Name: activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study
Uploaded: 2019-08-16T13:30:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Мы хотели бы отметить Ибрагима аль-Ареди за выращивание трансгенных табачных растений и д-ра Томаса Радемахера за обеспечение вектора экспрессии табака. Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Ричарда М. Тваймана за редакционную помощь и Маркуса Сака за плодотворные дискуссии о структуре лиганды сродства DFE. Эта работа была частично профинансирована Внутренними программами Фраунхофера-Гезельшафта в рамках ГрантА No. Привлечь 125-600164 и штат Северный Рейн-Вестфалия в рамках гранта Leistungszentrum No 423 "Сетевое, адаптивное производство". Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках научно-исследовательской учебной группы "Tumor-targeted Доставка наркотиков" грант 331065168. GE здравоохранения поддержали публикацию открытой доступности этой статьи.

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Биофармацевтические препараты имеют важное значение для лечения широкогоспектра заболеваний почти в каждой отрасли медицины 1. Моноклональные антитела (mAbs) доминируют на биофармацевтическом рынке, а мировые продажи, как ожидается, достигнут почти 110 миллиардов евро в 2020 году2. Излюбленным выражением платформы для mAbs являются китайские линии яичников хомяка, которые обычно производят высокие мАб титеры до 10 г-ле-1 в культуре supernatant3,4. Тем не менее, производство mAbs в культурах клеток млекопитающих стоит дорого из-за высокой стоимости среды и необходимости стерильного брожения5. Альтернативные платформы выражения, такие как заводы потенциально предлагают более быстрый,простой, менее дорогой и более масштабируемый подход для промышленного производства 6,7.
В дополнение к затратам, связанным с культурами клеток млекопитающих, широкое использование хроматографии сродства белка А для сбора продукта является основным фактором затрат для промышленного производства mAbs. Белок А, естественно, находится на поверхности клеток золотистого стафилококка и связывается с кристаллизованной (Fc) областью определенных муриновых и человеческих антител, тем самым действуя в качестве защитного механизма, чтобы избежать гуморальной иммунной системы8. Белок А стал золотым стандартом промышленности для захвата mAbs из клеточной культуры supernatants, а также широко используется научно-исследовательским сообществом, потому что это очень избирательно, как правило, достижения mAb чистоты в размере 95% в один шаг8. Неудивительно, что продажи белка А за последние два десятилетия тесно отражают продажи mAbs8. В зависимости от производственной шкалы, затраты на белок А могут составить более 25% от общих затрат на процесс и тем самым повлиять на рыночную цену терапевтических mAbs, которая может составить до 2000 гр-15,9. Таким образом, альтернативные хроматографии с аналогичными показателями очистки имеют потенциал, чтобы существенно сократить производственные затраты, что делает антитела на основе терапии доступны для большего числа пациентов10,11 ,12. Такие альтернативы могут также обойти недостатки хроматографии белка А, в том числе суровые условия elution при низком рН (обычно йlt;3.5), которые потенциально могут привести к изменениям, которые способствуют агрегации13 . Важно отметить, что Белок А селективна только для региона FC некоторых подклассов IgG, поэтому нефункциональные молекулы с усеченными связывающими доменами могут со-очиститься с нетронутым продуктом5, в то время как mAb произвносит такие как одноцепные переменные фрагменты не связываются с протеином А вообще.
Здесь мы описываем альтернативную сродство хроматографии мели исчерпать для захвата ВИЧ-нейтрализующей mAb 2F5 с использованием его линейного эпитопа ELDKWA (одна буква аминокислотного кода)5,14. Мы генетически сплавили эпитоп 2F5 в C-термину флуоресцентного белка DsRed, который функционировал как несущая молекула и репортёр, и произвели полученный белок DsRed-2F5-Epitope (DFE) в трансгенном табаке ( Nicotiana tabacum) растений. DFE очищалась одноступенчатой обездвиженной хроматографией сродства металла иона (IMAC). Иммобилизация очищенной лиги Сродства DFE на перекрестную агарозную осину была достигнута путем химического соединения с использованием N-гидроксисуччинимид (NHS)-активированных кросс-связанных агароузных колонн. Статистические экспериментальные проекты были затем использованы для оптимизации процедуры иммобилизации и связи эффективности15. Стратегия очистки mAb 2F5 была оценена с точки зрения чистоты антител, урожайности и устойчивости лиганда. В отличие от протеина А, который связывает регион Fc, DFE связан с областью комплементарности, определяющей 2F5, обеспечивая очистку молекул нетронутым паратопом. Наша концепция может быть легко адаптирована к любому mAb с линейным эпитопом или к другим лигандам на основе пептида, которые могут быть легко идентифицированы по исследованиям microarray16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема потока процесса для подготовки эпитопных сродства сводки сечения сводки, которые могут быть использованы для захвата mAbs из сырой экстрактов растений или клеточной культуры supernatants. (A) Сродство лиганд DFE было выражено в трансгенных табачных растений. Шаг выпадения жары (B) был включен прежде чем собранные листья были однородны (C). (D) Экстракт сырой завода был уточнен путем фильтрации мешка, фильтрации глубины и 0,2 мкм стерильной фильтрации. (E) DFE был очищен IMAC. (F, G) Очищенный Ligand сродства DFE был обездвижен на столбцах агарозы EDC/NHS-активированных перекрестных. (H) Бактериальные культуры, несущие T-ДНК кодирования антитела 2F5 были использованы для преходящее выражение в N. benthamiana растений (I) выросли в фитотроне. (J) N. benthamiana листья были собраны и обработаны, как описано в D. (K) mAb 2F5 был очищен от уточненного экстракта с использованием DFE сродство столбцов (L). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10L/20L Bucket</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100P Portable Turbidimeter</td>
			<td>Hach</td>
			<td>4650000</td>
			<td>Turbidimeter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTApure</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29018226</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 25R</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>369434</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050</td>
			<td>SPR chip coupling kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody 2G12</td>
			<td>Fraunhofer IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standard for SPR quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>800EG</td>
			<td>Blender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BP-410</td>
			<td>Fuhr</td>
			<td>2632410001</td>
			<td>Bag filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CanoScan 5600F</td>
			<td>Canon</td>
			<td>2925B009</td>
			<td>Scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL self-standing</td>
			<td>Labomedic</td>
			<td>1110504</td>
			<td>Reaction tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelating Sepharose FF</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0575-01</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cond 3320</td>
			<td>WTW</td>
			<td>EKA 3338</td>
			<td>Conductometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Design-Expert(R) 8</td>
