likevekt med 5 CV av likevekts buffer med en strømningshastighet på 1,0 mL min-1. Overvåk UV-absorbansen ved 280 NM. Merk: Lasting plante ekstrakt eller cellekultur supernatanten på kolonnen kan føre til en økning i høyt. Angi et høytrykks varsel ved 0,2 MPa for å unngå skade på kromatografi systemet eller DFE-kolonnen.</li>
	<li>Last 80 mL av det avklart plante ekstrakt-eller supernatanten (trinn 6,1) til kolonnen med en strømningshastighet på 0,5 til min-1 for å garantere en kontakt tid på 2 min. samle gjennomstrømnings prøver i 2 ml fraksjoner for banebrytende kurve rekonstruksjon (trinn 7,3). Oppbevar gjennomstrømnings prøvene ved 4 ° c Hvis det ikke er mulig med umiddelbare prøve analyser.</li>
	<li>Vask kolonnen med 6 CV med likevekts buffer. Samle en prøve av vask på begynnelsen, midten og slutten av dette trinnet.</li>
	<li>
Eluere mAb 2F5 med 5 CV med lav-pH eluering buffer eller høy-ioniske-styrke eluering buffer (0,1 M HEPES, 1,25 M magnesium klorid, pH 8,0). Samle DFE brøk når UV 280 NM-signalet har økt til 5 mAU over grunnlinjen.
	<ol>
<li>Optimaliser eluering buffer for hvert epitope – antistoff par. For 2F5, 1,25 M magnesium klorid oppnådd en optimal balanse mellom produkt utvinning og ligand stabilitet. Merk: Den magnesium klorid oppløsning er utsatt for nedbør. Derfor oppløse magnesium klorid i ~ 700 mL vann. Hver for seg oppløses HEPES i 100 mL vann og justerer pH-verdien til 8,0. Tilsett oppløst magnesium klorid oppløsning til HEPES løsningen og tilsett vann til et endelig volum på 1,0 L. Ikke Juster pH etter oppløsning av magnesium klorid fordi dette vil føre til nedbør.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser alle prøvene som ble tatt i trinn 6.4 – 6.6 ved hjelp av Bradford-metoden, litium-dodecylsulfate polyakrylamid gel-elektroforese (LDS-PAGE) og overflate Plasmon resonans (SPR) spektroskopi (trinn 7).</li>
</ol>7. eksempel analyse
<ol><li>Måler TSP-konsentrasjonen ved bruk av Bradford-metoden18,19.
	<ol>
<li>I tre eksemplarer, Pipetter 2,5 μL av hver prøve i en enkelt brønn av en 96-brønn plate. Bruk åtte serum albumin (BSA) standarder i tre eksemplarer dekker området 0 – 2000 mg · L-1.</li>
		<li>Tilsett 200 μL av Bradford-reagens i hver brønn og bland ved å pipettering forsiktig opp og ned. Hold pipette nivå for å unngå dannelse av bobler som forvrenger den påfølgende avlesning.</li>
		<li>Ruge platen i 10 min ved 22 ° c og mål absorbansen ved 595 NM i en spektrofotometer. Beregn TSP konsentrasjon i prøvene basert på en standard kurve gjennom BSA referansepunkter.</li>
	</ol></li>
	<li>Kvantifisere DFE av fluorimetry
	<ol>
<li>I tre eksemplarer, Pipetter 50 μL av hver prøve i enkle brønner av en svart 96-brønn halv-område plate. Inkluder seks DsRed standarder som dekker området 0 – 225 mg · L-1.</li>
		<li>Mål fluorescens to ganger med en 530 ± 30 NM eksitasjon filter og et 590 ± 35 NM utslipps filter i en spektrofotometer. Beregn DFE-konsentrasjonen i prøvene basert på en standard kurve gjennom DsRed referansepunkter.</li>
	</ol></li>
	<li>Mål 2F5 konsentrasjon av SPR spektroskopi20.
