Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Nós gostaríamos de reconhecer Ibrahim Al Amedi para cultivar as plantas de tabaco transgénicas e Dr. Thomas Rademacher para fornecer o vetor da expressão do tabaco. Os autores desejam agradecer ao Dr. Richard M. Twyman pela assistência editorial e Markus Sack por discussões frutíferas sobre a estrutura ligante de afinidade da DFE. Este trabalho foi financiado em parte pelos programas internos da Fraunhofer-Gesellschaft o n º Grant. Atraia 125-600164 e o estado de Norte-Rhine-Westphalia o Grant do Leistungszentrum no. 423 rede, produção adaptável. Este trabalho foi apoiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) no âmbito do grupo de formação de investigação "Drug-alvo de entrega de medicamentos" subvenção 331065168. A GE Healthcare apoiou a publicação de acesso aberto deste artigo.

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Aplicações da resina nova da afinidade
Nós mostramos que as resinas personalizadas da cromatografia da afinidade para a captação de mAbs podem ser manufacturados imobilizando um ligante que contem um epítopo mAb-específico ao agarose Cross-linked NHS-ativado. Para projetar tal resina, era necessário saber a seqüência do epítopo e usar um epítopo linear. As resinas resultantes são vantajosas para a captura de mAbs porque poderiam potencialmente substituir as etapas de cromatografia de afinidade de proteína A dispendiosas. A interação entre 2f5 e DFE em nosso estudo de caso foi mediada pela ligação do epítopo-paratope, assim que nosso ligante deve ser mais seletivo do que a proteína a, que liga à região de FC da maioria de iggs murino e humano. Porque os ligantes individuais são necessários para cada MAB, nosso método pode inicialmente parecer apropriado principalmente para os anticorpos que são produzidos em uma escala muito grande. Entretanto, combinando nossa aproximação com a expressão transiente rápida planta-baseada da proteína, os ligantes novos da afinidade podem ser preparados em menos de 2 semanas27 com esforço mínimo28. Assim, o método também é adequado para a purificação de mAb de pequena escala.
Produção e melhorias potenciais do ligante da afinidade
As plantas oferecem uma plataforma de produção rápida e segura para ligantes de afinidade5,29,30, como a proteína de fusão DFE apresentada no nosso estudo de caso. Blanching o material de planta reduziu extremamente a quantidade de proteínas de pilha do anfitrião em uma única etapa e foi integrado facilmente em uma rotina padrão do esclarecimento. No entanto, a recuperação do ligante foi baixa na configuração atual, provavelmente devido à sua estabilidade térmica moderada e alguma ligação não específica às camadas filtrantes, conforme relatado para outros produtos31,32,33. A engenharia o portador para aumentar sua estabilidade térmica pode conseqüentemente ajudar a melhorar o rendimento do ligante no futuro, como descrito para o candidato vacinal da vacina da malária, a enzima antitumoral ppadi ou um β-glucosidase mesófilos34, 35,36. O mesmo vale para a etapa de filtração de profundidade, onde a engenharia de proteínas pode ajudar a reduzir a ligação não específica ao material filtrante37. Os custos de produção para DFE e ligantes semelhantes também podem ser reduzidos melhorando a eficiência geral de esclarecimento utilizando floculantes ou aditivos filtrantes38,39.
Quando dsred é usado como um portador, dá forma a um complexo tetramérica. Isso é vantajoso porque aumenta o número de epítopos por ligantes, mas também pode tornar o ligador mais suscetível à desmontagem ou desnaturação durante a cromatografia de afinidade. Uma proteína transportadora monomérica como a mCherry pode, portanto, ser preferível, pois é estável em pH baixo40, e a inclusão de repetições em tandem do epítopo aumentaria a avidez do ligador e, assim, aumentará a capacidade da resina5, 26 anos de , 41. para as proteínas simples do portador-epitope (isto é, aquelas sem ligações do dissulfeto ou modificações borne-translational) os sistemas de produção microbianos podem reduzir os custos de fabricação e fazer os ligantes mais competitivos com proteína a. Por exemplo, a proteína verde fluorescente tem sido expressa em células bacterianas com um rendimento de ~ 1 g · kg-1 de biomassa, o que reduziria significativamente os custos de produção de ligantes42.