			<td>Stat-Ease, Inc.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>DoE software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery Compfort</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F81029</td>
			<td>Multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium phosphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4984.3</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diverse bottles</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Glas bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dri Block DB8</td>
			<td>Techne</td>
			<td>Z381373</td>
			<td>Heat block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed</td>
			<td>Fraunhofe IME</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnSpire</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2390-0000</td>
			<td>Plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETHG-912</td>
			<td>Oregon Scientific</td>
			<td>086L001499-230</td>
			<td>Thermometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F9-C</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29027743</td>
			<td>Fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferty 2 Mega</td>
			<td>Kammlott</td>
			<td>5.220072</td>
			<td>Fertilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma -86C ULT freezer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88400</td>
			<td>Freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9105.3</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hettich Centrifuge Mikro 200</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>2400</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 26/10</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>GE17-5087-01</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap NHS-activated Sepharose HP, 1 mL</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17-0716-01</td>
			<td>Chromatography columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>4625.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3899.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K700</td>
			<td>Pall</td>
			<td>5302305</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KM02 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Magnetic stirrer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KS50P 60D</td>
			<td>Pall</td>
			<td>B12486</td>
			<td>Depth filter layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S 24</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>SN-06508-24</td>
			<td>Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lauda E300</td>
			<td>Lauda Dr Wobser GmbH</td>
			<td>Z90010</td>
			<td>Immersion circulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>KK36.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>HV-77921-75</td>
			<td>Peristaltic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16534K</td>
			<td>Filter unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Rapid-Flow PES bottle top filter</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>Vacuum filtration of SPR buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel sulphate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T111.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex NuPAGE 4-12% BisTris LDS gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0336BOX</td>
			<td>LDS-PAA gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex X-cell Mini Cell</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>EI0001</td>
			<td>PAGE chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 20x running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0002</td>
			<td>Buffer concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE antioxidant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td>Antioxidant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler protein ladder (10-180 kDa)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>26616</td>
			<td>Protein standart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perforated bucked</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH 3110</td>
			<td>WTW</td>
			<td>2AA110</td>
			<td>PH meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac HC</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1645052</td>
			<td>Electrophoresis module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A from Staphylococcus aureus</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7837-5MG</td>
			<td>Coating of SPR chips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 fine, cross linked dextran</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>17003301</td>
			<td>Chromatography resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone spoon</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Spoon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simply Blue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>Gel staining solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6773.1</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>X891.1</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2002-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>P029.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>HN13.2</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bisulfite</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>243973-100G</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosophate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>T877.2</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR Affinity Sensor - High Capacity Amine</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>SPR-AS-HCA</td>
			<td>SPR chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR-2/4 Surface Plasmon Resonance Analyzer</td>
			<td>Sierra Sensors GmbH/Bruker Daltonics</td>
			<td>n/a</td>
			<td>SPR device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSM3</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>10034264</td>
			<td>Mini Gyro-rocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated vessel, 20 L</td>
			<td>Clatronic</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Blanching chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringes, 2 mL</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4606027V</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe adpter (Union Luer F)</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>181112-51</td>
			<td>Syringe adapter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE6101</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>TE6101</td>
			<td>Precision scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polysorbate)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8170721000</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn 6.4</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>29056102</td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum bags</td>
			<td>Ikea</td>
			<td>203.392.84</td>
			<td>Plant storge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VelaPad 60</td>
			<td>Pall</td>
			<td>VP60G03KNH4</td>
			<td>Filter housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Vortex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XK-26/20 column housing</td>
			<td>GE Helthcare</td>
			<td>28-9889-48</td>
			<td>Chromtography column</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activated cross-linked agarose for the rapid development of affinity chromatography resins - antibody capture as a case study