	<ol>
<li>Klargjør HBS-EP-en som kjører buffer (10 mM 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 3 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 150 mM natriumklorid, 0,005% v/v mellom-20, pH 7,4) og filter sterilisere det ved å sende det gjennom et 0,2 μm vakuum filter for flaske topp. Degas av buffer i 15 min.</li>
		<li>Koble HBS-EP-en som kjører buffer til SPR-instrumentet før docking en carboxymethylated dextran overflate chip og likevekt systemet ved hjelp av Prime-funksjonen. Start en manuell kjøring med en strømningshastighet på 30 μL min-1 og tilstand chip overflaten ved vekselvis injisere 30 mm saltsyre og 25 mm natriumhydroksid (to injeksjoner hver) over Flow celler 1 og 2 ved en strømningshastighet på 30 μL min-1 for 1 min.</li>
		<li>Forbered 300 μL av en 500 mg · L-1 protein en løsning i 10 mm natrium acetate (pH 4,0). Tine hetteglass inneholdende 0,4 M 1-etanol-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) og 0,1 M NHS og sentrifuger på 16 000 x g for 1 min før blanding av 70 μL EDC og 70 ΜL av NHS.</li>
		<li>Overfør EDC/NHS-blandingen og protein A-løsningen til 7 mm plast prøve ampuller og plasser i prøve stativet. Aktiver carboxymethylated dextran chip overflaten ved å injisere EDC/NHS-blandingen over strømnings celler 1 og 2 med en strømningshastighet på 10 μL min-1 i 10 min.</li>
		<li>Par protein A til den aktiverte carboxymethylated dextran overflaten ved å injisere protein A-løsningen over strømningscelle 2 ved en strømningshastighet på 15 μL min-1 i 15 min.</li>
		<li>Ved kobling av protein A, tine et hetteglass med 1,0 M ethanolamine hydrochloride (pH 8,5) og sentrifuge ved 16 000 x g i 1 min. overføre 150 μL til et 7 mm plast hetteglass og plasser i instrumentet. Når trinn 7.3.5 er fullført, deaktiverer du chip overflaten ved å injisere den ethanolamine løsningen over strømnings celler 1 og 2 med en strømningshastighet på 10 μL min-1 i 7 min.</li>
		<li>Tilstand chip overflaten ved vekselvis injisere 30 mM saltsyre og 25 mM natriumhydroksid (to injeksjoner hver) over strømnings celler 1 og 2 ved en strømningshastighet på 30 μL min-1 for 0,5 min.</li>
		<li>Forbered standarder for antistoff 2F5 i HBS-EP-en som kjører buffer ved en konsentrasjon på 500 μg · L-1 og fortynne prøver som inneholder 2F5 i HBS-EP til en endelig konsentrasjon i området 20 – 1000 μg · L-1. Injiser prøver og standarder over strømnings celler 1 og 2 med en strømningshastighet på 30 μL min-1 i 3 min. Injiser en 2F5-standard etter hvert 15.</li>
		<li>Trekk den relative enheten (RU) signal av strømningscelle 1 (referanse celle) fra signalet av strømningscelle 2 (måle celle) for hver prøve og beregne antistoff konsentrasjonen basert på RU signal av 2F5 standard injeksjoner.</li>
		<li>Etter hver prøve eller standard injeksjon, regenerere chip overflaten ved å injisere 30 mM saltsyre ved en strømningshastighet på 30 μL min-1 for 0,5 min over strømnings celler 1 og 2.</li>
		<li>Plot 2F5 konsentrasjon for hver Flow-through prøve fra trinn 6,4 mot strømmen gjennom volum for å få 2F5 gjennombrudd kurve. Beregn mengden injisert 2F5 når 10% av lasting 2F5 konsentrasjonen ble nådd for å få 10% dynamisk binding kapasitet (DBC).</li>
	</ol></li>
	<li>Analyser protein prøver av LDS-PAGE.
	<ol>
<li>Åpne en klar til bruk 4-12% BisTris LDS polyakrylamid gel og plassere den i en elektroforese modul. Overføring 800 mL drifts buffer (50 mM MES, 50 mM Tris base, 0,1% (m/v) SDS, 1 mM EDTA, pH 7,3) inn i modulen og tilsett 0,5 mL antioksidant løsning.</li>
		<li>I et 1,5 mL reaksjons rør, bland 10 μL av laste buffer med 4 μL reduksjonsmiddel og 26 μL av protein prøven. Ruge røret i en varme blokk i 10 min ved 80 ° c. Sentrifuger røret ved 500 x g for 30 s.</li>
		<li>Legg LDS polyakrylamid gel (10 μL av prøven per kjørefelt) og Last 5 μL av pre-farget protein standard (10 – 180 kDa) i et eget kjørefelt.</li>
		<li>Lukk elektroforese kammeret og koble til strømforsyningen. Elektroforese skal kjøre i 40 min. og ved konstant 200 V.</li>
		<li>Fjern gelen fra elektroforese kammeret. Åpne gel kledning og vask gelen i 15 min i vann på en shaker ved 19 RPM. Stain gelen for 1 t i farge løsning på en shaker ved 19 RPM.</li>
		<li>Destain gelen for 1 t i vann på en shaker ved 19 RPM. Skann gelen ved hjelp av en film skanner.</li>
	</ol></li>
</ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Søknader av romanen affinitet harpiks
Vi har vist at tilpasset affinitet kromatografi harpiks for fangst av mAbs kan produseres av immobilizing en ligand som inneholder en mAb-spesifikk epitope til NHS-aktivert tverrbundet agarose. Å designe en slik harpiks, var det nødvendig å kjenne epitope sekvensen og å bruke en lineær epitope. Den resulterende harpiks er fordelaktig for fangst av mAbs fordi de potensielt kan erstatte dyre protein A affinitet kromatografi trinn. Samspillet mellom 2F5 og DFE i vårt tilfelle studien ble formidlet av epitope-paratope bindende, slik at våre ligand bør være mer selektiv enn protein A, som binder seg til FC-regionen i de fleste murine og menneskelige IgG. Fordi individuelle ligander er nødvendig for hver mAb, kan vår metode i utgangspunktet synes egnet hovedsakelig for antistoffer som produseres i svært stor skala. Men ved å kombinere vår tilnærming med hurtig plantebasert transient protein uttrykk, kan nye affinitet ligander være forberedt på mindre enn 2 uker27 med minimal innsats28. Derfor er metoden også egnet for småskala mAb rensing.