Independentemente do hospedeiro de expressão, foi necessário um ligante de afinidade purificada durante o acoplamento para minimizar a imobilização de proteínas de células hospedeiras ou componentes de mídia que, de outra forma, podem reduzir a seletividade e capacidade da resina. A inclusão de uma etiqueta poli-histidina para a purificação do iMac aumentou a pureza para ~ 90% em uma única etapa, facilitando a produção rápida e barata de ligante5,43,44. Entretanto, a posição da etiqueta da fusão é importante porque tem o potencial para obstruir aberta a ligação do epítopo mapeado ou para induzir o clivagem da etiqueta ou do epítopo do portador45,46.
Imobilização da ligadura de afinidade em colunas de cromatografia ativadas pelo NHS
A imobilização foi realizada manualmente ou por meio de um sistema de cromatografia. Os pequenos volumes de buffer por coluna pareciam favorecer o manuseio manual (por exemplo, devido aos volumes mínimos de desperdício). No entanto, se forem necessárias colunas múltiplas/maiores, o sistema de cromatografia torna as condições de acoplamento mais fáceis de controlar (por exemplo, taxas de fluxo reguladas) e, portanto, é mais provável que consiga resultados reprodutíveis em termos de DBC. Nossos dados sugerem que o tampão de acoplamento e o pH têm um efeito importante na eficiência do acoplamento e nos custos totais da coluna. Fatores de triagem que influenciam a reação de acoplamento e ajustá-los para cada proteína transportadora (ou mesmo para cada transportadora – ligand Fusion) poderia, portanto, melhorar a eficiência de acoplamento e desempenho de resina, e recomendamos esta abordagem.
Testando o isolamento de 2F5 usando a resina de afinidade DFE
O rendimento e a pureza do produto são aspectos importantes do desempenho da resina e, no caso da DFE, obteve-se um rendimento de 105 ± 11% (± DP, n = 3) e uma pureza de 97 ± 3% (± DP, n = 3), o que é comparável ao desempenho das resinas de benchmark protein A25 ,26. Outro indicador-chave de desempenho para resinas em geral (e particularmente para aqueles baseados em ligantes de afinidade) é o DBC a 10% de avanço do produto, porque este parâmetro afeta a quantidade de resina necessária para um processo específico e, portanto, os custos. Para o ligand de DFE, o DBC inicial era ~ 4 g · L-1 resina, que é ~ 13% do valor correspondente para a proteína A em condições semelhantes (apenas 2 min tempo de contato)25,47 mas cerca de 15 vezes maior em comparação com outras resinas de afinidade personalizada, como o ligantes anti-FSH-imunoafinidade utilizando o mesmo tempo de permanência de 2 min48. O DBC de DFE declinou a 15% do valor começar após 25 ciclos do BIND-e-elute, visto que mais de 50 ciclos são exigidos para a mesma perda de DBC em resinas comerciais de A da proteína A49. No entanto, é importante notar que o nosso transportador ainda não foi otimizado na mesma medida que a proteína A, que tem sido exaustivamente investigado e melhorado ao longo das últimas quatro décadas8.
Até o momento, melhoramos a estabilidade da resina e a recuperação do produto, alternando de um tampão de eluição de baixo pH para uma alta concentração de cloreto de magnésio (Figura 3), como recomendado em estudos anteriores13. A cor vermelha característica do ligante de afinidade não se desvaneceu substancialmente durante os 25 ciclos de ligamento-e-elute, então nós especulamos que as proteases endógenas de plantas nos extratos de plantas esclarecidas31 podem ter truncado e, assim, inativado o epítopo da o ligand. Conseqüentemente, projetar os linkers protease-resistentes para conectar o portador e o epítopo pode ajudar a manter o DBC inicial sobre um número prolongado de ciclos. Dada a rápida e simples expressão e purificação do ligador DFE, seu acoplamento direto às resinas de cromatografia comercial, e seu excelente rendimento e pureza do produto, acreditamos que nosso método oferece uma alternativa adequada à proteína a para o purificação de mAbs e derivados de anticorpos que não se ligam à proteína a, especialmente se as melhorias para o portador e Linker pode melhorar a estabilidade do DBC e ligante. Esta suposição foi apoiada pela diferença pequena na constante da dissociação de DFE-purified e de proteína A-purified o anticorpo5de 2f5, indicando que nosso ligante novo da afinidade permite a recuperação de mAbs de alta qualidade.