Очистка моноклональных антител (mAbs) обычно достигается протеиновой хроматографией сродства, которая может составлять до 25% от общих затрат процесса. Таким образом, альтернативные, экономически эффективные шаги по улавливанию имеют важное значение для промышленного производства, где производится большое количество одного мАб. Здесь мы представляем метод иммобилизации лиганда на основе DsRed на основе эпитопа в перекрестную агарозную смолу, позволяющую селективное улавливание НЕйтрализующих ВИЧ антител 2F5 из сырых растительных экстрактов без использования белка А. Линейный эпитоп ELDKWA был впервые генетически слиты с флуоресцентным белком DsRed и синтез белка была выражена в трансгенных табака(Nicotiana tabacum) растений до очистки с помощью обездвиженного металла ионсроды хроматографии. Кроме того, метод, основанный на активированной перекрестной агарозе, был оптимизирован для высокой плотности лиганда, эффективного соединения и низких затрат. Состав рН и буфера и концентрация растворимых лиганд были наиболее важными параметрами во время процедуры соединения, которая была улучшена с помощью подхода, предусматривающего проектирование экспериментов. В результате сродство сродни была проверена на его способность избирательно связывать целевой mAb в сырой экстракт завода и elution буфер был оптимизирован для высокого восстановления mAb, активность продукта и сродни сродни устойчивости. Метод можно легко адаптировать к другим антителам с линейными эпитопами. Новые резолю позволяют более мягкие условия elution чем протеин a и смогли также уменьшить цены первоначально шага захвата для продукции mAb.