Produksjon og potensielle forbedringer av affinitet ligand
Planter tilbyr en rask og sikker produksjonsplattform for affinitet ligander5,29,30, slik som DFE Fusion proteinet som er omtalt i vårt kasus studium. Blanchering anlegget materialet sterkt reduserte mengden av verten celle proteiner i et enkelt trinn, og ble lett integreres i en standard avklaring rutine. Imidlertid var utvinningen av ligand lav i dagens oppsett, sannsynligvis på grunn av sin moderate termiske stabilitet og noen ikke-spesifikk binding til filter lagene, som rapportert for andre produkter31,32,33. Engineering transportøren å øke sin termiske stabilitet kan derfor bidra til å forbedre ligand yield i fremtiden, som beskrevet for malaria vaksine kandidat CCT, det antitumor enzymet PpADI eller en mesofile β-glukosidase34, 35,36. Det samme gjelder for dybden filtrerings trinn, der protein engineering kan bidra til å redusere ikke-spesifikk binding til filtermaterialet37. Produksjonskostnadene for DFE og lignende ligander kan også reduseres ved å forbedre den generelle effektiviteten av avklaring ved hjelp av flokkulanter eller filter tilsetningsstoffer38,39.
Når DsRed brukes som en transportør, danner den et tetramerisk kompleks. Dette er fordelaktig fordi det øker antall epitopes per ligand, men det kan også gjøre ligand mer utsatt for demontering eller denaturering under affinitet kromatografi. En monomere carrier protein som mCherry kan derfor være å foretrekke, fordi det er stabilt ved lav pH40, og inkludering av tandem gjentar av epitope ville øke avidity av ligand og dermed øke harpiks kapasitet5, 26 i , 41. for enkle epitope proteiner (dvs. de uten disulfide obligasjoner eller etter translational modifikasjoner) mikrobielle produksjonssystemer kan redusere produksjonskostnadene og gjøre ligander mer konkurransedyktige med protein A. For eksempel har grønn fluorescerende protein blitt uttrykt i bakterielle celler med en avkastning på ~ 1 g · kg-1 biomasse, noe som vil redusere ligand produksjonskostnader42.
Uavhengig av uttrykket vert, en renset affinitet ligand var nødvendig under kopling for å minimere immobilisering av verten celle proteiner eller medie komponenter som ellers kan redusere harpiks selektivitet og kapasitet. Inkluderingen av en Poly-histidin kode for iMac rensing økte renheten til ~ 90% i et enkelt trinn, tilrettelegging rask og rimelig ligand produksjon5,43,44. Imidlertid er plasseringen av Fusion-taggen viktig fordi den har potensial til å sterically hindre epitope binding eller å indusere kløften av enten koden eller epitope fra carrier45,46.
Immobilisering av affinitet ligand på NHS-aktiverte kromatografi kolonner
Immobilisering ble utført manuelt eller ved hjelp av et kromatografi system. Den lille buffer volumer per kolonne syntes å favorisere Manuell håndtering (f. eks, på grunn av minimale avfallsvolumer). Imidlertid, hvis mangfoldig/større rekkene er behøvde, det kromatografi system lager koplingen vilkårene lettere å administrere (e.g., regulert flyte ratene) og er derfor flere sikkert å oppnå reproduserbar resultater inne pris av DBC. Våre data tyder på at koplings bufferen og pH-verdien har en viktig effekt på koblings effektiviteten og de totale Kol onne kostnadene. Screening faktorer som påvirker koplingen reaksjonen og justere dem for hvert carrier protein (eller til og med for hver transportør-ligand fusjon) kan derfor forbedre koplingen effektivitet og harpiks ytelse, og vi anbefaler denne tilnærmingen.
Testing 2F5 isolasjon ved hjelp av DFE affinitet harpiks
Produkt yield og renhet er viktige aspekter av harpiks ytelse, og i tilfelle av DFE vi oppnådd en avkastning på 105 ± 11% (± SD, n = 3) og en renhet på 97 ± 3% (± SD, n = 3), som er sammenlignbare med utførelsen av benchmark protein A harpikser25 ,26. En annen viktig ytelsesindikator for harpikser generelt (og spesielt for de som er basert på affinitet ligander) er DBC på 10% produkt gjennombrudd, fordi denne parameteren påvirker mengden harpiks som kreves for en bestemt prosess og dermed kostnadene. For DFE-ligand var den første DBC ~ 4 g · L-1 resin, som er ~ 13% av den tilsvarende verdien for protein A under lignende forhold (bare 2 min kontakt tid)25,47 men om 15 ganger høyere sammenlignet med andre tilpassede affinitet harpiks som anti-FSH-immunoaffinity-ligand med samme oppholdstid på 2 min48. DBC av DFE falt til 15% av startverdien etter 25 bind-og-eluere sykluser, mens mer enn 50 sykluser er nødvendig for samme tap av DBC i kommersielle protein A harpikser49. Det er imidlertid viktig å merke seg at vår transportør ennå ikke er optimalisert i samme grad som protein A, som har blitt grundig undersøkt og forbedret i løpet av de siste fire ti årene8.