Benefícios e limitações atuais do método
Produzindo o ligante da afinidade como uma fusão genética com uma proteína do portador aumenta a solubilidade em amortecedores aquosos e assim a compatibilidade com condições típicas do acoplamento do ligante. Em contrapartida, peptídeos em branco derivados da síntese de peptídeos em fase sólida podem ter solubilidade limitada nestas condições devido à sua sequência50, que não pode ser alterada porque é ditada pela sequência de aminoácidos do epítopo reconhecida pelo MAB para ser purificada. Outros usaram conseqüentemente uma síntese da em-resina de ligantes do peptide51. A capacidade de ligação estática da resina resultante foi alta (~ 80 g · L-1), mas o processo de preparo da resina é demorado, não foi relatada uma capacidade de ligação dinâmica e a pureza e recuperação obtidas foram menores do que em nossa abordagem. Uma vantagem adicional de um ligante da proteína da fusão na escala do laboratório é que o ligante e as variações dele podem ràpida ser produzidos, purified e testado com esforço mínimo em um sistema Easy-to-use da expressão da elevado-através de52.
As duas limitações atuais do método apresentado aqui são a baixa capacidade de ligação dinâmica de 3 g · L-1 e sua redução de 90% ao longo do ciclo de 25 ciclos de ligação e elute5. Essas limitações podem ser abordadas no futuro, aplicando condições de carga menos rigorosas e substituindo a transportadora DsRed atual por uma variante projetada e mais estável, respectivamente. Por exemplo, dobrar o tempo de contato atual de 2 a 4 minutos tem o potencial de dobrar a capacidade de ligação dinâmica como foi mostrado para algumas resinas protein A26.
Solucionando problemas
A tabela a seguir destaca os possíveis problemas que podem ser encontrados durante este protocolo e fornece dicas sobre como resolvê-los (tabela 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabela 1: problemas potenciais que podem ser encontrados e possíveis correções.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etapa do protocolo</td>
			<td>Problema</td>
			<td>Couse</td>
			<td>Corrigir</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>As plantas não crescem</td>
			<td>Condições de crescimento comprometidas</td>
			<td>Verifique o pH e a condutividade do fertilizante</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Verifique as condições de temperatura e luz</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 e 3</td>
			<td>Grandes quantidades de proteínas de células hospedeiras estão presentes após a extração</td>
			<td>Precipitação incompleta</td>
			<td>Verifique a temperatura durante a branqueamento</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Verifique a agitação no banho de branqueamento</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 e 3</td>
			<td>Nenhum produto encontrado no extrato da planta</td>
			<td>Temperatura de blanching demasiado elevada</td>
			<td>Verifique a temperatura e o pH durante o branqueamento</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>pH no tampão de branqueamento muito baixo</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>As grandes partes da haste ou da folha permanecem após a extração</td>
			<td>Mistura incompleta no liquidificador</td>
			<td>Certifique-se de que o material vegetal não é um plugue no liquidificador</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Aumento rápido da pressão durante a filtração da profundidade</td>
			<td>Seleção e/ou orientação incorreta do filtro</td>
			<td>Verifique o tipo de filtro e a orientação</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Pouca proteína de fusão durante a eluição/um monte de proteína de fusão em fluxo-através de</td>
			<td>A resina IMAC não foi carregada com íons metálicos</td>
			<td>Verifique se a resina IMAC foi corretamente carregada com íons</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>A proteína de fusão perdeu a tag de afinidade</td>
			<td>Evite a luz solar intensa e altas temperaturas durante o cultivo da planta</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Proteína de fusão perdida durante a concentração</td>
			<td>Proteína de fusão ligada à membrana</td>
			<td>Verifique o tipo de membrana</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Certifique-se que o factor de concentração não foi demasiado elevado</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Baixo rendimento do acoplamento</td>
			<td>Seqüência incorreta de adição de reagente de acoplamento</td>
			<td>Verifique os rótulos dos reagentes e a sequência de adição</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Preparação incorreta das colunas antes do acoplamento</td>
			<td>Verifique as condições da coluna preparaiton</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 e 6</td>
			<td>Baixo rendimento de mAb</td>
			<td>Baixa expressão de mAb na biomassa vegetal</td>
			<td>Teste de expressão de mAb em biomassa</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Baixa densidade do ligante</td>
			<td>Verifique a pureza da preparação da proteína de fusão</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Concentrações de proteínas muito baixas/elevadas no ensaio de Bradford</td>
			<td>Formação de bolhas durante a pipetagem</td>
			<td>Verifique se há bolhas no 96-bem palte</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Baixa concentração de mAb durante a medição da SPR</td>
			<td>Microplaqueta comprometida da proteína A</td>
			<td>Compare com os resultados do mAb padrão com concentração conhecida</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Diluição incorrecta da amostra</td>
			<td>Verifique a taxa de diluição e o tampão</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: problemas de disparo.