Выражение и очищение лигании сродства
Термоядерный белок DFE был выражен в трансгенных табачных растениях, выращенных в теплице. Урожайность составила 120 мг кг-1 листовая масса со средней биомассой 130 г на растение. Чистота DFE была йт;5% TSP в экстрактах сырой растений до бланширования, но увеличилась до 40% после тепловой обработки при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 1,5 мин, что осаждали йgt;97% белков клеток-хозяев. Шаг бланширования был легко интегрирован в уборку и добычу рутины(рисунок 1) и занимает менее 2 ч дополнительного времени, в том числе создание водяной бани. Общее восстановление DFE было 23,5 мг кг1 с чистотой Шагами, ответственными за потерю продукта, были бланширование, фильтрация глубины и IMAC, с конкретными потерями 40%, 27% и 45%, соответственно. Емкость фильтра глубины была в среднем 135 и 36 лм -2 (SD, n'3) и, таким образом, в верхнем диапазоне значений, о которых сообщается в литературе21. Урожайность DFE увеличилась с возрастом растений(рисунок 2).
Иммобилизация лиганд сродства на столбцах хроматографии, активированной ГСЗ
Во время первоначальных испытаний соединения, мы обнаружили, что буфер HEPES (pH 8.3) увеличил эффективность соединения до 89 и 6% (SD, n'3) по сравнению с 78 и 9% (SD, n'3) для буфера бикарбоната, рекомендованных производителем. Таким образом, HEPES использовался для всех последующих экспериментов по совмещению. Подход DoE был выбран для оптимизации эффективности связи DFE с активированной NHS кросс-связанной агароузной осиной. Абсолютное количество DFE обездвиженных на мисиной увеличивается с массой DFE вводят в колонку и плато на 15 г L-1 в то время как выход соединения непрерывно снижался, как больше DFE был введен(Рисунок 2). Соединение выход был также йgt;50% ниже в кислых буфера, что свидетельствует о необходимости проверки для подходящих условий соединения для каждого лиганд на индивидуальной основе. С помощью цифрового инструмента оптимизации программного обеспечения DoE были определены идеальные условия с точки зрения доходности сцепления, абсолютного количества обездвиженных DFE и стоимости столбцов. Наиболее желательные условия (pH 9.0 и 7.0 мг DFE на 1 мл перекрестной агарозной оси) были расположены на большом плато и поэтому были надежными. Молекулы DFE сохранили свою красную флуоресценцию даже после соединения, а интенсивность цвета соответствовала общему количеству обездвиженных DFE (Рисунок 2). Таким образом, цвет столбцов может быть использован в качестве простого параметра контроля качества для оценки эффективности соединения и качества столбца. Флуоресценция также подтвердила, что белок синтеза DFE, собранный в тетрамерном состоянии родного DsRed.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig02.jpg"> Рисунок 2: Оптимизация симмобилизации DFE к NHS-активированной перекрестно-связанной агарозной осине. (A) Гель LDS-PAA с западным наложением помарка гомената и элютификации образцов из небланшированных и бланшированных трансгенных экстрактов растений DFE. Урожай растений был выполнен через 38, 45 или 52 дня после посева. Западные помарки выполнялись сиспользованием анти-Его 6-антител5. (B) Общее количество соединенных DFE сродство лиганд в зависимости, если соединение рН и общая масса очищенных DFE вводят на ГСЗ-активированный кросс-связанных агароуз столбцов. Красные точки указывают на фактические эксперименты, выполненные для построения модели поверхности ответа. (C) DFE сродство столбцов после процедуры соединения. Цифры соответствуют условиям соединения, выделенным в панели B. dps и дней после посева. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Тестирование изоляции 2F5 с использованием срододрую сродства DFE
Рекомбинантные антитела 2F5 были временно произведены в растениях Nicotiana benthamiana, выращенных в фитотроне5. Захват 2F5 из экстракта сырой завода был протестирован с использованием столбцов сродства в сочетании с 7,0 мг очищенной DFE (шаг 6). Удаление из протеина а, как правило, включает в себя кислый буфер (pH 3.3)13. Поэтому мы изначально оценивали различные буферы elution с низким рН (pH 6.0-3.25) для столбцов DFE. Elution 2F5 был успешным при значениях pH ниже 4,5 с самым высоким восстановлением 35% при рН 3,25. Тем не менее, низкор-рН elution инактивировал оба антитела (как подтверждено sPR спектрометрии) и DFE лиганд (как указано на потерю цвета и нижней DBC, Рисунок 3). Последний был ожидаем, учитывая, что родной DsRed денатурации на рН злт;4.022,23. Чтобы избежать денатурации продукта и лиганда, мы протестировали хлорид магния в качестве альтернативного агента elution, потому что он ранее использовался для elute mAbs от других сродни сечения сечения ранс24. Концентрация хлорида магния в 1,25 М была достаточна для того, чтобы вылететь из сродни сродни Сродни сагины DFE с восстановлением 105 и 11% (SD, n'3) и чистотой 97 и 3% (SD, n'3). Этот спектакль был сопоставим с протеиной а по шрейн25,26. Равновесие диссоциации постоянной (KD) из DFE очищенных 2F5 антитела и синтетический лиганд Fuzeon был 791 pM в то время как у белка-очищенный аналог был 763 pM5. Кроме того, в драке не наблюдалось существенной потери цвета в течение в общей сложности 25 циклов bind-and-elute. DBC сродства сродности сроды на 10% 2F5 прорыв снизился линейно в течение 25 циклов до 15% от первоначального значения (Рисунок 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59933/59933fig03.jpg"> Рисунок 3: Тестирование изоляции 2F5 от уточненных растительных экстрактов с использованием сродства DFE. (A) DFE сродство сферы сечения семы после одного цикла elution используя буферы с по-разному значениями pH в ряде 4.0-3.0 и такие же resins после шага нейтрализации на pH 6.0. (B) DFE сродство сродни серекции мели после одного и шести циклов 2F5 очистки с использованием 1,25 М или 4,00 М хлорида магния, как eluent. (C) Хроматограммы экспериментов по лобной нагрузке (прорывные кривые) для определения цикло-зависимой динамической связывающей способности рецина DFE с использованием хлорида магния в качестве элуентного. Кривые прорыва были измерены для 4.0 M и 1.25 M буферов элевции хлорида магния и различных чисел цикла. (D) Цикл-зависимая динамическая связывающая способность DFE используя хлорид магния 1.25 M как eluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59933/59933fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study at JoVE.com