Hittil har vi forbedret harpiks stabiliteten og produkt utvinningen ved å bytte fra en lav-pH eluering buffer til en høy konsentrasjon av magnesium klorid (Figur 3), som anbefalt i tidligere studier13. Den karakteristiske røde fargen på affinitet ligand ikke visne betydelig i løpet av de 25 bind-og-eluere sykluser, så vi spekulere at endogene anlegget proteaser i avklart anlegget ekstrakter31 kan ha avkortet og dermed deaktivert epitope av ligand. Derfor kan utforming av protease-resistente Linkers for å koble transportøren og epitope hjelpe til med å opprettholde den første DBC over et lengre antall sykluser. Gitt den raske og enkle uttrykk og rensing av DFE ligand, dens grei kopling til kommersiell kromatografi harpiks, og dens utmerkede produkt avkastning og renhet, tror vi at vår metode tilbyr et egnet alternativ til protein A for rensing av mAbs og antistoff derivater som ikke binder til protein A, spesielt hvis forbedringer til transportøren og linker kan forbedre DBC og ligand stabilitet. Denne antakelsen ble støttet av den lille forskjellen i den dissosiasjon konstanten av DFE-renset og protein A-renset 2F5 antistoff5, noe som indikerer at vår nye affinitet ligand tillater gjenvinning av høy kvalitet mAbs.
Fordeler og nåværende begrensninger av metoden
Produsere affinitet ligand som en genetisk fusjon med et carrier protein øker løselighet i vandige buffere og dermed kompatibilitet med typiske ligand kopling forhold. I kontrast, tomme peptider avledet fra solid fase peptid syntese kan ha begrenset løselighet under disse forholdene på grunn av deres sekvens50, som ikke kan endres fordi det er diktert av aminosyren sekvens av epitope anerkjent av mAb å bli renset. Andre har derfor brukt en på-harpiks syntese av peptid ligander51. Den statiske bindende kapasitet på den resulterende harpiks var høy (~ 80 g · L-1), men prosessen med harpiks forberedelse er lang, en dynamisk bindende kapasitet ble ikke rapportert, og den oppnådde renhet og utvinning var lavere enn i vår tilnærming. En ekstra fordel med et fusjons protein ligand i laboratorie skala er at ligand og varianter av disse kan produseres raskt, renses og testes med minimal innsats i en brukervennlig høy-gjennom uttrykks system52.
De to nåværende begrensninger av metoden som presenteres her er den lave dynamiske bindende kapasitet på 3 g · L-1 og 90% reduksjon i løpet av 25 bind-og-eluere sykluser5. Disse begrensningene kan løses i fremtiden ved å bruke mindre strenge belastningsforhold og erstatte gjeldende DsRed-transportør med en konstruert, mer stabil variant hhv. For eksempel, dobling av gjeldende kontakt tid fra 2 til 4 minutter har potensial til å doble den dynamiske bindings kapasiteten som ble vist for noen protein A harpikser26.
Feilsøking
Tabellen nedenfor fremhever potensielle problemer som kan oppstå under denne protokollen, og gir tips om hvordan du løser dem (tabell 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabell 1: potensielle problemer som kan oppstå og mulige feilrettinger.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protokoll trinn</td>
			<td>Problem</td>
			<td>Kurset</td>
			<td>Fikse</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Planter vokser ikke</td>
			<td>Kompromittert vekstforhold</td>
			<td>Sjekk pH og ledningsevne av gjødsel</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kontrollere temperatur-og lysforholdene</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 og 3</td>
			<td>Store mengder av verts celle proteiner er til stede etter ekstraksjon</td>
			<td>Ufullstendig nedbør</td>
			<td>Kontroller temperaturen under blanchering</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sjekk agitasjon i blanchering bad</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 og 3</td>
			<td>Ingen produkter funnet i anlegget ekstrakt</td>
			<td>Blanchering temperatur for høy</td>
			<td>Kontroller temperatur og pH under blanchering</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH i blanchering buffer for lav</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Store stamme-eller blad deler forblir etter ekstraksjon</td>
			<td>Ufullstendig blanding i blender</td>
			<td>Kontroller at plantematerialet ikke danner en plugg i blender</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Rask TRYKKØKNING under dybde filtrering</td>
			<td>Feil filtervalg og/eller orientering</td>
			<td>Kontrollere filtertype og-retning</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Little Fusion protein under eluering/mye av Fusion protein i Flow-through</td>
			<td>IMAC harpiks ble ikke ladet med metall ioner</td>
			<td>Kontroller om IMAC-harpiks var riktig ladet med ioner</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Fusion protein mistet affinitet tag</td>
			<td>Unngå intens sollys og høye temperaturer under plante dyrking</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Fusjons protein tapt under konsentrasjon</td>
			<td>Fusion protein bundet til membranen</td>
			<td>Kontroller membran typen</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kontroller at konsentrasjons faktoren ikke var for høy</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Lav kopling yield</td>
			<td>Feil sekvens av koplings reagens tillegg</td>
			<td>Kontroller reagensene etiketter og sekvens av tillegg</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Feil utarbeidelse av kolonnene før kopling</td>
			<td>Kontroller Kol onne preparaiton vilkår</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 og 6</td>
			<td>Lav mAb yield</td>
			<td>Lav mAb uttrykk i anlegget biomasse</td>
			<td>Test mAb uttrykk i biomasse</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Lav ligand tetthet</td>
			<td>Sjekk renheten av Fusion protein forberedelse</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Svært lave/høye protein konsentrasjoner i Bradford-analysen</td>
			<td>Boble dannelse under pipettering</td>
			<td>Se etter bobler i 96-brønnen palte</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Lav mAb-konsentrasjon under SPR-måling</td>
			<td>Kompromittert protein en chip</td>
			<td>Sammenlign med resultatene av standard mAb med kjent konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Feil eksempel fortynning</td>
			<td>Kontroller fortynnings raten og buffer</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: feilsøking.