Os produtos biofarmacêuticos são importantes para o tratamento de um amplo espectro de doenças em quase todos os ramos da medicina1. Os anticorpos monoclonais (mAbs) dominam o mercado biofarmacêutico, com as vendas mundiais esperadas alcançar quase $110000000000 em 20202. A plataforma de expressão favorecida para mAbs são as linhagens de células de ovário de hamster chinês, que tipicamente produzem altos títulos de MAB de até 10 g ∙ L-1 no sobrenadante de cultura3,4. No entanto, a produção de mAbs em culturas de células de mamíferos é dispendiosa devido ao alto custo do meio e à necessidade de fermentação estéril5. As plataformas de expressão alternativa, como as plantas, potencialmente oferecem uma abordagem mais rápida, simples, menos dispendiosa e mais escalável para a manufatura industrial6,7.
Além dos custos associados às culturas de células de mamíferos, o uso generalizado de cromatografia de afinidade protein A para captação de produtos é um importante condutor de custos para a produção industrial de mAbs. A proteína a é encontrada naturalmente na superfície de pilhas de Staphylococcus aureus e liga-se à região cristalizável do fragmento (FC) de determinados anticorpos murino e humanos, agindo desse modo como um mecanismo da defesa para evadir o sistema imune humoral8. A proteína A tornou-se o padrão de ouro da indústria para a captura de mAbs de sobrenadantes de cultura celular e também é amplamente utilizado pela comunidade de pesquisa porque é altamente seletivo, tipicamente conseguindo puridades de mAb de ~ 95% em um único passo8. Sem surpresa, as vendas de proteína A nas últimas duas décadas têm espelhado de perto as vendas de mAbs8. Dependendo da escala de produção, os custos da proteína a podem corresponder a mais de 25% dos custos totais do processo e, assim, afetam o preço de mercado dos mAbs terapêuticos, que podem ser até $2000 g-15,6. Portanto, resinas de cromatografia alternativa com um desempenho de purificação semelhante têm o potencial de reduzir substancialmente os custos de produção, tornando as terapias baseadas em anticorpos acessíveis para um maior número de pacientes10,11 ,12. Tais alternativas também podem contornar as desvantagens da cromatografia de proteína A, incluindo as condições de eluição duras em pH baixo (tipicamente < 3,5) que podem potencialmente causar mAbs a sofrer alterações conformacionais que promovem a agregação13 . Importante, a proteína A é seletiva somente para a região de FC de determinadas subclasses de IgG, assim que as moléculas não-funcionais com domínios de ligação truncados podem co-purify com o produto intacto5, visto que Derivaties do MAB tais como fragmentos da variável da único-cadeia Não se ligam à proteína A.