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

В этой процедуре, DsRed основе эпитопа лиганд обездвижен для получения весьма селективной смолы сродства для захвата моноклональных антител из сырой растительных экстрактов или клеточной культуры супернатантов, в качестве альтернативы белка А.

Активированный перекрестный связаны Агароуз для быстрого развития аффинити Хроматография resins - Захват антител как пример

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Моноклональные антитела доминируют на биофармацевтическом рынке и, как правило, очищаются хроматографией белка А. Согласно смолы является одним из основных драйверов затрат во время производства, влияющих на цену антител на основе терапии. Здесь мы описываем новый лиганд сродства на основе флуоресцентного белка, который читается как носитель линейного эпитопа нейтрализующих антитела 2F5.В целом наш метод позволяет быстрое поколение сродства хроматографических смол, которые могут быть использованы для захвата моноклональных антител. Мы продемонстрировали эту способность, захватив антитела 2F5 из экстракта сырого растения. Мы оптимизировали условия захвата и буфер раствора для улучшения динамической емкости связывания и повторного использования смолы.Наша смола позволяет, как правило, слабее условия, чем белок А и имеет потенциал, чтобы уменьшить затраты на очистку моноклональных антител. Кроме того, смола может быть легко адаптирована к другим антителам, которые связываются с линейными эпитопами. Чтобы начать эту процедуру, отрегулируйте концентрацию подготовленного раствора лиганда сродства так, чтобы он был в диапазоне от 5 до 15 граммов на литр, как это определено конструкцией экспериментов.Храните раствор на льду до тех пор, пока не будет готова реакция соединения. Затем заполните один двухми миллилитровый шприц раствором DFE. И подготовить адаптер для установки шприцев на NHS-активированных перекрестных столбцов агарозы с объемом кровати одного миллилитра.На каждые 10 столбцов, используемых для соединения, приготовьте 30 миллилитров раствора деактивации, 30 миллилитров раствора низкого рН и один миллилитр раствора для хранения. Затем приготовьте 20 миллилитров одной миллимолярной соляной кислоты в трубке. И инкубировать его на льду, по крайней мере 20 минут.Подготовьте точность шкалы для мониторинга потока через фракции для всех шагов во время реакции соединения. После этого откройте запечатанную колонку агарозы, активированную ГСЗ. Нанесите каплю буфера на вход адаптера, чтобы предотвратить проникновение воздуха в столбец.Намонтировать адаптер шприца на входе колонки. Вымойте колонку шестью миллилитров ледяной одной миллимолярной соляной кислоты, при скорости потока меньше, чем один миллилитр в минуту. Используя двухми миллилитровый шприц, немедленно ввимите 1,5 миллилитров раствора DFE со скоростью потока менее одного миллилитра в минуту.И собирать поток через фракцию по точной шкале для последующего анализа. Печать колонны на обоих концах и инкубировать в течение 15 до 45 минут, при 22 градусах по Цельсию. Далее вводят шесть миллилитров раствора активации, за которыми следуют шесть миллилитров раствора низкого рН, при скорости потока менее одного миллилитра в минуту, удаляем из смолы нековалентно связанные лиганды.Ввесите шесть миллилитров раствора активации и инкубировать столбец в течение 15 минут. После этого ввилите в колонку шесть миллилитров раствора низкого рН. Затем шесть миллилитров раствора активации.Затем ввимит в колонку еще шесть миллилитров раствора низкого рН. Ввеси два миллилитров раствора для хранения в колонку и храните его при четырех градусах Цельсия. Сначала подготовь 100 миллилитров либо очищенного растительного экстракта, содержащего 2F5, либо супернатанта для предпочтительной клеточной системы выражения, которая также содержит 2F5.