Biofarmasøytisk produkter er viktig for behandling av et bredt spekter av sykdommer i nesten alle gren av medisin1. Monoklonale antistoffer (mAbs) dominerer biofarmasøytisk markedet, med verdensomspennende salg forventes å nå nesten €110 000 000 000 i 20202. Den favoriserte uttrykks plattform for mAbs er kinesisk hamster eggstokk cellelinjer, som vanligvis produserer høy mAb titers på opptil 10 g ∙ L-1 i kulturen supernatanten3,4. Imidlertid er produksjonen av mAbs i pattedyr cellekulturer dyrt på grunn av den høye kostnaden av mediet og behovet for steril gjæring5. Alternative uttrykks plattformer som planter potensielt tilbyr en raskere, enklere, rimeligere og mer skalerbar tilnærming for industriell produksjon6,7.
I tillegg til kostnadene forbundet med pattedyr cellekulturer, er den utbredte bruken av protein en affinitet kromatografi for produkt opptak en stor kostnads fører for den industrielle produksjonen av mAbs. Protein A er naturlig funnet på overflaten av Staphylococcus aureus celler og det binder seg til fragment Crystallizable (FC) regionen av visse murine og menneskelige antistoffer, og dermed opptre som et forsvar mekanisme for å unngå det humoral immunsystemet8. Protein A har blitt industri gullstandarden for fangst av mAbs fra cellekultur supernatanter og er også mye brukt av forskningsmiljøet fordi det er svært selektiv, vanligvis oppnå mAb renheter av ~ 95% i ett trinn8. Ikke overraskende, salg av protein A i løpet av de siste to ti årene har tett speilet salget av mAbs8. Avhengig av produksjonsskala, kan kostnadene ved protein A tilsvare mer enn 25% av de totale prosesskostnader og dermed påvirke markedsprisen på terapeutisk mAbs, som kan være opp til €2 000 g-15,9. Derfor har alternative kromatografi harpikser med en tilsvarende rensing ytelse potensial til å redusere produksjonskostnadene betydelig, noe som gjør antistoff-baserte terapier tilgjengelig for et større antall pasienter10,11 ,12. Slike alternativer kan også omgå ulempene ved protein A-kromatografi, inkludert de tøffe eluering forholdene ved lav pH (vanligvis < 3.5) som potensielt kan føre til at mAbs gjennomgår conformational endringer som fremmer aggregering13 . Viktigere, protein A er selektiv bare for FC-regionen av visse IgG underklasser, så ikke-funksjonelle molekyler med avkortet bindende domener kan co-rense med intakt produkt5, mens mAb derivaties som enkelt kjede variabel fragmenter ikke binder til protein A i det hele tatt.
Her beskriver vi en alternativ affinitet kromatografi harpiks for fangst av HIV-nøytralisere mAb 2F5 bruke sin lineære epitope ELDKWA (en bokstav amino acid kode)5,14. Vi genetisk smeltet 2F5 epitope til C-Terminus av fluorescerende protein DsRed, som fungerte som et transportør og reporter molekyl, og produserte den resulterende protein DsRed-2F5-Epitope (DFE) i transgene tobakk ( Nicotiana tabacum) planter. DFE ble renset med ett-trinns immobilisert-affinitet kromatografi (IMAC). Immobilisering av renset DFE affinitet ligand på en tverrbundet agarose harpiks ble oppnådd ved kjemisk kopling ved hjelp av N-hydroxysuccinimide (NHS)-aktivert tverrbundet agarose kolonner. Statistisk eksperimentell design ble deretter brukt til å optimalisere immobilisering prosedyre og kopling effektivitet15. Rensing strategien for mAb 2F5 ble evaluert i form av antistoff renhet, yield og ligand stabilitet. I motsetning til protein A, som binder FC-regionen, DFE bundet til den komplementaritet-fastsettelse regionen av 2F5, sikre rensing av molekyler med en intakt paratope. Vårt konsept kan enkelt tilpasses enhver mAb med en lineær epitope eller til andre peptid-baserte affinitet ligander som lett kan identifiseres ved Microarray studier16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Figur 1: prosessflytskjema for utarbeidelse av epitope affinitet harpiks som kan brukes til fangst av mAbs fra råolje ekstrakter eller cellekultur supernatanter. (A) AFFINITET ligand DFE ble uttrykt i transgene tobakk planter. En varme nedbør trinn (B) ble tatt før høstet bladene ble homogenisert (C). (D) råolje plante ekstrakt ble avklart ved pose filtrering, dybde filtrering og 0,2 μm steril filtrering. (E) DFE ble deretter RENSET av iMac. (F, G) Den renset DFE affinitet ligand ble immobilisert på EDC/NHS-aktivert tverrbundet agarose kolonner. (H) bakterielle kulturer som bærer T-DNA-koding antistoff 2F5 ble brukt for forbigående uttrykk i N. Benthamiana planter (i) dyrket i en phytotron. (J) N. benthamiana bladene ble høstet og behandlet som beskrevet i D. (K) mAb 2F5 ble renset fra avklart ekstrakt ved hjelp av DFE affinitet kolonner (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

Rensing av monoklonale antistoffer (mAbs) er vanligvis oppnås ved protein A affinitet kromatografi, som kan gjøre rede for opptil 25% av den samlede prosessen kostnader. Alternative, kostnadseffektive opptaks trinn er derfor verdifulle for industriell skala produksjon, der store mengder av en enkelt mAb produseres. Her presenterer vi en metode for immobilisering av en DsRed-basert epitope ligand til en tverrbundet agarose harpiks som tillater selektiv fangst av HIV-nøytralisere antistoff 2F5 fra rå planteekstrakter uten å bruke protein A. Den lineære epitope ELDKWA ble først genetisk smeltet til fluorescerende protein DsRed og fusjons proteinet ble uttrykt i transgene tobakk (Nicotiana tabacum) planter før rensing av immobilisert metal-ion affinitet kromatografi. Videre ble en metode basert på aktiverte tverrbundet agarose optimalisert for høy ligand tetthet, effektiv kopling og lave kostnader. Den pH og buffer sammensetning og løselig ligand konsentrasjon var de viktigste parametrene under koplings prosedyren, som ble forbedret ved hjelp av en design-of-eksperimenter tilnærming. Den resulterende affinitet harpiks ble testet for sin evne til å selektivt binde målet mAb i en rå plante ekstrakt og eluering buffer var optimalisert for høy mAb utvinning, produkt aktivitet og affinitet harpiks stabilitet. Metoden kan enkelt tilpasses andre antistoffer med lineær epitopes. Den nye harpikser tillate mildere eluering forhold enn protein A og kan også redusere kostnadene ved en innledende fangst trinn for mAb produksjon.