Aqui, nós descrevemos uma resina alternativa da cromatografia da afinidade para a captação do MAB 2f5 de neutralização do HIV usando seu epítopo mapeado linear eldkwa (um código do ácido aminado da letra)5,14. Nós fundimos genetically o epítopo 2f5 ao C-Terminus da proteína fluorescente dsred, que funcionou como uma molécula do portador e do repórter, e produziu a proteína resultante Dsred-2F5-Epitope (DfE) no tabaco transgênicas ( Tabacum de Nicotiana) plantas. A DFE foi purificada por cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados de passo único (IMAC). A imobilização do ligante purified da afinidade de DFE em uma resina Cross-linked do agarose foi conseguida pelo acoplamento químico usando colunas Cross-linked do Agarose do N-Hydroxysuccinimide (NHS)-lig. Os experimentos estatísticos experimentais foram utilizados para otimizar o procedimento de imobilização e a eficiência de acoplamento15. A estratégia de purificação para o MAB 2f5 foi avaliada em termos de pureza do anticorpo, rendimento e estabilidade do ligante. Em contraste com a proteína A, que liga a região FC, DFE vinculado à região de determinação de complementaridade de 2F5, assegurando a purificação de moléculas com um paratope intacto. Nosso conceito pode facilmente ser adaptado a todo o MAB com um epítopo linear ou a outros ligantes peptide-baseados da afinidade que podem facilmente ser identificados por estudos do microarray16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Figura 1: esquema de fluxo do processo para a preparação de resinas de afinidade epítopo mapeado que podem ser utilizadas para a captação de mAbs de extratos de plantas brutas ou sobrenadantes de cultura celular. (A) o ligante de afinidade DFE foi expressado em plantas de tabaco transgénicas. Uma etapa de precipitação do calor (B) foi incluída antes que as folhas colhidas fossem homogeneizadas (C). (D) o extrato de planta bruta foi esclarecido por filtração de saco, filtração de profundidade e filtração estéril de 0,2 μm. (E) o DFE foi então purificado pelo iMac. (F, G) O ligante purified da afinidade de DFE foi imobilizado em colunas de agarose reticuladas EDC/NHS-ativadas. (H) culturas bacterianas portadoras de anticorpos de codificação T-DNA 2f5 foram utilizadas para expressão transitória em plantas de N. javanica (I) cultivadas em fitontron. (J) as folhas de N. javanica foram colhidas e processadas conforme descrito em D. (K) Mab 2f5 foi purificada a partir do extrato esclarecido utilizando as colunas de afinidade DFE (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

A purificação de anticorpos monoclonais (mAbs) é comumente alcançada por cromatografia de afinidade protein A, que pode ser responsável por até 25% dos custos gerais do processo. As etapas de captura alternativas e rentáveis são, portanto, valiosas para a produção em escala industrial, onde são produzidas grandes quantidades de um mAb único. Aqui nós apresentamos um método para a imobilização de um ligante dsred-baseado do epítopo mapeado a uma resina Cross-linked do agarose permitindo a captação seletiva do anticorpo 2f5 do HIV-neutralizing dos extratos crus da planta sem usar a proteína a. O epítopo linear ELDKWA foi primeiramente fundido geneticamente para a proteína fluorescente DsRed e a proteína de fusão foi expressa em plantas de tabaco transgênica (Nicotiana tabacum) antes da purificação por cromatografia de afinidade de íons metálicos imobilizados. Além disso, um método baseado no agarose reticulado ativado foi otimizado para alta densidade de ligantes, acoplamento eficiente e baixos custos. O pH e a composição tampão e a concentração de ligante solúvel foram os parâmetros mais importantes durante o procedimento de acoplamento, o que foi melhorado usando uma abordagem de design de experimentos. A resina de afinidade resultante foi testada por sua capacidade de ligar seletivamente o mAb alvo em um extrato de planta bruta e o tampão de eluição foi otimizado para alta recuperação de mAb, atividade do produto e estabilidade da resina de afinidade. O método pode ser facilmente adaptado a outros anticorpos com epítopos lineares. As novas resinas permitem condições de eluição mais suaves do que a proteína A e também podem reduzir os custos de uma etapa de captura inicial para a produção de mAb.

Expressão e purificação do ligante da afinidade
A proteína de fusão DFE foi expressa em plantas de tabaco transgênicas cultivadas em estufa. O rendimento foi de ~ 120 mg · kg-1 massa foliar com uma biomassa média de ~ 130 g por planta. A pureza da DFE foi de < 5% de TSP em extratos de plantas brutas antes do branqueamento, mas aumentou para ~ 40% após o tratamento térmico a 70 ° c por 1,5 min, que precipitou > 97% das proteínas da célula hospedeira. A etapa de branqueamento foi facilmente integrada na rotina de colheita e extração (Figura 1) e demorou menos de 2 h de tempo extra, incluindo a criação do banho de água. A recuperação total do DFE foi de 23,5 mg kg1 com uma pureza de > 90%. As etapas responsáveis pela perda do produto foram branqueamento, filtração de profundidade e IMAC, com perdas específicas de 40%, 27% e 45%, respectivamente. A capacidade do filtro de profundidade foi, em média, 135 ± 36 L m-2 (± DP, n = 3) e, portanto, na faixa superior de valores relatados na literatura21. O rendimento de DFE aumentou com a idade da planta (Figura 2).