Далее подготовьтесь к равновесию буфера и буфера иллюзии высокой прочности железа X, как указано в текстовом протоколе. Промыть хроматографическую систему буферами. Накреню столбец сродства DFE на хроматографической системе.И эквилибрировать с пятью резюме эквилибрации буфера, со скоростью потока один миллилитр в минуту. Мониторинг поглощения УФ на 280 нанометров. Затем загрузите 80 миллилитров либо очищенного растительного экстракта, либо супернатанта на столбец со скоростью потока 5 миллилитров в минуту.Чтобы гарантировать время контакта в две минуты. Соберите поток через образцы в двух миллилитров фракций или прорыв кривой реконструкции. Храните поток через образцы при четырех градусах по Цельсию, если немедленный анализ выборки не возможен.После этого мыть столбец с 6CV эквилибрации буфера. Соберите образец в начале, середине и конце стирки. Разбавить MAB2F5 с пятью томами высокой ионной прочности иллюзионный буфер.Соберите фракцию DFE, когда УФ-сигнал на 280 нанометров увеличился до пяти миллиа абсорбционных единиц выше базового уровня. Оптимизируйте буфер иллюзии для каждой пары эпитоп-антител, как указано в текстовом протоколе. Синтез белка DFE выражается в трансгенных табачных растениях, выращенных в теплице.Общее восстановление DFE составляет 23,5 миллиграмма на килограмм. С чистотой более 90%Абсолютное количество DFE обездвижено на смоле увеличивается с массой DFE вводят в колонку, и плато около 15 граммов на литр, в то время как соединение выход снижается непрерывно, как больше DFE вводится. Молекулы DFE, как видно, сохраняют свою красную флуоресцентность, даже после соединения.Интенсивность цвета соответствует общему количеству обездвижено DFE. Поэтому цвет столбца может быть использован в качестве простого параметра контроля качества для оценки эффективности соединения и качества столбца. Рекомбинантное антитело 2F5 преходяще произведено в заводах benthamiana Nicotiana выращенных в phytotron.Улавливание 2F5 из экстракта сырого растения, проверяется с помощью столбцов сродства, в сочетании с приблизительно семью миллиграммами очищенного DFE. Концентрация хлорида магния 1,25 моляра достаточно, чтобы elute 2F5 из смолы сродства DFE с восстановлением близко к 100% и чистота примерно 97%, что сопоставимо с белка смолы. DBC смолы сродства DFE на 10%2F5 прорыв, снижается линейно в течение 25 циклов, около 15% от первоначального значения.Мы использовали подход к экспериментам для оптимизации емкости соединения нашего лиганда сродства. Эти условия могут быть доработаны для других лигандов в будущем. Наш метод использует флуоресцентный белок, чтобы нить суб-носителя белка для продукта конкретных лиганд.В то же время просто добавьте функции в качестве визуального индикатора качества мобилизационной процедуры, обеспечивая немедленную и интуитивную обратную связь с оператором.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Легким и эффективным подходом к производству Реверсивный дисульфид поперечно-сшитого мицелл

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Метод на основе фильтрации на основе высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы для иммунопреципитации хроматина

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop иммобилизованных металла аффинной хроматографии, воссоздание и меткой, Assay Polyhistidine Metalloenzyme для студентов лаборатории

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Быстрое определение антител-антигена Аффинити по массовой фотометрии

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Бесклеточная продукция протеолипосом для функционального анализа и разработки антител, нацеленных на мембранные белки

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Development of a Lateral Flow Immunochromatographic Strip for Rapid and Quantitative Detection of Small Molecule Compounds

Разработка боковой проточной иммунохроматографической полосы для быстрого и количественного обнаружения маломолекулярных соединений

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...