Uttrykk og rensing av affinitet ligand
Fusjons proteinet DFE ble uttrykt i transgene tobakk planter dyrket i et drivhus. Avkastningen var ~ 120 mg · kg-1 blad masse med en gjennomsnittlig biomasse på ~ 130 g per plante. Den DFE renhet var < 5% av TSP i råolje anlegg ekstrakter før blanchering men økte til ~ 40% etter varmebehandling ved 70 ° c for 1,5 min, som førte > 97% av verten celle proteiner. Det blanchering steget var lett integreres i høsting og utvinning rutine (figur 1) og tok mindre enn 2 t ekstra tid, inkludert sette opp vannbad. Den totale utvinningen av DFE var 23,5 mg kg1 med en renhet på > 90%. Trinnene som er ansvarlige for produkttap var blanchering, dybde filtrering og IMAC, med spesifikke tap på henholdsvis 40%, 27% og 45%. Dybden filter kapasiteten var i gjennomsnitt 135 ± 36 L m-2 (± SD, n = 3) og dermed i det øvre området av verdier som er rapportert i litteraturen21. DFE avkastning økte med plante alder (figur 2).
Immobilisering av affinitet ligand på NHS-aktiverte kromatografi kolonner
Under innledende koblings tester fant vi at HEPES buffer (pH 8,3) økte koblings effektiviteten til 89 ± 6% (± SD, n = 3) sammenlignet med 78 ± 9% (± SD, n = 3) for bikarbonat buffer anbefalt av produsenten. Derfor ble HEPES brukt til alle etterfølgende koplings eksperimenter. En DoE tilnærming ble valgt for å optimalisere koplingen effektiviteten av DFE til NHS-aktivert tverrbundet agarose harpiks. Den absolutte mengden av DFE immobilisert på harpiks økte med massen av DFE injisert i kolonnen og plateaued på ~ 15 g · L-1 mens koblings utbyttet gikk ned kontinuerlig etter hvert som mer DFE ble injisert (figur 2). Koplingen yield var også > 50% lavere i en syrlig buffer, noe som indikerer behovet for å skjermen for egnede koplings forhold for hver ligand på et sak-til-sak grunnlag. Ideal vilkårene inne pris av kopling utbytte, absolutt antallet av immobilisert DFE og søylen omkostningene var kjennemerke benytter det numerisk optimering verktøyet av DoE programvare. De mest ønskelige forholdene (pH 9,0 og 7,0 mg DFE per 1 mL tverrbundet agarose harpiks) lå på et stort platå og var derfor robuste. Den DFE molekyler beholdt sin røde fluorescens selv etter kopling, og farge intensiteten tilsvarte den totale mengden av immobilisert DFE (figur 2). Derfor kan kolonnefarge brukes som en enkel kvalitetskontroll parameter for å anslå koblings effektiviteten og Kol onne kvaliteten. Fluorescens bekreftet også at DFE Fusion protein samlet i tetramerisk tilstand av innfødte DsRed.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Figur 2: optimalisering av DFE-immobilisering til NHS-aktivert tverrbundet agarose harpiks. (A) LDS-PAA gel med Western Blot overlegg av homogenate og eluering prøver fra ublankede og FORVELLET transgene DFE planteekstrakter. Harvest av planter ble utført 38, 45 eller 52 dager etter seeding. Vestlige blots ble utført ved hjelp av en anti-His6-antistoffer5. (B) total mengde kombinert DFE affinitet ligand i avhengighet hvis kopling pH og samlet masse av renset DFE INJISERT på NHS-aktivert tverrbundet agarose kolonner. Røde prikker indikerer den faktiske eksperimenter utført for å bygge responsen overflaten modellen. (C) DFE affinitet kolonner etter koplingen prosedyren. Tallene tilsvarer koplings forholdene som er uthevet i panel B. DPS = dager etter seeding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Testing 2F5 isolasjon ved hjelp av DFE affinitet harpiks
Rekombinant 2F5-antistoff ble midlertidig produsert i Nicotiana benthamiana planter dyrket i en phytotron5. Erobringen av 2F5 fra råolje plante ekstrakt ble testet ved hjelp av affinitet kolonner kombinert med ~ 7,0 mg renset DFE (trinn 6). Eluering fra protein en harpiks innebærer vanligvis en syrlig buffer (pH ~ 3,3)13. Derfor har vi først evaluert forskjellige lav-pH eluering buffere (pH 6.0 – 3.25) for DFE kolonner. Den eluering av 2F5 var vellykket på pH-verdier under 4,5 med høyest utvinning av ~ 35% ved pH 3,25. Lav pH-eluering deaktiverte imidlertid både antistoff (som bekreftet av SPR-massespektrometri) og DFE-ligand (som indikert ved tap av farge og nedre DBC, Figur 3). Sistnevnte var forventet gitt at native DsRed denatures på pH < 4,022,23. For å unngå produkt-og ligand denaturering, testet vi magnesium klorid som et alternativt eluering middel fordi det tidligere har blitt brukt til å eluere mAbs fra andre affinitet harpiks24. En magnesium klorid konsentrasjon på 1,25 M var tilstrekkelig til å eluere 