Imobilização da ligadura de afinidade em colunas de cromatografia ativadas pelo NHS
Durante os testes iniciais de acoplamento, verificou-se que o tampão HEPES (pH 8,3) aumentou a eficiência de acoplamento para 89 ± 6% (± DP, n = 3) em comparação com 78 ± 9% (± DP, n = 3) para o tampão de bicarbonato recomendado pelo fabricante. Conseqüentemente, HEPES foi usado para todos os experimentos subseqüentes do acoplamento. Uma aproximação da DoE foi selecionada para aperfeiçoar a eficiência do acoplamento de DFE à resina Cross-linked NHS-ativada do agarose. A quantidade absoluta de DFE imobilizou na resina aumentada com a massa de DFE injetada na coluna e plateaued em ~ 15 g · L-1 Considerando que o rendimento do acoplamento diminuiu continuamente à medida que mais DFE foi injetado (Figura 2). O rendimento de acoplamento também foi > 50% menor em um tampão ácido, indicando a necessidade de se procurar condições de acoplamento adequadas para cada ligantes caso a caso. As condições ideais em termos de rendimento de acoplamento, quantidade absoluta de DFE imobilizada e custos de coluna foram identificadas usando a ferramenta de otimização numérica do software DoE. As condições mais desejáveis (pH 9,0 e 7,0 mg de DFE por 1 mL de resina de agarose reticulada) foram localizadas em um grande planalto e, portanto, robustas. As moléculas de DFE mantiveram sua fluorescência vermelha mesmo após o acoplamento, e a intensidade da cor correspondeu à quantidade total de DFE imobilizada (Figura 2). Portanto, a cor da coluna pode ser usada como um parâmetro de controle de qualidade simples para estimar a eficiência de acoplamento e a qualidade da coluna. A fluorescência igualmente confirmou que a proteína de fusão de DFE montou no estado tetramérica de dsred nativo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Figura 2: otimização da imobilização da DFE para a resina de agarose reticulada ativada pelo NHS. (A) gel de LDS-PAA com a sobreposição ocidental do borrão de amostras do homogeneate e da eluição dos extratos transgênicas bucho e descascados da planta de DFE. A colheita das plantas foi realizada 38, 45 ou 52 dias após a semeadura. Os borrões ocidentais foram executados usando um anti-his6-anticorpos5. (B) quantidade total de ligantes da afinidade de DFE acoplada na dependência se o pH do acoplamento e a massa total de DFE purified injetaram em colunas Cross-linked ativadas NHS do agarose. Os pontos vermelhos indicam os experimentos reais realizados para construir o modelo de superfície de resposta. (C) colunas de afinidade DFE após o procedimento de acoplamento. Os números correspondem às condições de acoplamento destacadas no painel B. DPS = dias após a semeadura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Testando o isolamento de 2F5 usando a resina de afinidade DFE
O anticorpo de recombinação 2f5 foi produzido transientemente em plantas de Nicotiana javanica cultivadas em um fitontron5. A captura de 2F5 do extrato de planta bruta foi testada usando colunas de afinidade acopladas com ~ 7,0 mg de DFE purificada (etapa 6). A eluição das resinas protein A geralmente envolve um tampão ácido (pH ~ 3,3)13. Conseqüentemente, nós avaliamos inicialmente os bufferes diferentes da eluição do baixo-pH (pH 6.0 – 3.25) para as colunas de DFE. A eluição de 2F5 foi bem-sucedida em valores de pH abaixo de 4,5 com a maior recuperação de ~ 35% em pH 3,25. Entretanto, a eluição do baixo-pH inativou o anticorpo (como confirmado pela espectrometria de SPR) e o ligante de DfE (como indicado pela perda de cor e pelo DBC mais baixo, Figura 3). O último foi antecipado dado que as desnatura nativas de dsred em pH < 4.022,23. Para evitar a desnaturação de produtos e ligantes, testamos o cloreto de magnésio como um agente de eluição alternativo, pois já foi usado para eluir mAbs de outras resinas de afinidade24. A concentração de cloreto de magnésio de 1,25 M foi suficiente para eluir 2f5 da resina de afinidade DFE com uma recuperação de 105 ± 11% (± DP, n = 3) e uma pureza de 97 ± 3% (± DP, n = 3). Esse desempenho foi comparável às resinas de proteína a25,26. A constante do dissociação do equilíbrio (KD) do anticorpo DFE-purified 2f5 e do ligante sintético fuzeon era 791 PM visto que que de uma contraparte proteína a-purified era 763 PM5. Além disso, nenhuma perda substancial da cor foi observada na resina sobre um total de 25 ciclos do ligamento-e-elute. O DBC da resina da afinidade de DFE no avanço de 10% 2F5 declinou linearmente sobre o curso de 25 ciclos a ~ 15% do valor inicial (Figura 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Figura 3: testando o isolamento de 2F5 de extratos de plantas esclarecidos usando as resinas de afinidade DFE. (A) resinas de afinidade DFE após um ciclo de eluição usando buffers com diferentes valores de pH na faixa de 4,0 – 3,0 e as mesmas resinas após uma etapa de neutralização em pH 6,0. (B) resinas de afinidade DFE após um e seis ciclos de purificação de 2f5 usando 1,25 m ou 4, 0 m de cloreto de magnésio como eluente. (C) cromatogramas de experimentos de carregamento frontal (curvas de ruptura) para determinar a capacidade de ligação dinâmica dependente do ciclo da resina DFE usando cloreto de magnésio como eluente. As curvas de ruptura foram medidas para os buffers de eluição de cloreto de magnésio 4,0 M e 1,25 M e vários números de ciclo. (D) capacidade de ligação dinâmica dependente do ciclo de DFE utilizando cloreto de magnésio 1,25 M como eluente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Neste procedimento, um ligante de epítopo baseado em DsRed é imobilizado para produzir uma resina de afinidade altamente seletiva para a captação de anticorpos monoclonais de extratos de plantas brutas ou sobrenadantes de cultura celular, como uma alternativa à proteína A.

Agarose reticulada ativada para o rápido desenvolvimento de resinas de cromatografia de afinidade-captura de anticorpos como um estudo de caso

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Anticorpos monoclonais dominam o mercado biofarmacêutico e são tipicamente purificados pela cromatografia proteica A. A resina de segundo tempo é um grande driver de custo durante a produção, afetando o preço da terapêutica baseada em anticorpos. Aqui descrevemos um novo ligante de afinidade baseado na proteína fluorescente que é lida como um portador do epítope linear do anticorpo neutralizante do HIV 2F5.Em geral, nosso método permite a rápida geração de resinas de cromatografia de afinidade que podem ser usadas para a captura de anticorpos monoclonais. Demonstramos essa capacidade capturando anticorpos 2F5 do extrato de planta bruta. Otimizamos as condições de captura e o buffer de solução, a fim de melhorar a capacidade dinâmica de ligação e a reutilização da resina.Nossa resina permite condições geralmente mais frouxas do que a Proteína A e tem o potencial de reduzir os custos de purificação de anticorpos monoclonais. Além disso, a resina pode ser facilmente adaptada a outros anticorpos que se ligam a epítopos lineares. Para iniciar este procedimento, ajuste a concentração da solução de ligante de afinidade preparada de modo que esteja na faixa de 5 a 15 gramas por litro, conforme definido pelo desenho dos experimentos.Armazene a solução no gelo até que a reação de acoplamento esteja pronta. Em seguida, encha uma seringa de dois mililitros com a solução DFE. E prepare um adaptador para montar as seringas nas colunas de agarose ativadas pelo NHS com um volume de cama de um mililitro.Para cada 10 colunas utilizadas para acoplamento, prepare 30 mililitros de solução de desativação, 30 mililitros de solução de pH baixo e um mililitro de solução de armazenamento. Em seguida, prepare 20 mililitros de um ácido clorídrico mililitro em um tubo. E incubar no gelo por pelo menos 20 minutos.Prepare uma balança de precisão para monitorar o fluxo através de frações para todas as etapas durante a reação de acoplamento. Depois disso, abra uma coluna de agarose cruzada ativada pelo NHS. Aplique uma gota de tampão na entrada do adaptador, para evitar que o ar entre na coluna.Monte o adaptador de seringa na entrada da coluna. Lave a coluna com seis mililitros de gelo frio um ácido clorídrico mililitro, a uma taxa de fluxo menor que um mililitro por minuto. Usando uma seringa de dois mililitros, injete imediatamente 1,5 mililitros de solução DFE a uma taxa de fluxo inferior a um mililitro por minuto.E coletar o fluxo através de fração em uma escala de precisão para análise subsequente. Sele a coluna em ambas as extremidades e incubar por 15 a 45 minutos, a 22 graus Celsius. Em seguida, injete seis mililitros da solução de ativação, seguidos por seis mililitros de solução de pH baixo, a uma taxa de fluxo inferior a um mililitro por minuto, remova ligantes não covalentemente ligados da resina.Injete seis mililitros da solução de ativação e incubar a coluna por 15 minutos. Depois disso, injete