2F5 fra DFE affinitet harpiks med en utvinning av 105 ± 11% (± SD, n = 3) og en renhet på 97 ± 3% (± SD, n = 3). Denne forestillingen var sammenlignbar med protein en harpiks25,26. Likevekt dissosiasjon konstant (KD) av DFE-renset 2F5 antistoff og syntetisk ligand Fuzeon var 791 PM mens det av en protein a-renset motstykke var 763 PM5. Videre ble det ikke observert noe signifikant farge tap i harpiks over totalt 25 bind-og-eluere-sykluser. DBC av DFE affinitet harpiks ved 10% 2F5 gjennombrudd falt lineært i løpet av 25 sykluser til ~ 15% av den opprinnelige verdien (Figur 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Figur 3: testing av isolering av 2F5 fra avklart planteekstrakter ved hjelp av DFE affinitet harpiks. (A) DFE affinitet harpiks etter en eluering syklus ved hjelp av buffere med ulike pH-verdier i området 4,0-3,0 og samme harpiks etter et nøytralisering trinn ved pH 6,0. (B) DFE affinitet harpiks etter en og seks sykluser av 2F5 rensing bruker 1,25 m eller 4,00 m magnesium klorid som eluent. (C) kromatogrammene av fremre lasting eksperimenter (Break-through kurver) for å bestemme syklus avhengig dynamisk bindende kapasitet på DFE harpiks ved hjelp av magnesium klorid som eluent. De gjennombrudd kurvene ble målt for 4,0 M og 1,25 M magnesium klorid eluering buffere og ulike syklus tall. (D) syklus avhengig dynamisk bindings kapasitet på DFE med 1,25 M magnesium klorid som eluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

I denne prosedyren, en DsRed-basert epitope ligand er immobilisert å produsere en svært selektiv affinitet harpiks for fangst av monoklonale antistoffer fra rå planteekstrakter eller cellekultur supernatanter, som et alternativ til protein A.

Aktivert tverrbundet Agarose for den raske utviklingen av affinitet kromatografi harpikser-antistoff fangst som en Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Monoklonale antistoffer dominerer det biofarmasøytiske markedet og renses vanligvis av Protein A kromatografi. Den i henhold til harpiks er en stor kostnadsdriver under produksjonen som påvirker prisen på antistoffbaserte terapeutiske midler. Her beskriver vi en ny affinitetsligand basert på det fluorescerende proteinet som leses som bærer for den lineære epitopen av HIV-nøytraliserende antistoff 2F5.Generelt tillater vår metode den raske generasjonen av affinitetkromatografi harpikser som kan brukes til fangst av monoklonale antistoffer. Vi demonstrerte denne evnen ved å fange antistoff 2F5 fra råolje planteekstrakt. Vi optimaliserte opptaksforholdene og løsningsbufferen for å forbedre den dynamiske bindingskapasiteten og harpiksrebrukbarheten.Vår harpiks tillater generelt løsere forhold enn Protein A og har potensial til å redusere rensekostnadene for monoklonale antistoffer. Videre kan harpiksen enkelt tilpasses andre antistoffer som binder seg til lineære epitoper. For å begynne denne prosedyren, juster konsentrasjonen av den tilberedte affinitetsligandeløsningen slik at den er i området 5 til 15 gram per liter som definert av utformingen av eksperimenter.Oppbevar oppløsningen på is til koblingsreaksjonen er klar. Deretter fyller du en to milliliter sprøyte med DFE-oppløsningen. Og forberede en adapter for å montere sprøytene på NHS-aktiverte cross-link agarose kolonner med et sengevolum på en milliliter.For hver 10 kolonne som brukes til kobling, klargjør du 30 milliliter deaktiveringsløsning, 30 milliliter lav pH-løsning og én milliliter lagringsløsning. Deretter forberede 20 milliliter av en millimolar saltsyre i et rør. Og inkuber den på is i minst 20 minutter.Forbered en presisjonsskala for å overvåke strømmen gjennom fraksjoner for alle trinn under koblingsreaksjonen. Etter dette åpner du en forseglet NHS-aktivert krysskoblet agarose-kolonne. Bruk en bufferdråpe på adapterinntaket for å hindre at luft kommer inn i kolonnen.Monter sprøyteadapteren ved kolonneinntaket. Vask kolonnen med seks milliliter iskald en millimolar saltsyre, med en strømningshastighet mindre enn en milliliter per minutt. Bruk en to milliliter sprøyte, umiddelbart injisere 1,5 milliliter DFE løsning med en strømningshastighet mindre enn en milliliter per minutt.Og samle flyten gjennom brøk på en presisjonsskala for påfølgende analyse. Forsegle kolonnen i begge ender og inkuber i 15 til 45 minutter, ved 22 grader Celsius. Deretter injiserer du seks milliliter av aktiveringsløsningen, etterfulgt av seks milliliter lav pH-løsning, med en strømningshastighet mindre enn