seis mililitros de solução de pH baixa na coluna. Seguido por seis mililitros da solução de ativação.Em seguida, injete outros seis mililitros de solução de pH baixo na coluna. Injete dois mililitros de solução de armazenamento na coluna e armazene-a a quatro graus Celsius. Primeiro prepare 100 mililitros do extrato da planta clarificada contendo 2F5, ou o sobrenante para o sistema de expressão baseado em células preferida, que também contém 2F5.Em seguida, prepare o buffer de equilíbrio, e o buffer de ilusão de força X de alta altura, conforme descrito no protocolo de texto. Lave o sistema de cromatografia com os tampões. Monte uma coluna de afinidade DFE no sistema de cromatografia.E equilibre-se com cinco CV de tampão de equilíbrio, a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Monitore a absorvância UV a 280 nanômetros. Em seguida, carregue 80 mililitros do extrato da planta clarificado, ou o sobrenante na coluna a uma taxa de fluxo de 5 mililitros por minuto.Para garantir um tempo de contato de dois minutos. Colete o fluxo através de amostras em duas frações mililitros ou reconstrução de curva inovadora. Armazene o fluxo através de amostras a quatro graus Celsius, se a análise amostral imediata não for possível.Depois desta lavagem a coluna com 6CV de tampão de equilíbrio. Colete uma amostra no início, meio e fim da lavagem. Diluir o MAB2F5 com cinco volumes de tampão de ilusão de alta resistência iônica.Colete a fração DFE quando o sinal UV a 280 nanômetros tiver aumentado para cinco mili milimétricos de absorção acima da linha de base. Otimize o tampão de ilusão para cada par de anticorpos epitope- anticorpos, conforme descrito no protocolo de texto. A proteína de fusão DFE é expressa em plantas de tabaco transgênicas, cultivadas em uma estufa.A recuperação global do DFE é de 23,5 miligramas por quilograma. Com uma pureza de mais de 90% A quantidade absoluta de DFE imobilizada na resina aumenta com a massa de DFE injetada na coluna, e planaltos em torno de 15 gramas por litro, enquanto o rendimento do acoplamento diminui continuamente à medida que mais DFE é injetado. As moléculas dfe são vistas para manter sua florescência vermelha, mesmo após o acoplamento.A intensidade da cor corresponde à quantidade total de DFE imobilizado. Portanto, a cor da coluna pode ser usada como um simples parâmetro de controle de qualidade para estimar a eficiência do acoplamento e a qualidade da coluna. O anticorpo 2F5 recombinante é produzido transitoriamente em plantas nicotiana benthamiana cultivadas em um fitotrono.A captura de 2F5 do extrato da planta bruta, é testada usando colunas de afinidade, juntamente com aproximadamente sete miligramas de DFE purificado. Uma concentração de cloreto de magnésio de 1,25 molar é suficiente para elute 2F5 da resina de afinidade DFE com uma recuperação próxima de 100% e uma pureza de aproximadamente 97%, o que é comparável às resinas da proteína A. O DBC da resina de afinidade DFE a 10%2F5 avanço, diminui linearmente ao longo dos 25 ciclos, para cerca de 15% do valor inicial.Usamos um desenho de abordagem de experimentos para otimizar a capacidade de acoplamento do nosso ligante de afinidade. Essas condições podem ser afinadas para outros ligantes no futuro. Nosso método usa proteína florescente para roscar uma proteína sub-portadora para o ligante específico do produto.Ao mesmo tempo, basta adicionar funções como um indicador de qualidade visual do procedimento de mobilização, fornecendo um feedback imediato e intuitivo ao operador.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Uma abordagem fácil e eficiente para a produção de micelas reversível Disulfide Cross-linked

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Um método baseado na filtração de preparação de núcleos de alta qualidade a partir de músculo esquelético reticulado para imunoprecipitação com cromatina

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop imobilizada cromatografia de afinidade Metal, reconstituição e ensaio de um Polyhistidine Tagged Metalloenzyme para o laboratório de graduação

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Determinação rápida da afinidade anticorpo-antígeno por fotometria em massa

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Desenvolvimento de uma tira imunocromatográfica de fluxo lateral para detecção rápida e quantitativa de compostos de pequenas moléculas

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...