én milliliter per minutt, fjern ikke-kovalent bundne ligandene fra harpiksen.Injiser seks milliliter av aktiveringsløsningen, og inkuber kolonnen i 15 minutter. Etter dette injiserer du seks milliliter med lav pH-løsning i kolonnen. Etterfulgt av seks milliliter av aktiveringsløsningen.Deretter injiserer du ytterligere seks milliliter med lav pH-løsning i kolonnen. Injiser to milliliter lagringsløsning i kolonnen, og lagre den på fire grader Celsius. Først forberede 100 milliliter av enten avklart planteekstrakt som inneholder 2F5, eller supernatant for foretrukket cellebasert uttrykkssystem, som også inneholder 2F5.Deretter forberede likevekt buffer, og høy jern X styrke illusjon buffer, som beskrevet i tekstprotokollen. Skyll kromatografisystemet med bufferne. Monter en DFE-affinitetskolonne på kromatografisystemet.Og likevekt med fem CV med likevektsbuffer, med en strømningshastighet på én milliliter per minutt. Overvåk UV-absorbansen ved 280 nanometer. Deretter laster du 80 milliliter av enten det avklarede planteekstraktet, eller supernatanten på kolonnen med en strømningshastighet på 5 milliliter per minutt.For å garantere en kontakttid på to minutter. Samle flyten gjennom prøver i to milliliter fraksjoner eller gjennombrudd kurve rekonstruksjon. Lagre strømmen gjennom prøver ved fire grader Celsius, hvis umiddelbar prøveanalyse ikke er mulig.Etter dette vasker kolonnen med 6CV likevektsbuffer. Samle en prøve i begynnelsen, midten og slutten av vasken. Fortynn MAB2F5 med fem volumer med høy ionisk styrke illusjon buffer.Samle DFE-brøken når UV-signalet på 280 nanometer har økt til fem milli absorbansenheter over grunnlinjen. Optimaliser illusjonsbufferen for hvert epitop-antistoffpar, som beskrevet i tekstprotokollen. Fusjonsproteinet DFE uttrykkes i transgene tobakksplanter, dyrket i et drivhus.Den totale utvinningen av DFE er 23,5 milligram per kilo. Med en renhet på over 90%Den absolutte mengden DFE immobilisert på harpiksen øker med massen av DFE injisert i kolonnen, og platåer på rundt 15 gram per liter, mens koblingsutbyttet avtar kontinuerlig etter hvert som mer DFE injiseres. DFE molekylene er sett for å beholde sin røde florescence, selv etter kobling.Fargeintensiteten tilsvarer den totale mengden immobilisert DFE. Derfor kan kolonnefarge brukes som en enkel kvalitetskontrollparameter for å estimere koblingseffektiviteten og kolonnekvaliteten. Det rekombinante 2F5-antistoffet produseres forbigående i Nicotiana benthamiana planter dyrket i en fytotron.Fangsten av 2F5 fra råoljeplanteekstraktet, testes ved hjelp av affinitetskolonner, kombinert med omtrent syv milligram renset DFE. En magnesiumkloridkonsentrasjon på 1,25 molar er tilstrekkelig til å elute 2F5 fra DFE affinitetharpiks med en utvinning nær 100%og en renhet på ca 97%som kan sammenlignes med Protein A harpiks. DBC av DFE affinitet harpiks ved 10% 2F5 gjennombrudd, avtar lineært i løpet av de 25 sykluser, til ca 15% av den opprinnelige verdien.Vi brukte en design av eksperimenter tilnærming for å optimalisere koblingskapasiteten til vår affinitet ligand. Disse forholdene kan finjusteres for andre ligande i fremtiden. Vår metode bruker blomstrende protein for å tre en sub carrier protein for den produktspesifikke ligand.Samtidig bare legge til funksjoner som en visuell kvalitetsindikator for mobilisering prosedyren, og gir en umiddelbar og intuitiv tilbakemelding til operatøren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

En Facile og effektiv tilnærming for produksjon av Reversibel disulfide tverrbundet Miceller

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

En filtreringsbasert metode for å fremstille kjernekvalitet av høy kvalitet fra tverrbundet skjelettmuskulatur for kromatinimmunutfelling

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Borstemmaskin immobilisert metall affinitet Ture, rekonstituering og analysen av en Polyhistidine merket Metalloenzyme for Undergraduate laboratoriet

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Rask bestemmelse av antistoff-antigen affinitet av masse fotometri

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Cellefri produksjon av proteoliposomer for funksjonell analyse og antistoffutvikling rettet mot membranproteiner

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Utvikling av en lateral flow immunokromatografisk stripe for rask og kvantitativ påvisning av små molekylforbindelser

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...